高度RNS耐性菌のNO耐性化遺伝子 - J-Stage

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154 化学と生物 Vol. 54, No. 3, 2016

高度 RNS 耐性菌の NO 耐性化遺伝子

NO ストレスに対する TCA 回路の新たな役割

活性窒素種（reactive nitrogen species; RNS）は，一酸化窒素（NO）やペルオキシナイトライト（ONOO⁻）などの反応性の高い窒素酸化物の総称である．これらは活性酸素種と同様に，DNA，タンパク質，膜などに酸化傷害を与え，強い細胞毒性を引き起こす⁽¹⁾．微生物では，NOは嫌気呼吸（脱窒）の中間体として生産されるとともに，硝化や脱窒反応の中間体として生産された亜硝酸塩（NO−2）がプロトンと化学反応することによっても生じる⁽²⁾．一方，高等動物はシグナル伝達物質および病原性細菌を殺す武器としてNOを産生する⁽¹⁾． ONOO⁻は，NOとスーパーオキシドが化学的に反応して生じる⁽¹⁾．したがって，脱窒菌や硝化細菌などは内因性のNOから，病原性細菌などは外因性のNOから自身を守らなければならない．細菌のNO応答に関する研究は1990年代から活発に行われ，好気的なNO解毒酵素としてフラボヘモグロビン（Hmp）が同定された⁽³⁾． 2000年以降，さまざまな細菌のゲノムDNA配列が解読され，多くの細菌がHmpのオルソログを有していることが明らかになった．その一方で，NOの解毒とは異なるメカニズムによるNO耐性化についてはほとんど着目されてこなかった．

われわれが単離した高度RNS耐性細菌

およびの生

育のNO耐性は，大腸菌や緑膿菌のそれらよりも明らかに高かった^(4, 5)．ところが，は大腸菌や緑膿菌と同様にゲノムDNAに遺伝子を一つしか有しておらず，にいたっては遺伝子を有していない．このことは，これらの細菌はHmpによる NOの解毒以外にも何らかのNO耐性化機構を有していることを強く示唆した．そこでわれわれは，トランスポゾンを用いてのNO感受性変異株を取得・解析することで，新たなNO耐性化遺伝子を同定することを試みた．興味深いことに，この手法では，RNS の解毒酵素や酸化ストレス応答性の酵素遺伝子は全く見いだされず，ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体

（Pdh）のE1コンポーネント（EC 1.2.4.1）とアコニターゼ（Acn, EC 4.2.1.3）のアイソザイムの一つである AcnA3をコードする遺伝子が見いだされた⁽⁵⁾．Pdhは

TCA回路に基質を供給し，AcnはTCA回路を担う酵素である．そこでTCA回路を担う酵素遺伝子に着目したところ，NOにさらされたはTCA回路を担う酵素遺伝子全般の発現量を顕著に増加させることが明らかになった⁽⁵⁾．これらの結果は，中央代謝系であるTCA回路がNOストレスへの応答と耐性化に重要な役割を担っていること示した．TCA回路には，還元力

（NADHやFADH2）を生産する異化代謝と生体構成物質（アミノ酸など）の生合成を司る同化代謝としての役割がある．NOへの暴露は，の細胞内 NADH/NAD^＋比およびATP量を著しく低下させ，その影響はおよび変異株でより顕著であっ

た^(5, 6)．また，および変異株は，NO以外の内

因性の酸化ストレス誘発剤に対しても感受性を示し

た^(5, 6)．このことから，本菌はTCA回路の異化代謝を活

性化させることによってNADHの生産量を増加させ，

NOによって引き起こされる酸化ストレスに耐性化すると考えられた（図1_）_．

では，PdhとAcnはどのようなメカニズムでTCA回路の異化代謝の活性化に貢献するのだろうか？ Pdhはピルビン酸からアセチルCoAを生産する（図1）．アセチルCoAはクエン酸シンターゼがオキサロ酢酸をクエン酸に変換するために必要であるが，変異株はピルビン酸から十分なアセチルCoAを生産することができない⁽⁵⁾．酢酸塩の添加によって，変異株のNO感受性は大幅に低下し，さらに野生株のNO耐性も大きく向上した⁽⁵⁾．酢酸は，酢酸‒CoAリガーゼによってアセチルCoAに変換されることが知られる．これらのことから，PdhはTCA回路にアセチル‒CoAを供給することによってTCA回路の代謝を活性化させることが示された．Acnは活性中心に鉄硫黄クラスター（Fe‒S）を有しており，TCA回路においてクエン酸のイソクエン酸への異性化反応を触媒する（図1）．大腸菌は，AcnAと AcnBの2つのタイプのAcnを有し，構成的に発現しているAcnBのFe‒Sは酸化ストレスに極めて脆弱であることが知られる．一方，AcnAのFe‒Sは酸化に対して比較的耐性であり，酸化ストレス下で発現誘導されることによってAcnBの機能を代替する．の

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AcnA3は，その他の細菌のAcnAと比較して2〜3倍強い比活性を示し，そのFe‒Sは酸素やNOに対して高い安定性を示した⁽⁶⁾．また，の遺伝子はNOの存在とは無関係に対数増殖期中期から後期に発現が強くなり，細胞内には常に一定量のAcnA3が見いだされた⁽⁶⁾．つまり，本菌は，高活性・高抗酸化性を示すAcnA3を構成的に生産することによって，外界からのNOストレスに素早く応答し，TCA回路の異化代謝を維持・活性化できると考えられる．このように，われわれは高度RNS耐性菌のNO耐性化遺伝子の解析を通して，TCA回路に「NOストレス耐性化機構」というの新たな役割を見いだした．しかしながら，見いだされたNO耐性化遺伝子の半数はその機能や役割が未知であり，それらは今後の解析によって順次明らかになっていくと考えている．

1) D. A. Wink & J. B. Mitchell: , 25, 4 (1998).

2) A. Samouilov, P. Kuppusamy & J. L. Zweier:

, 357, 1 (1998).

3) R. K. Poole & M. N. Hughes: , 36, 4 (2000).

4) Y. Doi, N. Takaya & N. Takizawa:

, 75, 16 (2009).

5) Y. Doi, M. Shimizu, T. Fujita, A. Nakamura, N. Takizawa

& N. Takaya: , 80, 6 (2014).

6) Y. Doi & N. Takaya: , 290, 3 (2015).

（土肥裕希，岡山理科大学工学部バイオ応用化学科）

プロフィール

土肥裕希（Yuki DOI）

＜略歴＞2006年岡山理科大学工学部応用化学科卒業／2008年同大学大学院工学研究科応用化学専攻修士課程修了／2011年筑波大学大学院生命環境科学科生物機能科学科博士後期課程修了／同年同大学大学院生命環境科学科博士特別研究員／2012年岡山理科大学工学部研究員，現在に至る

＜研究テーマと抱負＞微生物のストレス応答と耐性化機構．乳酸菌のグリセロール代謝とそれを利用したものづくり＜趣味＞熱帯魚の飼育と観賞，模型作り

TCA回路の異化代謝を活性化することによって，RNSによって酸化されたNAD（P）^＋を再びNAD（P）Hに還元する．生産された NAD（P）Hは，ATPの生産（代謝）やRNS の解毒に利用される．

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