材料と方法

5.2.1 供試検体

ANMECおよびマーブル動物医療センターから供された雑種ネコおよび

様々な洋品種ネコ150個体の全血由来RNA（cDNA）を用いた。供試されたネ コは、品種に従って雑種群と洋品種群の二つに分類した（Table 1）。具体的に は、87個体の雑種ネコ（Domestic short hair, DSH）は雑種群（DSH group）とし た。また、63個体の洋品種ネコを洋品種群（Purebred group）に分類した。

Table 1に示したように、計11品種を洋品種群に分類した。

5.2.2 アンプリコンシークエンス法によるFLA-DRB多型解析のPCR増幅

計150個体を全4回に分けて、マルチプレックスPCRを行った。この マルチプレックスPCRに用いたプライマーは、第4章と同様に、FLA-DRB多 型解析用プライマーの5`末端に個体識別用のバーコードを付加し、設計され た。

5.2.3 PCR増幅産物の精製および定量

PCR産物の精製およびDNA濃度の定量は第4章と同様の方法で行っ

5.2.5 リード選別およびトリミング

個体毎のfastqファイルからのリード選別およびトリミングは第4章と

同様の方法を用いた。

5.2.6 新規FLA-DRBアレルの同定

選別およびトリミング後のリードを用いた新規FLA-DRBアレルの同定 は、第4章と同様の方法を用いた。

5.2.7 配列の相同性検索と分子系統解析によるFLA-DRBアレルの分類

塩基配列および推定アミノ酸配列の相同性検索および分子系統解析 は、第4章と同様の方法を用いた。

5.2.8 マッピング解析による各個体のFLA-DRBアレルの同定

マッピング解析は第4章と同様の方法で行い、各個体のFLA-DRBアレ ルを同定した。

5.2.9 FLA-DRBハプロタイプの推定

同定された各個体のFLA-DRB アレルの組み合わせに基づいて、FLA-DRBハプロタイプの推定を行った。具体的には、Figure 1に示すように、ある 特定のハプロタイプ（Hp-A）のホモ接合個体（Cat-1）のアレルの組み合わせ と同一のアレルの組み合わせが、他の個体（Cat-2および-4）にて認められる。

Cat-2および-4に認められるアレルのうちHp-A以外のアレルの組み合わせは、

他のハプロタイプ（Cat-2のHp-BおよびCat-4のHp-C）と推定される。このよ

うに、2個体以上に認められる共通のアレルの組み合わせに基づいて、 FLA-DRBハプロタイプを推定した。加えて、第4章で認められたFLA-DRBハプロ タイプも参照し、各個体のハプロタイプを推定した。

5.2.10 新規FLA-DRBアレルおよびハプロタイプの命名方法

多型解析において同定された新規FLA-DRBアレルは、系統樹の分類、

アミノ酸および塩基配列に従って命名した。具体的には、アレル名のうちアン ダーバー（_）よりも前には、系統樹から分類したDRBの系統名を示した。例 えば、DRB5系統に分類されたDRB5_00101アレルでは、“DRB5”を表記し た。また、アンダーバー（_）より後ろの5桁の数字のうち、前半3桁はアミ ノ酸配列の違いに基づいて通し番号を付した。また、同一アミノ酸に翻訳され るが、異なる塩基配列（同義置換）のアレルが認められた場合、後半2桁は塩 基配列の違いに基づいて通し番号を付した。加えて、推定されたFLA-DRBハ プロタイプは、第4章の命名法に従って、一時的な通し番号を付した。