第1節 緒言
シー クワシ ャー（Ci trus depressa Hayata）は別名 をヒラ ミレ モ ンとも いい，
タ チ バ ナ と 並 ぶ 日 本 カ ン キ ツ の 原 種 の ひ と つ で あ る 7 6 )． 南 西 諸 島 か ら 台 湾 の山地 に分布 し，沖 縄では 大宜味 村や 名 護市屋 部，勝山，伊 豆味な どの本 島 北部地 域で栽 培さ れ ている 特産カ ンキ ツ である．耐寒性 はあ ま り強く ないも のの，乾湿 の変化 や 暑さに 対する 抵抗 力 は 非常 に強 い 7 7 )．果 実の大 きさは 約 3～4 cm， 果重 25 g 前 後であ る．酸 味が 強 く，沖 縄では 古く か ら芭蕉 布の洗 濯に使 われる だけ で なく ，ス ダチや カボ ス のよう に料理 の風 味 付けや 生食と しても 利用さ れる が ，ほとん どは 果汁 飲 料とし て加工 され て いる．シ ークワ シャー は果実 が小 さ く果皮 が薄い とい う 果実特 性に加 えて，耐 病害虫 性に優 れてい るため 農薬 散 布 が少 ないこ とか ら，果実を 丸ごと 搾汁 す る全果 搾汁方 式によ り果汁 加工 さ れてい る．こ のた め，ウンシ ュウミ カン で のチョ ッパー パルパ ー搾汁 方式 の 果汁加 工と比 べ て，果 皮の成 分やパ ルプ な どが果 汁中に 多く含 まれる こと も 特徴の ひとつ であ る ．
近年，シー クワシ ャーの 果実や 葉に ポ リメト キシフ ラボ ン（PMF）であ る nobiletin，tangeretin が他の 香酸カ ンキ ツ 類（果 皮 100 g 中に タ ヒチラ イム 1.6 mg，1.0 mg；スイ ー トレモ ン 0 mg，0 mg；ユ ズ 0 mg，0.2 mg； カラ マンシ ー13.3 mg，7.7 mg） と比べ て，高 濃度 （ シーク ワシャ ー85.2 mg，51.1 mg）
で含ま れるこ とが 明 らかに なって いる 3 0 , 3 1 )．nobiletin はフ ラ ボ ン 骨 格構造 に対し てメト キシ 基 が 6 個 ，tangeretin は 5 個 結合 した 化合 物であ る（ 図 4-1）．nobiletin は，活 性酸素 産生抑 制に よ る酸化 ストレ ス緩 和 作用 7 8 , 7 9 )，マ ウス皮 膚 2 6 ) ，胃 2 7 )や ラット 大腸 2 8 )に おい て 発が ん抑制 作用 を 示すこ と，さ らには シクロ オキ シ ゲナー ゼ誘導 抑制 に よる炎 症抑制 作 用 2 9 )，抗肥 満作用
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nobiletin
tangeretin
sinensetin
図 4-1 ポリ メトキ シフラ ボン類 の化 学 構造 O
OCH3
O H3CO
H3CO
OCH3
H3CO
OCH3
O
OCH
3O H
3CO
OCH
3H
3CO H
3CO
O
OCH
3O H
3CO
H
3CO
H
3CO
OCH
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8 0 )，D-ガラ クトサ ミン 誘発性 肝障害 に対 す る肝保 護作 用 8 1 )，老 化関連 疾患の
原因の ひとつ であ る マトリ ックス メタ ロ プロテ アーゼ 産生 抑 制作用 8 2 , 8 3 )が あり，疾病 の 予防・改 善が 大いに 期待 さ れる成 分であ る．そ の一方 で，需要 の急増 により 需給 バ ランス が崩れ，シー ク ワシャ ーの代 わり に 安価な カラマ ンシー 果汁を 混入 す る原材 料偽装 の問 題 が発生 してい る ．し かしな がら，シ ークワ シャー とカ ラ マンシ ーの果 汁は 類 似した 性状を 呈す る（ 図 4-2）ため ， カ ラ マ ン シ ー 果 汁 が 混 入 し た シ ー ク ワ シ ャ ー 果 汁 を 外 観 の み で の 識 別 は 困 難であ る．
シ ー ク ワ シ ャ ー と カ ラ マ ン シ ー の 識 別 へ 最 も 簡 易 に 適 用 で き る 識 別 法 と しては，官能評 価法 である と考え られ る ．官能評 価とは，人 間の感 覚器官 を 使って 行う検 査で あ り，食品 だけ でな く，幅広い 分野で 用い ら れてい る手法 である ．理化学 機器 の 発展に よって ，成分 の 個別分 析が可 能と な ってい るが，
官能評 価は感 度が 高 く，迅速 であ り，低 コ ストで あるな どの 点 で現在 におい ても， なお品 質評 価 法の主 流であ る．
食品 の分野 で広 く 用いら れてい る官 能 評価と して，3 点識 別 法およ びシェ ッフェ の一対 比較 法 がある ．3 点 識別 法と は，A と B の 2 つの 試料を 比較す るとき に，AAB，ABB のように どち らか 一方を 1 個，他 を 2 個加えた 3 個 を提示 して ，異な る 1 つを判 断す る方法 であ る 8 4 )．また ，シ ェッフ ェの一 対 比較法 とは，対 にし た 2 つ の試料 の官 能（質や強 度）の程 度 を 尺度 化して 評 価する 方法で，試料 の 組み合 わせや 試食 順 序など の影響 を要 因 として 捉える ことが でき る 8 5 )．
その他 の識別 法と し て，対象 食品 に本 来 含まれ ない（ ある い は量比 が異な る）成 分を分 析す る 成分分 析法が ある ．3’, 5’ -di-C-β-glucopyranosylphloretin
（フロ レチン 配糖 体 ）8 6 )（ 図 4-3）はシ ー クワシ ャーに 存在 し ないカ ラマン シー固 有成分 とし て 報告さ れてお り，さ ら に シー クワシ ャー と カラマ ンシー
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図 4-2 シー クワシ ャー果 汁とカ ラマ ン シー果 汁の外 観
左，Citrus depressa Hayata（シーク ワシ ャ ー）果 汁 右，Citrus madurensis Lour.（カラ マン シー ）果汁
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図 4-3 3’, 5’ -di-C-β-glucopyranosylphloretin（フロレ チン 配糖体 ） の化学 構造
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で は ポ リ メ ト キ シ フ ラ ボ ン 類 量 や 香 気 成 分 量 8 7 )に 差 異 が あ る こ と が 知 ら れ ている ．
他方， 食品識 別 の JAS 分析試 験と して遺 伝子の 塩基配 列 の 違 いを 基 にし た遺伝 子組み 換え 食 品検査 の分析 マニ ュ アルが ある 8 8 )．ま た ，2003 年 1 月 には，DNA 品種 識別 技術検 討会に おい て ，DNA 品 種識別 につ いての 技術開 発と利 用のガ イド ラ インが まとめ られ て おり 8 9 )，モ モ，ナシ ，イグサ 等の作 物での 品種識 別 法 と して利 用 が開 始さ れ ，現在で は イネ，イ チゴ，イ ンゲン マメ等 の作物 での 利 用にま で拡大 して い る．
今日で は ，生物 に内 在 する短 い塩基 の繰 り 返し配 列（マイ クロ サ テライ ト）
を検出 する Si mple Sequence Repeat（SSR）法，制 限酵素 処理 に より配 列差を 検出す る Cleaved Amplified Polymorphic Sequence（CAPS）法，一 塩基の 配列 の違い を検出 す る Single Nucleotide Polymorphism（SNP） 法等 が 提案さ れ，
DNA マー カー を用い て，クリ ，ナシ ，リン ゴ，モモ ，オウ トウ ，スモモ ，ウ メ，アン ズ，ビワ，カ ンキツ 類など の主 要 果樹に おいて 品種 識 別が可 能とな ってい る 9 0 )．
開発さ れた DNA 識別 技術は ，一般 には 植 物登録 品種に 対す る 育成者 権の 侵害を 立証す るた め に利用 される こと が 多いが ，新食 糧法 と 改正 JAS 法で 品種の 表示を 義務 付 けられ た米に つい て は，表 示品種 の真 正性 を 評価 するた めに DNA 品種識 別 技 術が利 用され て い る ． 中で も我が 国で 作 付面積 が最も 多 く ， 高 価 格 で 流 通 す る た め に 偽 装 表 示 が 後 を 絶 た な か っ た コ シ ヒ カ リ の DNA 品種識 別 技 術は ，偽装 表示の 抑止 に 貢献し てい る 9 1 )． ま た，米 ，オリ ーブ油，果実，ワイ ン，オレ ンジ ジュー スなど の様々 な食 品 の識別 にポリ メ ラーゼ 連鎖反 応（PCR）法も 用いら れて い る 9 1 - 9 4 )．
そこで 本章で は， 官 能評価 法，成 分分 析 法およ び DNA 識別 法 を用い て，
シーク ワシャ ー果 汁 の真正 性につ いて 検 討した．なお，第 3 章 におい て果汁
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に 含 ま れ る フ ラ ボ ノ イ ド や 香 気 成 分 が 真 正 性 評 価 に 有 用 な 識 別 因 子 で あ る ことが 判明し たた め，ポリメ トシキ フラ ボ ン類お よび香 気成 分 の 判別 因子と しての 適用可 能性 に ついて も検討 を加 え た．
第2節 実験材料および方法
第1項 実験材料 1．試料
試 料 は 日 本 と 台 湾 の 企 業 か ら 入 手 し た 工 業 的 に ベ ル ト プ レ ス 搾 汁 さ れ た シーク ワシャ ーお よ びカラ マンシ ー果 実 飲料 用 の原料 果汁（ シ ークワ シャー 原 料 果 汁 お よび カ ラ マ ンシ ー 原 料果 汁 ）， 沖 縄 県 農 業 研究 セ ン タ ー 名 護 支 所 お よ び 台 湾 行 政 院 農 業 委 員 會 高 雄 區 農 業 改 良 場 を 通 じ て 収 集 し た シ ー ク ワ シャー 果実（沖 縄県 産およ び台湾 産）お よびカ ラマン シー 果 実（沖縄 県産お よび台 湾産） を用 い た．原 料果汁 は，°Brix が 9.0 ± 0.2 となる ように 蒸留水 を用い て希釈 した ． 果実試 料はハ ンド プ レス式 のジ ュ ーサ ー （ 内 径 84 mm，
深さ 32 mm， ヒロシ ョウ㈱ 製）を 用い て 搾汁し ，分析 試料 と した．
モデル 偽和果 汁と し て，°Brix を 9.0 ± 0.2 に調整 したシ ーク ワ シャー 果汁 および カラマ ンシ ー 果汁を 混合し ，シ ー クワシ ャー25%果汁（ カラマ ンシー 75%混合果汁 ），50%果汁（カ ラマ ンシー50%混合果 汁），75%果汁（カラ マン
シー25%混合 果汁 ） を調製 した．
ま た， 沖 縄 県 で 市 販 さ れて い る シ ーク ワ シ ャ ー 果 汁 飲 料 （ 市 販 果汁 飲 料 ） 10品を分析 に供 した ．
2．試薬
nobiletin，sinensetin，tangeretin は Extrasynthase 製（Lyon，France）を 購入
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した．3’, 5’-di -C-β-glucopyranosylphloretin（フロ レチン 配糖 体 ）は， ナガミ キンカ ン（Fortunella margarita）より以 下 の方法 で単離 され た ものを 用いた
8 5 )．すな わち，ナ ガ ミキン カンの 果 実 225 g からエ タノ ールを 用いて フロレ
チン配 糖体を 抽出 し た．次い でエタ ノー ルを減 圧下で 除去 し た後 ，n-ブ タノ ールと 水を用 いた 液 －液分 配で，n-ブタ ノ ール層 にフロ レチ ン 配糖体 を抽出 した．n-ブ タノ ール 層を減 圧下で 濃縮 乾 固した 後，水 に再溶 解し，合 成吸 着 剤（ダ イヤイ オ ン HP-20，三菱ケ ミカ ル㈱ 製）を 添加し てフ ロ レチン 配糖体 を吸着 させた．合成 吸 着剤か らエタ ノー ル を用い てフロ レチ ン 配糖体 を脱着 させた 後，減 圧下 で エタノ ールを 除去 し ，乾固 物（600 mg）を得た ．乾固物 からの フロレ チン 配 糖体の 単離は 分 取 HPLC で行い ，フロレ チ ン配糖 体（220 mg）を得 た．なお ，分取 HPLC の条 件は 以下の 通りで ある ．カラム に Tosoh ODS-Prep（250 × 22 mm I.D., 10 μm，東 ソ ー㈱製 ）を用 い， 移 動相 Aはメ タ ノール，移動 相 B は 0.2%（v/v）酢酸 溶液 ，流速 は 5.0 mL/ min とした．グラ ジエン ト条件 は，B 液濃度 を 60→30%（0～90 分）と した ．
第2項 実験方法 1．パネリ スト
中村学 園大学 学 生 20 名（平 均年 齢 21.8 歳 ）とし た．パネ リス トは事 前に 2 ヶ月間 試料 を摂取 し，同 一試料 に対 す る評価 の尺度 がパ ネ ル で統 一され る ように 訓練し た後 ， 官能評 価に参 加し た ．
2．官能評 価法
試 料 20 mL を 透明 のガラ スコッ プに 入 れ，3 桁の ラン ダムに 振った 数値を 付して 提供し た． 例 えば，657，454，340 などである ．評 価 には，3 点識別 法およ びシェ ッフ ェ の一対 比較法 を用 い た．
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3 点識別 法で は，同 じ試料 （A）2 点とそ れとは 異なる 試料 （B）1 点を 同 時にパ ネリス トに 提 供し ，1 つ だけ異 なる ものお よびシ ーク ワ シャー100%で あると 判断さ れる も のをそ れぞれ 選ば せ た．試料 の提 供は，各 パネリ ストに 1 回のみ とし た．
シェッ フェの 一対 比 較法の うち，順 序に よ る効果 および パネ ル による 効果 を考慮 する浦 の変 法 を用い た 8 5 )．果 汁試 料の 色 合い（ 橙 色 － 黄色 ），香 り（シ ークワ シャー とは 異 なる香 り－シ ーク ワ シャー の香り ）お よ び酸味（ 弱い－
強 い ）の 3 項目 につ い て，変化な し を 0 と し た±3 点の 7 段 階で 評 価させ た．
各 パ ネ リ ス トに す べ て の組 み 合 わせ お よ び すべ て の 順 序 で 試 料 を 提 供 し た．
3．色調測 定
果汁の 色調は 測色 式 差計（Color meter ZE6000, 日本電色 工業㈱ 製 ）で 反射 式によ り測定 し，L*, a*, b*値を 求めた ．
4．薄層ク ロマ トグラ フ（TLC）法によ る フロレ チン配 糖体 の 検出
メタ ノー ル 2 mL お よび超 純水 3 mL で 前 処理し た固相 カー ト リッジ（ Sep-pak C18 カー トリッ ジ，日 本ウォ ータ ー ズ ㈱製 ）に果 汁 2 mL を負荷 した ． その後 ，超純 水 2 mL で洗浄し ，メ タノ ール 1 mL で 溶出 し たもの を分析 試 料とし た．
TLC プレ ート （sillca gel 60 F2 5 4，20 × 20 cm，Merck㈱製 ） は ，100°C で 1 時間加 熱し，使用 直 前まで シリカ ゲル を 入れた デシケ ータ ー で保管 した．分 析試料 を毛細 管 で 25 回スポ ットし ，ク ロ ロホル ム：メ タノ ー ル：1%（v/v） リン酸 溶液（65：35：5）混合 液で展 開し て ，10%（v/v）硫酸 溶液 を噴霧 後，
ガスバ ーナー で加 熱 し検出 した．