セミナー室
広がるオートファジーの世界-5オートファジーによる細胞内侵入性細菌の認識機構
前島郁子 *1, 3，吉森 保 *
1, 2, 3
*1大阪大学大学院医学系研究科，*2大阪大学大学院生命機能研究科，*3科学技術振興機構CREST
はじめに
病原性細菌がマクロファージなどの貪食細胞によって ファゴサイトーシスによって捕らえられ排除されること はよく知られているが，上皮細胞などの非貪食細胞にお いても細胞内に侵入した細菌を排除する仕組みが備わっ ている．一つはエンドサイトーシス経路であり，上皮細 胞にエンドサイトーシスを介して侵入しようとした細菌 は最終的にエンドソームによってリソソームへ運ばれて 分解されることになる．しかし，ある種の細胞内侵入性 細菌はエンドソーム膜を破って細胞質中に脱出するなど 細胞内での生き残りを図ろうとすることが知られてい た．2004年に細胞質中に逃れた溶血性A群連鎖球菌
（Group A ）がオートファジーによって捕 獲・分解されることが発見されたことにより，細胞には エンドサイトーシス経路以外にも細胞内侵入性細菌に対 抗する術が備わっていることが明らかとなった（1）．この 発見により，それまで主に栄養飢餓時の恒常性維持に重 要であると考えられてきたオートファジーに，生体防御 機能という新たな一面が付け加えられることになった．
このような細胞内に侵入した病原体に対する選択的オー トファジーはゼノファジー（xenophagy）と命名され，
現在までにオートファジーは細菌，ウイルス，原虫など を標的とし，それらを分解もしくは増殖抑制する能力を もつことが明らかになりつつある．本稿では，細胞内侵
入性細菌の感染経路と，細菌感染におけるオートファ ジーの誘導メカニズムについて解説する．
細胞内侵入性細菌に対するオートファジー
エンドサイトーシス／ファゴサイトーシス経路を介し て侵入してきた細胞内侵入性細菌は，オートファジーに よる捕獲・分解，オートファジーの回避，もしくはオー トファジーを利用して増殖する，の3つの運命のどれか をたどることになる．オートファジーを回避する細菌と してはリステリア（ ）（2, 3）や赤痢 菌（ ）（4），オートファジーを利用して増 殖するものとしては歯周病菌（
）（5），レジオネラ（ ），腸炎ビ
ブリオ（ ）やペスト菌（
）などが挙げられるが，ここでは主にオートファ ジーによって捕獲・分解されるものについて述べる．
細胞内侵入性細菌のオートファジーによる分解経路 は，1）細胞質内での捕獲・分解，2）エンドソームごと の捕獲・分解，3）ファゴソーム内で捕獲・分解，の3 つのパターンに分類される．
細胞質内で捕獲・分解される細菌としては，上述の溶 血性A群連鎖球菌に加え，黄色ブドウ球菌が存在する．
A群連鎖球菌はヒトに急性咽頭炎などを引き起こすグラ ム陰性球菌で，上皮細胞にエンドサイトーシス経路を介
して取り込まれ，エンドソーム膜に結合して孔をあける 溶血毒素ストレプトリジンO（SLO）を分泌することに より，エンドソーム膜を破壊し，細胞質中へと脱出す る．オートファゴソーム形成に必須のオートファジー関 連遺伝子（autophagy-related gene）Atg5を欠損した細 胞にA群連鎖球菌を感染させたところ，正常細胞では 多数観察された巨大なオートファゴソームに包まれた菌 が全く観察されず，また細胞内での菌の増殖が抑制され なかったことから，細胞質中に脱出したA群連鎖球菌 はオートファジーによる分解を受けていることが示され た（1）（図1）．
黄色ブドウ球菌（ ）は，ヒトの
皮膚表面などに存在する常在菌で，通常は無害であるが 化膿症や重篤化した場合には髄膜炎や敗血症を引き起こ すことが知られている．この黄色ブドウ球菌もA群連 鎖球菌と同様に，細胞内で巨大なオートファゴソームに 包み込まれ，分解されることが報告されている（6）．興味 深いことに，A群連鎖球菌や黄色ブドウ球菌を捕獲する ために形成されるオートファゴソームは飢餓時に誘導さ れるもの（通常直径約1
μ
m）よりもはるかに巨大なも のとなる．このA群連鎖球菌の感染で誘導される巨大 なオートファゴソームは，通常サイズのオートファゴ ソーム同士が次々と融合することで形成され，その融合 のステップには飢餓誘導性のオートファゴソームの形成 には必要でないRab7が関与していることが示されてい る（7）．次に損傷したエンドソームごと捕獲・分解される細菌 としては，食中毒の原因菌であるサルモネラ（
serovar. Typhimurium）が挙げられる．サ ルモネラはグラム陰性桿菌の一種で，腸管粘膜上皮に付 着すると注射針のようなIII型分泌装置を突き刺し，宿 主細胞内にSop, Sipなどのエフェクター分子と呼ばれる
サルモネラ産生タンパク質を注入する．エフェクター分 子は，宿主タンパク質の機能を真似ることで細胞骨格を 構成するアクチンを再構成させ，サルモネラ菌付着周囲 の細胞膜の変形を促し，エンドサイトーシスによる菌の 取り込みを促進する（8, 9）．サルモネラ菌を含むエンド ソームはSCV（ -containing vacuole）と呼ば れ，通常のエンドソームと同様に成熟していくが，リソ ソームとの融合は回避するので菌は分解を逃れる．サル モネラはSCV内で増殖するが，一部の菌は感染初期に SCVを破って細胞質中へ抜け出し，そこで増殖するこ ともある．マウス繊維芽細胞を用いた実験では，感染後 1時間で細胞内に侵入したサルモネラの約40%がオート ファゴソームによって包み込まれることが報告されてい る（10）．一方，オートファジー能を欠損させたマウス線 維芽細胞では細胞内でのサルモネラの過剰増殖が起こる ことから，オートファジーがサルモネラの増殖抑制に重 要であることがわかる．サルモネラはSCVを抜け出し て細胞質中に脱出することがあるため，連鎖球菌や黄色 ブドウ球菌のように，そのような菌がオートファジーの 標的になっていると考えられていた．しかし，光‒電子 相関顕微鏡法（CLEM）を用いた解析によって，オート ファゴソームマーカーであるLC3に包まれているサル モネラを電子顕微鏡で観察したところ，ほとんどのサル モネラは一重膜のSCVに包まれたままの状態で，二重 膜構造体であるオートファゴソームによって捕獲されて いることが判明した（11）．さらに，オートファゴソーム の標的になるのは，損傷した膜のマーカーとなるGalec- tin-3（後ほど説明）が集積したSCVのみであることが 判明した．つまり，エンドソーム内に取り込まれたサル モネラはIII型分泌装置を突き刺すことでエンドソーム 膜を損傷させ，それが引き金となって（サルモネラの細 胞質中への脱出を待たずに）オートファジーを誘導して いると考えられる．
3つ目のグループであるファゴソームごと分解される
細菌としては，結核菌（ ）
があげられる．結核菌はマクロファージなどのファゴ ソーム内に取り込まれた後，通常はファゴソームとリソ ソームの融合を阻害することで分解を免れ，増殖する．
マクロファージが結核菌を取り込んだだけではオート ファジーは誘導されないが，飢餓条件下に置かれた場合 に，飢餓によって誘導されたオートファジーがファゴ ソームを包み込み，結核菌を分解することが報告されて いる（12）．
図1■A群連鎖球菌を隔離するオートファゴソーム
（a）オートファゴソームマーカーであるLC3によって取り囲まれ ているA群連鎖球菌．飢餓誘導で見られるオートファゴソーム
（通常直径1 μm）よりも巨大なオートファゴソームが形成される．
スケールバー：2 μm．（b）細胞質中に脱出したA群連鎖球菌の菌 塊を隔離しているオートファゴソームの電子顕微鏡像．スケール バー：1 μm．
オートファジーによる細胞内細菌の認識機構 飢餓によって誘導されるオートファジーが非選択的に 細胞内成分を隔離・分解するのに対し，細菌感染で誘導 されるオートファジーは細胞内に侵入した菌のみを特異 的に標的として隔離する選択的なものである．では，こ の選択性はどのようにして獲得されているのだろうか？
オートファジーが選択的に隔離する対象は細菌だけでは なく，ミトコンドリアやペルオキシソームといった細胞 内小器官や凝集性タンパク質も標的に含まれる．これら がオートファゴソームマーカーであるLC3に取り囲ま れるときにはユビキチン化されていることから，ユビキ チンは選択的オートファジー全般における重要なタグの 一つであるとみなされ，ユビキチン化された対象物にユ ビキチンとLC3の両方に結合可能なp62, NBR1, NDP52 やオプティニューリンなどのアダプター分子が結合する ことでLC3がリクルートされ，オートファゴソームが 形成されるアダプターモデルが提唱されている（13〜17）． しかし，ユビキチンが細胞内侵入性細菌に対するオート ファジーにおいてどのような役割を果たしているのか，
ユビキチン化されている基質が何なのかは不明のままで あったが，これらの疑問に対して藤田ら（18）はサルモネ ラとラテックスビースの系を用いて一つの解答を示し た．
上述のようにサルモネラの一部は細胞質中に脱出する ため，むき出しになった菌表層タンパク質が直接ユビキ チン化されるか，あるいはユビキチン化タンパク質が菌 に付着することでオートファジーの標的になると考えら れてきた．しかし，トランスフェクション試薬でコー ティングし，エンドサイトーシスで取り込まれるように したラテックスビースを細胞に取り込ませたところ，エ ンドソーム膜に包まれたビース周囲にユビキチンとp62, LC3が局在する様子が観察され，さらにこのLC3陽性の エンドソーム膜はGalectin-3陽性であることが明らかと なった（18）．Galectin-3は細胞質中に存在する
β
-ガラクト シド結合性のレクチンの一種で，エンドソーム膜が損傷 した場合にのみ膜内腔側に存在する糖鎖と結合するた め，膜損傷のマーカーとされている．ラテックスビーズ にはタンパク質成分は存在しないため，ビーズ周囲で起 きたユビキチン化は損傷したエンドソーム膜上で起きて いるものであることが示唆される．実際，ビーズを単離 すると周囲のエンドソーム膜上のトランスフェリンレセ プターなどのタンパク質がユビキチン化されていること が確認されている．サルモネラを感染させた場合でも同 様の結果が得られたことから，菌体表面ではなく，サルモネラを包むSCVがユビキチン化されていることが明 らかとなった．また，ユビキチン活性化酵素であるE1 酵素阻害剤によって，細胞内のユビキチン化反応を阻害 したところ，Galectin-3陽性のエンドソーム膜上へのユ ビキチンとオートファゴソーム形成に必須の6つのAtg 複合体の局在化が抑制されたことから，ユビキチン化は オートファジーのマシナリーを細菌へリクルートするた めに重要な役割を果たしていると考えられる．トランス フェクション試薬によってエンドソーム膜が損傷するメ カニズムは明らかにはなっていないが，サルモネラの場 合はIII型分泌装置によってエンドソーム膜を損傷させ るため，その膜がユビキチン化されることでオートファ ジーによる認識を受けていると考えられる．サルモネラ だけでなく，A群連鎖球菌や黄色ブドウ球菌のように細 胞質中に脱出するような菌の場合，脱出した菌体自身が 認識されている可能性と菌周囲に付着した脱出したエン ドソーム膜の残骸が認識されている可能性が考えられ る．また，宿主の膜成分を認識するという点から，エン ドサイトーシス経路を利用する菌だけでなく，ファゴサ イトーシスを利用する菌でも同様のことが起こっている のかもしれない．
では，オートファジーはどのようにしてユビキチン化 された基質を認識しているのだろうか？ アダプターモ デルでは基質上のユビキチンに，p62などのアダプター 分子が結合するとLC3のリクルートが起きると考えら れている．しかし，オートファジー能に必須である Atg7欠損細胞ではLC3の局在は起こらないにもかかわ らず，ほかのAtgタンパク質のリクルートと隔離膜の部 分的な形成が観察された（11）．このことから，アダプ ターモデルだけでは基質の認識機構の説明は不十分であ ることが示唆される．オートファジーに必須の6つの機能的 Atg複 合 体；1）Uncoordinated 51-like kinase 1（ULK1）
複合体，2）ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ複 合体，3）Atg9L，4）WIPI複合体，5）Atg5-12-16L1複 合体，そして，6）LC3結合系の各因子を欠損させた細 胞を用いて，菌感染による損傷エンドソーム膜へのAtg の局在化の階層構造を網羅的に解析したところ，ULK1 複合体，Atg9L， Atg5-12-16L複合体はそれぞれ独立に ユビキチン化された損傷エンドソームに局在すること，
Atg5欠損細胞では損傷エンドソームへのLC3の局在化 が有意に減少したことから，LC3のリクルートはAtg5- 12-16L1複合体に依存していることが明らかとなった．
また，リクルートのタイミングを見ると，LC3より先に すべてのAtgタンパク質が局在化していた（18）．つまり，
エンドソーム膜が損傷によってユビキチン化されると，
アダプター分子によるLC3のリクルートよりも先に ULK1複合体，Atg9L，Atg5-12-16L1複合体のリクルー トが起こっていることが示唆される（図2）．これらの 因子が基質にリクルートされるメカニズムだが，少なく ともAtg5-12-16L複合体については，変異体を用いた実 験の結果より，Atg16L1がC末端側のWDリピートドメ インでユビキチンと，さらにN末端側のcoiled-coilドメ インでULK1複合体の構成因子であるFIP200とそれぞ れ直接結合することによってユビキチン化された基質に リクルートされているものと思われる．
損傷したリソソームに対するオートファジー 細菌感染／ビースのトランスフェクションによって損 傷したエンドソーム膜だけでなく，リソソーム膜も損傷 時にはオートファジーの標的となることが報告され，リ ソファジー（lysophagy）と命名された（19, 20）．リソソー ムをシリカや薬剤，光刺激などを用いて実験的に損傷さ せたところ，Galectin-3で標識された損傷リソソームに ユビキチン，p62， Atgタンパク質が集積し，リソソー ム膜周囲にオートファゴソームが形成されている様子が 電子顕微鏡レベルで観察された．正常なNIH3T3細胞で はGalectin-3陽性の損傷リソソーム数が経時的に減少し 24時間以内に消失したのに対し，オートファジー能欠 損細胞では損傷リソソームの減少はほとんど見られな かったことから，損傷リソソームの隔離・排除にオート ファジーが重要な役割を果たしていることが示唆され た．また，野生型マウスにリソソーム膜を損傷する尿酸 結晶の形成を引き起こす高尿酸血症を誘発させたとこ ろ，腎臓の尿細管細胞においてリソソーム膜がユビキチ ン化され，選択的にオートファゴソームによって隔離さ
れている像が多数観察された（図3）．腎尿細管特異的 にAtg5を欠損させたマウスではリソソームのユビキチ ン化は見られたもののオートファゴソームによる隔離は 観察されず，腎組織の傷害が悪化したことから，オート ファジーによる損傷リソソームの除去は高尿酸血症によ る腎障害の病態悪化を抑制するのに重要であることが示 されている．
今後の展望
宿主細胞は日々侵入を試みてくる多種多様な細菌から オートファジーを利用してその身を守っている．この オートファジーを介した宿主細胞対細菌の攻防の機構解 明は，2004年に発見されて以来活発な研究の対象であ り続けている．これまでの研究では，細胞質中に脱出し た細菌がユビキチン化されているとする説が有力であっ たが，損傷されたエンドソーム膜ごとオートファジーの
Ub
Ub
Ub Ub
Ub
Ub Ub Ub
Ub LC3
p62 p62
Ubp62 Ub
Ub
p62 p62
Ubp62 Ub
Ub
LC3 LC3
ユビキチン
Atg16L ULK1 Atg9L1
LC3 Atg14L
WIPI1
細胞膜 菌
エンドサイトーシス／ファゴサイトーシス
エンドソーム膜の損傷
（a）
（b）
図2■オートファジーによる細胞内 侵入性細菌の認識モデル
（a）従来のアダプターモデル．エン ドソーム／ファゴソーム膜から脱出 した細菌がユビキチン化されると，
そこにp62などのアダプター分子が 結合することでLC3がリクルートさ れ，菌周囲にオートファゴソームが 形成されると考えられてきた．しか し，最近の研究により，細菌によっ て損傷を受けたエンドソーム膜のユ ビキチン化が引き金となって，At- g16L複合体，ULK1複合体，Atg9L1 がそれぞれ独立にリクルートされる ことでオートファゴソーム形成が起 こることが判明した（b）．
図3■オートファゴソームによって隔離される損傷リソソーム 尿酸を投与した正常マウスの腎臓（尿細管）細胞内では，一重膜の リソソームが二重膜のオートファゴソームによって隔離されている 様子が多数観察された．矢頭：オートファゴソーム，アスタリス ク：リソソーム，Mt：ミトコンドリア．スケールバー：1 μm．
標的になっている証拠が示されつつある．この場合，
オートファジーは菌の有無とは関係なく，ただ損傷した エンドソーム膜を処理しようとして発動し，結果的に菌 の除去にも貢献しているだけなのかもしれない．さまざ まな細菌がエンドソーム膜を損傷する機能をもっている こと，そのような菌体表面の分子には共通性が乏しいこ と，エンドソームだけでなくリソソーム膜も損傷時には オートファジーの標的になることもこの説を支持するの ではないだろうか．最新の研究によって，従来のアダプ ターモデルにかわるオートファジーの基質認識機構の一 部も解明されてきており，その全容の解明が待たれる．
生体内において，リソソーム膜の損傷は尿酸結晶だけ でなくコレステロール結晶や2型糖尿病を引き起こすヒ トIAPP，アミロイドタンパク質，活性酸素種などに よっても起こることが知られている．このことから，リ ソファジーが糖尿病や動脈硬化などの生活習慣病や炎症 性疾患の抑制に広範に機能している可能性が示唆されて おり，リソファジーの分子メカニズムおよびこれら疾患 との関連について解析が進むことで新たな予防治療法の 開発につながることが期待される．
文献
1) I. Nakagawa, A. Amano, N. Mizushima, A. Yamamoto, H.
Yamaguchi, T. Kamimoto, A. Nara, J. Funao, M. Nakata, K. Tsuda : , 306, 1037 (2004).
2) C. L. Birmingham, V. Canadien, N. A. Kaniuk, B. E. Stein- berg, D. E. Higgins & J. H. Brumell: , 451, 350 (2008).
3) Y. Yoshikawa, M. Ogawa, T. Hain, M. Yoshida, M. Fuku- matsu, M. Kim, H. Mimuro, I. Nakagawa, T. Yanagawa, T. Ishii : , 11, 1233 (2009).
4) M. Ogawa & C. Sasakawa: , 2, 171 (2006).
5) A. Amano, N. Furuta & K. Tsuda: , 52, 84 (2010).
6) A. Amano: , 140, 16 (2006).
7) H. Yamaguchi, I. Nakagawa, A. Yamamoto, A. Amano, T.
Noda & T. Yoshimori: , 5, e1000670 (2009).
8) J. H. Brumell, O. Steele-Mortimer & B. B. Finlay:
, 9, R277 (1999).
9) J. E. Galan: , 17, 53 (2001).
10) C. L. Birmingham, A. C. Smith, M. A. Bakowski, T. Yo- shimori & J. H. Brumell: , 281, 11374 (2006).
11) S. Kageyama, H. Omori, T. Saitoh, T. Sone, J.-L. Guan, S.
Akira, F. Imamoto, T. Noda & T. Yoshimori:
, 22, 2290 (2011).
12) M. G. Gutierrez, S. S. Master, S. B. Singh, G. A. Taylor, M. I. Colombo & V. Deretic: , 119, 753 (2004).
13) G. Bjørkøy, T. Lamark, A. Brech, H. Outzen, M. Peran- der, A. Overvatn, H. Stenmark & T. Johansen:
, 171, 603 (2005).
14) M. Komatsu, S. Waguri, M. Koike, Y.-S. Sou, T. Ueno, T.
Hara, N. Mizushima, J.-I. Iwata, J. Ezaki, S. Murata : , 131, 1149 (2007).
15) V. Kirkin, T. Lamark, Y.-S. Sou, G. Bjørkøy, J. L. Nunn, J.-A. Bruun, E. Shvets, D. G. McEwan, T. H. Clausen, P.
Wild : , 33, 505 (2009).
16) T. L. M. Thurston, G. Ryzhakov, S. Bloor, N. Muhlinen, von & F. Randow: , 10, 1215 (2009).
17) P. Wild, H. Farhan, D. G. McEwan, S. Wagner, V. V.
Rogov, N. R. Brady, B. Richter, J. Korac, O. Waidmann, C. Choudhary : , 333, 228 (2011).
18) N. Fujita, E. Morita, T. Itoh, A. Tanaka, M. Nakaoka, Y.
Osada, T. Umemoto, T. Saitoh, H. Nakatogawa, S. Ko- bayashi : , 203, 115 (2013).
19) Y.-H. Hung, L. M.-W. Chen, J.-Y. Yang & W. Y. Yang:
, 4, 1 (2013).
20) I. Maejima, A. Takahashi, H. Omori, T. Kimura, Y. Taka- batake, T. Saitoh, A. Yamamoto, M. Hamasaki, T. Noda, Y. Isaka : , 32, 2336 (2013).
プロフィル
前島 郁子（Ikuko MAEJIMA）
＜略歴＞2007年日本獣医生命科学大学獣 医学部獣医学科卒業／獣医師免許取得後一 年間動物病院に勤務した後，吉森研に博士 課程の学生として弟子入りさせていただき 一から鍛えてもらう．学位取得後，半年間 ポスドクとして在籍の後，4月からは群馬 大生体調節研細胞構造分野（佐藤研）で新 しいテーマに取り組む予定です＜研究テー マと抱負＞リソファジーの分子メカニズム と2型糖尿病などの生活習慣病との関連に ついて研究中です＜趣味＞読書，映画鑑賞 吉 森 保（Tamotsu YOSHIMORI）
＜略歴＞大阪生まれだが東京都立竹早高 校卒で，東京弁と大阪弁のバイリンガル．
1981年大阪大学理学部生物学科卒業／同 大学院医学研究科に進み，細胞工学セン ター初代センター長の岡田善雄先生に師 事．関西医科大学の助手となり，その間 にドイツハイデルベルクのEMBLに2年間 留学．一貫してメンブレントラフィックの 細胞生物学的研究に従事（2013年のノー ベル医学生理学賞はこの分野の大御所に）． オートファジー研究のパイオニアである大 隅良典先生（現東工大）が，1996年に基 礎生物学研究所にて研究室を立ち上げられ たときに助教授として招かれ，オートファ ジー研究を開始した．2002年後国立遺伝 学研究所教授として独立，大阪大学微生物 病研究所教授を経て現在，同大学院医学系 研究科教授と生命機能研究科教授を兼任．
あちこちを転々としてきた流浪の人生．別 名Prof. A. Hill．
Copyright © 2014 公益社団法人日本農芸化学会
