龍谷大学農学部資源生物科学科 新技術解説
図−1 DNA抽出に供試した根こぶ
― 40 ― よび根の中間部位1 cmを無作為に採取し，実験に供試 した。
2 DNA抽出
ビーズ破砕用2 mlチューブにDNA抽出キット（簡易 DNA抽出キット植物用，カネカ＊）A液を100μl分注し，
採取した根こぶ1個を入れた。そこへ径3.5 mmステン レ ス ビ ー ズ を1個 入 れ，ビ ー ズ 破 砕 機（Bead Smash 12R，ワケンビーテック）を用いて4,000 rpm・1分処理 し，根こぶを破砕した。破砕液をPCR用0.5 mlチュー ブに移し，95℃・10分間処理し，反応液が室温まで冷 めた後，B液14μlを添加し，よく混和した。5,000 rpm・
5分の遠心を行い，上澄みのみを別のチューブに移し，
鋳型DNAとした。なお，PCRのみであればB液混和後 のそのままの反応液を用いてもよい。根こぶの見られな い根の先端1 cm，および根の中間部位1 cmについても 先述と同様に鋳型DNAを作成した。このように，DNA 抽出に要する時間は15〜20分程度と短時間であった。
鋳型DNAは使用時まで−20℃で保存した。
3 PCRおよびリアルタイムPCR
PCRには，プライマーとしてネコブセンチュウの種 同定に用いられるPOWERS and HARRIS（1993）のミトコン ドリア領域を増幅するプライマー，およびサツマイモネ コブセンチュウ種特異的プライマー（TOYOTA et al., 2008）
を用いた。配列は，種同定用プライマーがC2F3：5ʼ―
GGT CAA TGT TCA GAA ATT TGT GG―3ʼ，1108：5ʼ―
TAC CTT TGA CCA ATC ACG CT―3ʼ，種特異的プライマ ーがRKNf：5ʼ―GCT GGT GTC TAA GTG TTG CTG ATA C―3
ʼ，RKNr：5 ʼ―GAG CCT AGT GAT CCA CCG ATA
AG―3ʼである。反応はPCR用0.5 mlチューブを用い，鋳型DNAを2μl，10×緩衝液を2.5μl，10 mM dNTPを
2.0μl，10 mMプライマー溶液をそれぞれ1μlずつ，水
を16.4μl，TaqDNAポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq® Hot Start Version，タカラバイオ）を0.1μl，計25μlで反応 させた。PCR装置はGeneAtlas S（ASTEC）を用いた。
反応は，種同定用プライマーを用いたものは，94℃・2
分の後，94℃・1分，48℃・2分，68℃・3分のサイクル を35回行い，最終伸長を72℃・5分行った。種特異的 プライマーを用いたものは，95℃・10秒の後，95℃・5 秒，60℃・30秒のサイクルを45回行った。反応後，サ ンプルは0.005％ GelRed™（GelRed™ Nucleic Acid Stain, 10,000× in water, Biotium）を含む寒天ゲルで電気泳動
（100 V・20分）を行い，撮影した。
リアルタイムPCRは先述のサツマイモネコブセンチ ュウ種特異プライマーを用い，リアルタイムPCR装置
（CFX Connect™，BIO―RAD）によるDNA増幅を行った。
反応は反応キットのプロトコールに従って行った。鋳型 DNAは，遠心により植物残渣を沈殿させた上澄みを別 チューブに移したものを用いた。
III
根こぶ
1
個，または根こぶの見られない根の先端 部位，および根の中間部位約1 cm
から抽出したDNA
による線虫の検出1 PCRによる線虫の検出
根こぶ1個から迅速・簡便に抽出した鋳型DNAを用 い，種同定で用いるミトコンドリア領域のプライマー，
およびサツマイモネコブセンチュウ種特異プライマーを 用いたPCR増幅を行った結果，供試したすべての根こぶ サンプルにおいて極めて良好な増幅が見られた（図―2）。
根こぶの大きさはPCR増幅結果には影響しなかった。
根こぶの見られない根の先端部位1 cm，および根の 中間部位1 cmについては，すべての反復でPCR増幅が 見られるとは限らなかった（図―3）。根の先端1 cmで は反復8のうち一つで，根の途中の部位1 cmでは四つ でPCR増幅が見られなかった。これは，ネコブセンチ ュウの寄生侵入部位が根端付近であることから，根の先 端ではこぶが見られない状態でも既に2期幼虫が侵入し ており，それらのDNAが検出されたものと思われる。
一方，根の中間部位では，線虫が検出される確率は低か った，これは，根の途中の段階でこぶになっていない状 態であるということは，もともと線虫は侵入していなか
反復
同定用プライマー 種特異的プライマー
1 2 3 4 5 6 反復 1 2 3 4 5 6
図−2 ビーズ破砕法による根こぶ1個から抽出したDNAによるPCR増幅
＊：現在は簡易DNA抽出キットversion 2が販売されている。
った可能性が高いことを示唆する。しかしながら，こぶ でない根の中間部位から検出可能であったことは，これ までにない知見である。
2 リアルタイムPCRによる線虫の検出
PCRで使用したものと同じ鋳型DNAを用い，リアル タイムPCR増幅を行った結果，すべてのサンプルで良 好な増幅が確認された（図―4）。根こぶの大きさとCt値 の間には明確な相関性はないように思われた。これは，
根こぶの外見の大きさとその中のネコブセンチュウの発 育度合いには相関性が低いためと考えられる。また，1 個のこぶに複数の線虫が寄生していることがあることも 関係していると思われる。
お わ り に
日々多くの輸入植物貨物が運び込まれる輸入植物検疫 の現場においては，感染が疑われる植物からいかに迅速 に線虫DNAを抽出し，種を同定するかが極めて重要で ある。本研究では簡易DNA抽出キットおよびビーズ破 砕 に よ る 根 こ ぶ1個，あ る い は 感 染 が 疑 わ れ る 根 約 1 cmからのサツマイモネコブセンチュウ検出法により，
迅速・簡便に線虫DNAを抽出できる条件を確立した。
本方法により，PCR法では電気泳動を含めた4〜5時 間程度，リアルタイムPCR装置を用いた検出ではより 短時間の2時間程度で根こぶ1個から種同定までが可能 となった。
本研究では根こぶ1個からの検出法について述べた が，有害線虫にはネコブセンチュウ以外にもシストセン チュウ，ネグサレセンチュウ，ハセンチュウ等の生態の 異なるものがおり，シストセンチュウのシスト1個，ネ
グサレセンチュウの病斑根等，それぞれの線虫に特徴的 な加害部位からのDNA抽出が可能であると考えられる。
さらには，本手法は根に寄生する有害線虫以外の様々な 病原糸状菌や細菌，さらには昆虫類の，感染根からの検 出にも応用することができると期待される。
引 用 文 献
1） HU, M. X. et al.（2011）: Phytopathology 101 : 1270〜1277.
2）岩堀英晶（2014）: 線虫学実験，京都大学学術出版会，京都，p.50
〜55．
3） POWERS, T. O. and T. S. HARRIS（1993）: Journal of Nematology 25 : 1〜6.
4） TANAKA, R. et al.（2012）: Applied Entomology and Zoology 47 : 291〜294.
5） TOYOTA, K. et al.（2008）: Soil Science and Plant Nutrition 54 : 72
〜76.
根の先端部位 根の中間部位
図−3 ビーズ破砕法による根の先端部位および中間部位約1 cmから抽出した
DNAによるPCR増幅
35
30
25
20
15−5 −4 −3
SQ（log）
−2 −1 0
Ct
M M L
L LL
LL
M S S S S
S M S
M スタンダードは70個の根こぶ から抽出したDNAを希釈
：相対的に大きい根こぶ
：相対的に中程度の根こぶ
：相対的に小さい根こぶ L
M S
図−4 リアルタイムPCRによる根こぶ1個から抽出したDNAに よるサツマイモネコブセンチュウ検出
Ct：反応生成物が有意に増加したサイクル数．
SQ：試料のDNA濃度．
は じ め に
トマト褐色輪紋病は，1985年に岡山県で初めて発生 が確認された病害で（粕山ら，1992）
，
その後，大分県（児 玉・挾間，1994），鹿児島県（尾松・牟田，2005）等で
発生が報告されている。本病害は，キュウリ褐斑病の病 原菌と同種の糸状菌Corynespora cassiicolaにより引き起 こされる。和歌山県では，有田郡有田川町の施設および 雨除け栽培トマトにおいて，2015年8〜9月にかけて 多発し，大幅な減収となり問題となった。和歌山県のト マト栽培において発生する糸状菌による主な茎葉の病害 は，うどんこ病，葉かび病，すすかび病，斑点病，灰色 かび病，疫病等であり，褐色輪紋病は一般的に認知され ていない。そのため，生産者自らや普及組織による防除 対策の遅れが，多発した要因の一つと考えられた。今回は，トマト褐色輪紋病の病徴や和歌山県での発生 状況を述べるとともに，第一次伝染源や薬剤の防除効果 について若干の知見を得たので併せて紹介する。本稿が トマト褐色輪紋病の診断や防除において少しでも参考に なれば幸いである。