第１節 研究の目的
第1 章で述べたとおり、Tabebuia avellanedaeの抽出エキスには抗腫瘍効果を 始めとする様々な生理活性を有するが、エキスに含まれる成分のうち、どの化合 物が実際の生理活性を発揮しているのか不明な点が多い。本研究では、Tabebuia
avellanedaeに含まれるNQ801を始めとするフラノナフトキノン類と、臨床段階
のSTAT3阻害剤であるBBI608や、STAT3のSH2ドメインに結合するとされて
いるSTA-21やLLL12との構造類似性に着目し、「Tabebuia avellanedaeに含ま れるナフトキノン類のいくつかは JAK/STAT 経路の阻害活性を有し、抽出エキ スの抗腫瘍効果の一部を担っている」と仮説を立てた。本研究では、Tabebuia
avellanedae に含まれるナフトキノン類のSTAT3リン酸化抑制作用を評価し、さ
らに標的タンパク質の推定のために、JAKのキナーゼ阻害活性、STAT3のSH2 ドメインへの結合の評価ならびに、ドッキングシミュレーションによる標的部 位の推定を行った。SAR (structure activity relationship)解析を行い活性発現に必要 な部分構造を明らかにすることを目的とした。さらには、Tabebuia avellanedaeは ナフトキノン類以外にもリグナンやイリドイド、フェニルプロパノイドなどの 天然物が含まれていることから、それら天然物からの JAK/STAT 阻害活性物質 の探索を行うことを本研究の目的とした。
33 第２節 ウェスタンブロットによる評価
Tabebuia avellanedaeに含まれる代表的なナフトキノンであるNQ801 (8), (S)-8-hydroxy-2-(1-hydroxyethyl)naphtho[2,3-b]furan-4,9-dione (23), lapachol (7), α-lapachone (24), β-α-lapachone (5)およびBBI608 (22)の6化合物(Figure 23)についてウ ェスタンブロットにより STAT3 のリン酸化抑制能の評価を行った。MCF7（乳 がん由来）を用い、無血清培地で24時間培養したのち、評価化合物もしくは溶 媒コントロール(0.1% DMSO)を加え、その1時間後にIL-6(10 ng/mL)で1時間刺 激し、RIPAバッファーを加え可溶化画分を回収してライセート調製をおこなっ た。
Figure 23. Tabebuia avellanedaeに含まれる代表的なナフトキノン
代表的なナフトキノン 6 化合物のウェスタンブロットによる評価結果を
Figure 24に示す。IL-6刺激によりSTAT3のリン酸化の亢進が確認され、既知の
JAK 阻害剤であるバリシチニブにより pSTAT3 の抑制が確認されたことから当 該ウェスタンブロットは評価系として利用可能と判断した。評価した Tabebuia
34
avellanedae由来ナフトキノン6化合物のうち、化合物8, 23, 22にpSTAT3の抑 制作用が認められ、とりわけ22は1 µMでほぼ完全な抑制を示した。一方化合 物7, 24, 5は顕著なpSTAT3の抑制作用は確認されなかった。化合物8, 23, 22は いずれもフラノナフトキノン骨格を有しているのに対し、7, 24, 5はフラン環を 有していないことから、フラノナフトキノン骨格の重要性が示唆された(Figure
25)。一方、STAT3の総量(tSTAT3)に対する顕著な変化は確認されなかった。
Figure 24. MCF7に対するナフトキノン類のpSTAT3の抑制作用
Figure 25. フラノナフトキノン骨格
フラノナフトキノン骨格が pSTAT3 抑制作用に重要であると知見がえられた ことから、次にフラノナフトキノンの 2 位の側鎖の酸化段階ならびに 5 位水酸 基の有無によるpSTAT3抑制作用について評価した。
35
評価実施に際し、2-acetyl-5-hydroxynaphtho[2,3-b]furan-4,9-dione (25)および(S)-2-(1-hydroxyethyl)naphtho[2,3-b]furan-4,9-dione (26)を評価対象化合物として追加し た(Figure 26)。化合物25および26はいずれもTabebuia avellanedaeから単離さ れている天然物である。
Figure 26. 化合物25および26の構造
SARの結果をFigure 27に示す。化合物8, 22, 25および26はいずれも用量依
存的にSTAT3 のリン酸化を抑制した。5 位に水酸基をもたない化合物 22 と26
は、5位に水酸基をもつ8および25と比較して、強いリン酸化抑制作用を示し、
そのIC50値は1 µM以下であった。一方、化合物8と25のSTAT3リン酸化抑制 作用は同程度であり、かつ化合物6と8のリン酸化抑制作用は同程度であった。
2位側鎖の酸化段階（水酸基orケトン）による顕著な違いは認められなかった。
36 Figure 27. 4化合物によるSAR
IL-6刺激下でのMCF7に対してフラノナフトキノン類は用量依存的にSTAT3 のリン酸化抑制作用を認めたことから、次に JAK/STAT 経路が恒常的に活性化 されている乳がん由来細胞のMDA-MB-231を用いて評価を行った。10%ウシ血 清で培養し化合物を 2 時間暴露しライセートを調製しウェスタンブロットを実 施した。化合物8および22は用量依存的にSTAT3のリン酸化を抑制した。
37
Figure 28. MDA-MB-231に対するSTAT3リン酸化抑制作用
Tabebuia avellanedae にはナフトキノン類以外にもリグナン、イリドイド、フ
ェニルプロパノイドなどの天然物が単離されている。Tabebuia avellanedae の抗 腫瘍効果はそれら天然物に基づく可能性も否定できないことから、Tabebuia
avellanedae に含まれる代表的なリグナン 2 化合物 (27, 28)とイリドイド 2 化合
物 (29, 30)についてSTAT3のリン酸化抑制作用について評価を実施した(Figure 29, Figure 30)。
38
Figure 29. リグナン (27, 28)およびイリドイド (29, 30)の構造
Figure 30. リグナン (9, 10)、イリドイド (11, 12)のウェスタンブロット結果
化合物30の10 µMでのみ弱いSTAT3リン酸化抑制作用が確認されたが、顕 著な抑制作用は認められなかった。
39
第３節 WST8 assayによるがん細胞に対する増殖抑制評価
フラノナフトキノン類は STAT3
のリン酸化を抑制したことから、MDA-MB-231, MCF7, A549に対する増殖抑制を検証した。アッセイ系はMTT assayに類似
したWST8 assayを選択した。その理由として、MTT assayと比較して操作が簡
便であること、データのばらつきが少ないとの文献情報があったためである。ウ ェスタンブロットで評価したTabebuia avellanedaeに含まれるナフトキノン8化 合物に対して評価を実施した。化合物処置後72時間培養したのちに吸光度を測 定した。
Table 4 WST8 assayによるがん細胞の増殖抑制評価結果
Compound Growth inhibition (IC50 µM)
MDA-MB-231 MCF7 A549
0.41 0.50 0.13
0.33 1.11 0.28
>30 >30 >30
>30 >30 >30
40
1.39 0.71 1.96
0.25 0.24 0.12
0.17 0.051 0.044
1.59 0.28 0.72
WST8 assayの結果をTable 4に示す。フラノナフトキノン骨格を持たたない7
および24は最大濃度(30 µM)で顕著な増殖抑制を示さなかった。化合物5のIC50
値は0.71~1.96 µMであり、中程度の増殖抑制を示した。一方、フラノナフトキ
ノン骨格を有する化合物8, 23, 22, 25, 26はいずれも強い増殖抑制を示した。化 合物8と25の比較および化合物22と26の比較したところ、2位側鎖がケトン 型である化合物 22 と 25 に強い増殖抑制効果が認められた。ウェスタンブロッ
トによるSTAT3 リン酸化抑制作用では、2位側鎖の酸化段階は顕著な変化を示
さなかったことから、STAT3 のリン酸化抑制作用とがん細胞の増殖抑制作用が 一致しない興味深い結果となった。
41
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 8
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 4 1 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 5
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 1 . 3 9 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 3
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 3 3 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 2
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 2 5 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 7
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 > 3 0 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 5
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 1 7 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 4
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 > 3 0 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 6
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 1 . 5 9 M
Figure 31. MDA-MB-231に対するフラノナフトキノン類の細胞増殖抑制効果
42
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 8
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 5 0 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 5
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 7 1 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 3
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 1 . 1 2 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 2
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 2 4 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 7
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 > 3 0 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 5
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 0 5 1 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 4
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 > 3 0 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 6
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 2 8 M
Figure 32. MCF7に対するフラノナフトキノン類の細胞増殖抑制効果
43
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 8
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 1 3 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 5
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 1 . 9 6 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 3
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 2 8 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 2
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 1 2 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 7
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 > 3 0 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 5
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 0 4 4 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 4
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 > 3 0 M
0 5 0 1 0 0
- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4
C o m p o u n d 2 6
c o n c e n t r a t i o n ( m o l / L )
Intensity(%)
0
I C5 0 = 0 . 7 2 M
Figure 33. A549に対するフラノナフトキノン類の細胞増殖抑制効果
44 第４節 キナーゼアッセイ
Tabebuia avellanedaeに含まれるフラノナフトキノンにSTAT3のリン酸化抑制
作用が認められたことから、標的タンパク質の推定を試みた。第１章で議論した
通り、JAK/STAT経路の阻害活性を有する化合物の標的部位の多くはJAK、もし
くはSTAT3のSH2ドメインである。このことから、Tabebuia avellanedaeに含ま れるフラノナフトキノン類がJAK のキナーゼ活性を阻害するのかを本説で議論 し、第４節では STAT3 の SH2 ドメインへの結合能についての評価結果を述べ る。
JAK のキナーゼ活性阻害評価については、カルナバイオサイエンス株式会社
に委託しMSA (mobility shift assay)を評価法として用いた。アッセイ原理の概略
をFigure 34に示す。
Figure 34. mobility shift assayの概略
キナーゼとは ATP をエネルギー源として基質をリン酸化する酵素である。
JAK/STAT 経路の場合、JAK がキナーゼ、STATs が基質に相当する。今回用い
たMSA では、基質となる STAT3 の部分構造（フラグメント）を蛍光標識をし た組み換えタンパク質をあらかじめ作成しておき、評価したい化合物との共存 下でJAKが介するキナーゼ反応を行った。評価化合物にJAKキナーゼ阻害活性 がある場合は、リン酸化が抑制される。キャピラリー電気泳動により電荷の違い
（リン酸基の有無）で分離し、それぞれのバンドを蛍光検出で定量した。STAT3
45
のリン酸化に関与しているのはJAK1とJAK2であるが、JAK間での選択性確認 のため、JAK1, JAK2に加え、JAK3の評価も併せて行った。
NQ801のJAKキナーゼ阻害活性の結果をFigure 35に示す。NQ801は、JAK1,
JAK2, JAK3に対して顕著な阻害活性を示さなかった。
Figure 35. NQ801のキナーゼ阻害活性
同様にBBI608はJAK1, JAK2, JAK3に対して阻害活性を示さなかった。
Figure 36. BBI608のキナーゼ阻害活性 0
20 40 60 80 100 120
0.1μM 1μM 10μM 100μM
Kinaseactivity(%)
NQ801
JAK1 JAK2 JAK3
0 20 40 60 80 100 120
0.1μM 1μM 10μM 100μM
Kinaseactivity(%)