ニッケルの溶出と炎症誘発作用機構の解析
東北大学大学院薬学研究科生活習慣病治療薬学分野 平 澤 典 保
目的・背景
肌に直接接する装飾品に含まれるニッケルは、汗で溶出されやすくアレルギーや炎症 を誘発しやすい金属である。ひとたび金属アレルギーを発症すると、ニッケル以外の金 属にも過敏になることが知られており、種々の装飾品により発赤、かゆみなどが生じて、
装飾品を身につけることが制限される。また金属イオンにより強い接触皮膚炎を起こし、
色素沈着を誘発する場合もあり、コスメトロジーの観点からも大きな問題となっている。
ニッケルが金属アレルギーを最も引き起こしやすい金属であることは周知の事実であ り、そのアレルギー誘発機構については多くの報告がなされてきた。従来、ニッケルは 組織蛋白に結合しハプテンとなると考えられてきたが、最近ニッケルは直接リンパ球上 の MHC 複合体に結合して、細胞を活性化することが明らかにされ3)、組織蛋白との結合 による抗原の形成は必ずしも必要ではないことも示唆された。一方、金属アレルギーの 初期段階はニッケルを含む装飾品や金属医用材料からのニッケルイオンの溶出である。
しかしこのニッケルが溶出される分子機構や炎症が生じて金属周囲組織の環境が変化 した場合のニッケル溶出の変化の定量的な解析はこれまでなされていない。その最も大 きな理由は優れた実験モデルがなかった点にある。
申請者はニッケル線をマウス背部皮下に埋稙させる新規モデルを開発し4)、ニッケル による炎症反応の誘発とニッケルの溶出を定量的に解析することを可能にした。本研究 は、本モデルを用いて、ニッケル線からのニッケル溶出が、その周囲で感染を模倣した 炎症を誘発したときに増大することを示した。また、炎症細胞を用いた細胞培養系での ニッケルイオン溶出評価系も確立し、ニッケル溶出の分子機序について解析した。
結果・考察
当研究室で開発されたマウス金属線誘発炎症モデルにおいて生体内での金属からの ニッケルの溶出を評価した。すなわち、ニッケル線 (Ni;φ0.8 mm×5 mm) をマウス背 部皮下に埋稙し、その直後に、感染を模倣する起炎剤 lipopolysaccharide (LPS、1 µg) をニッケル線の近傍に皮下注射した。一定時間後、ニッケル線の周囲組織中のニッケル 濃度を Newport Green DCF (NPG) を用いた蛍光光度法により測定した。その結果、埋 稙後８時間以降でニッケル濃度の増加が認められ、これは LPS 注射によりさらに増大し た。したがって、感染など炎症反応が生じると金属からのニッケルの溶出が増大するこ とが示唆された。
次に、LPS による炎症反応によりニッケル溶出が促進する現象が in vitro でも認め られるか、マウスマクロファージ様細胞株である RAW264 細胞を用いて検討した。RAW264
細胞 (1x105 cells/ml, 0.2 ml) を 96-well plate 中のニッケル板上に播種するとニッ ケル溶出は促進され、この溶出作用は LPS 刺激によりさらに促進された。また、LPS で ニッケル溶出が促進した場合でも培養液中の pH は低下しなかったこと、また、LPS に よるニッケル溶出の促進作用はニッケル板と RAW264 細胞が接着した条件下でのみ認め られたことから、RAW264 細胞における LPS 刺激によるニッケル溶出促進作用はニッケ ル板と細胞との接着面で生じ、LPS 刺激によりこの微小環境での酸性化が生じている可 能性が示唆された。そこで RAW264 細胞によるニッケル溶出効果のメカニズムを明らか にするため、LPS 非存在下及び LPS 存在下で、リソソーム阻害薬 chloroquine (10 µM)、
Na+/H+ exchanger (NHE) 阻害薬 amiloride (100 µM)、vacuolar-type (H+)-ATPase (V-ATPase) 阻害薬 bafilomycin A1 (1 nM) の各薬物を添加し、これらの薬物の影響を 解析した。その結果、LPS 非存在下では chloroquine 添加によりニッケル溶出は部分的 に抑制され、bafilomycin A1もニッケル溶出を抑制する傾向を示した。また、LPS 存在 下では chloroquine、amiloride 及び bafilomycin A1はいずれも LPS によるニッケル溶 出促進を有意に抑制した。以上の結果から、マクロファージは金属表面ではこれを異物 と認識してプロトンを含むリソソームのエキソサイトーシスにより、また LPS で活性化 するとリソソームの放出に加え細胞膜の V-ATPase や NHE が活性化され、細胞外への H+ 放出をさらに増大させて著しくニッケル溶出が促進されると考えられる。
本研究では動物モデル及び細胞を用いたニッケル溶出評価系を確立し、炎症反応によ りニッケル溶出が促進されることを明らかにした。本評価系は金属製装飾品や医用材料 の安全性評価に有用であり、金属による毒性やアレルギーの発症リスクの軽減につなが ることが期待される。
