外 来 性 繊 維 状 異 物 の マ ウ ス に お け る 胎 仔 毒 性 F e t a l T o x i c i t y o f E x o g e n o u s F i b r o u s M a t e r i a l s i n M i c e 平 成 ２ ８ 年 度 論 文 博 士 申 請 者 藤 谷 知 子 （Fujitani, Tomoko） 指 導 教 員
目 次 １ ． 序 論 １ ２ ． 実 験 の 部 ２ ２ −１ ． 実 験 倫 理 ２ ２ −２ ． 被 検 物 質 ３ ２ −３ ． 投 与 用 懸 濁 液 ３ ２ −４ ． 動 物 ３ ２ −５ ． 胎 仔 毒 性 実 験 ４ ２ −５ −１ ． 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 １ ） ４ ２ −５ −２ ． 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 気 管 内 投 与 （ 実 験 ２ ） ５ ２ −５ −３ ． ア ス ベ ス ト の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 ３ ） ５ ２ −５ −４ ． サ イ ズ の 異 な る ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 ４ ） ６ ２ −６ ． 統 計 解 析 ６ ３ ． 結 果 ３ −１ ． 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 １ ） ７ ３ −２ ． 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 気 管 内 投 与 （ 実 験 ２ ） ９ ３ −３ ． ア ス ベ ス ト の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 ３ ） １ １ ３ −４ ． サ イ ズ の 異 な る ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 ４ ） １ ２ ４ ． 考察 １ ４ ５ ． 総括 ２ ４ 謝 辞 ２5 参 考 文 献 ２6
１ ． 序 論 公 害 ・ 薬 害 な ど に よ る ヒ ト の 健 康 被 害 を 未 然 に 防 ぐ た め に 、 医 薬 品 ・ 農 薬 ・ 食 品 添 加 物 等 の 適 正 な 使 用 と 環 境 化 学 物 質 の 有 害 性 の 検 証 を 目 的 と し て 、 微 生 物 ・ 培 養 細 胞 ・ 実 験 動 物 等 を 用 い た 安 全 性 試 験 に よ る 人 体 へ の 影 響 の 外 挿・類 推 は 欠 か せ な い 。 し か し 、微 生 物 ・ 培 養 細 胞 に よ る 細 胞 試 験（i n v i t r o 試 験 ）は 、 微 生 物 と ヒ ト と の 生 物 的 差 異 が 大 き い こ と や 、 化 合 物 の 直 接 作 用 し か 検 出 で き な い 。 例 え ば 、 ほ 乳 類 特 有 の 代 謝 産 物 に よ る 毒 性 発 現 な ど は 、 微 生 物 や 株 化 さ れ た 培 養 細 胞 で は 検 出 で き な い こ と か ら 、 実 験 動 物 に よ る 試 験 （ i n v i v o 試 験 ） が 重 視 さ れ て い る の が 現 状 で あ る 。近 年 、急 速 に 脚 光 を 浴 び て き た ナ ノ 物 質（ 少 な く と も １ 次 元 が 1 0 0 ナ ノ メ ー ト ル 以 下 の 物 質 ） の 中 で 、 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ は そ の 鋼 度 、可 塑 性 や 高 電 気 伝 導 性 な ど か ら 、 家 電 ・ 電 子 製 品 か ら 最 先 端 エ レ ク ト ロ ニ ク ス 製 品 ・ 生 命 科 学 技 術 １ 、 ２ ）ま で 広 汎 に 用 途 を 拡 大 し て き て い る が 、 特 に 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ に つ い て は 、 マ ウ ス （ p 5 3 遺 伝 子 欠 損 ）３ ）お よ び ラ ッ ト（ 遺 伝 子 改 変 な し ）４ ）に お い て 中 皮 腫 の 発 生 が 報 告 さ れ 、 そ の 高 ア ス ペ ク ト 比 を 持 つ 形 状 か ら ア ス ベ ス ト 同 様 の 健 康 被 害 が 懸 念 さ れ て い る 。５ — ７ ）ナ ノ 物 質 の 安 全 な 使 用 法 の 確 保 を 目 途 と し た 関 係 各 省 庁 の 動 き と と も に 、 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 生 体 影 響 研 究 科 で は 、 課 題 研 究 と し て 平 成 2 2 年 か ら 「 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 生 体 影 響 」 に 取 り 組 み 、 ま た 、 そ の 結 果 を 受 け て 重 点 研 究 課 題 と し て 「 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ 等 ナ ノ 物 質 の 健 康 影 響 に 関 す る 研 究 」を 平 成 2 6 − 2 8 の ３ カ 年 間 取 り 組 ん だ 。 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 胎 仔 毒 性 に 関 す る 科 学 的
文 献 情 報 は 皆 無 で あ り 、 し か も 、 類 似 物 質 で あ る ア ス ベ ス ト の 胎 盤 通 過 と ヒ ト 胎 児 あ る い は マ ウ ス 胎 仔 へ の 移 行 が 実 証 さ れ て い る ８ — １ １ ）に も か か わ ら ず ア ス ベ ス ト の 胎 仔 毒 性 に 関 し て も 未 知 で あ っ た の で 、 上 記 の 研 究 課 題 の 一 環 と し て 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ な ら び に ア ス ベ ス ト の 胎 仔 毒 性 に つ い て 検 討 し た 。 ま ず 、 数 あ る 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 中 か ら 、 マ ウ ス お よ び ラ ッ ト で 中 皮 腫 発 生 を 引 き 起 こ し た と 同 じ 製 品 に つ い て 、 多 段 階 投 与 量 で 胎 仔 毒 性 試 験 （ 催 奇 形 性 試 験 ） を 行 っ た （ 実 験 １ ）。次 に 、ヒ ト の 暴 露 実 態 に よ り 近 い 気 管 内 噴 霧 投 与 の 多 段 階 の 投 与 用 量 に よ る 実 験 を 行 っ た（ 実 験 ２ ）。ア ス ベ ス ト の 中 か ら 、 毒 性 が 最 も 強 い と い わ れ て い る ク ロ シ ド ラ イ ト（ 青 石 綿 ）、毒 性 が 比 較 的 弱 い と い わ れ て い る ク リ ソ タ イ ル（ 白 石 綿 ）、お よ び 中 間 と い わ れ て い る ア モ サ イ ト （ 茶 石 綿 ） の ３ 種 を 等 投 与 量 で 、 胎 仔 毒 性 を 比 較 し た（ 実 験 ３ ）。ラ ッ ト に お け る 中 皮 腫 発 現 と 同 じ く 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 製 品 間 で の 毒 性 作 用 が 異 な る か ど う か を 、 ６ 種 の 長 さ の 異 な る 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 等 投 与 量 実 験 で 、胎 仔 毒 性 を 比 較 し た（ 実 験 ４ ）。実 験 １ か ら ３ で 、 投 与 直 後 の 母 体 の 状 況 を 精 査 す る 必 要 が あ る と 思 わ れ た の で 、 実 験 ４ で は 、 投 与 直 後 の 母 体 の 白 血 球 百 分 率 や 母 体 血 中 の イ ン タ ー ロ イ キ ン- 6 、 単 球 走 化 性 因 子 - １ 濃 度 を 測 定 し た 。 ２ ． 実 験 の 部 2 - １ ． 実 験 倫 理 実 験 は 、 実 施 前 に 、 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー の 研 究 調 整 委 員 会 お よ び 動 物 実 験 委 員 会 に よ り 、 実 験 方 法 の 科 学 的 倫 理 的
妥 当 性 を 審 査 さ れ 許 可 さ れ た 。 2 - ２ ． 被 検 物 質 実 験 １ お よ び ２ 三 井 化 学 （ 株 ） の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ M W N T - 7 （ 現 在 は 保 土 ヶ 谷 化 学 工 業 （ 株 ） 取 扱 ） 実 験 ３ 国 際 対 ガ ン 連 合 （ U I C C ） 標 準 品 の ク ロ シ ド ラ イ ト 、 ク リ ソ タ イ ル お よ び ア モ サ イ ト 実 験 ４ ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ 。 実 験 １ − ２ と 同 じ M W N T - 7（ C と 省 略 ）、 日 機 装 （ 株 ）（ B と 省 略 ）、 和 光 純 薬 工 業 販 売 （ A お よ び D と 省 略 ）、 昭 和 電 工 （ 株 ）（ S D - 1 、 E と 省 略 ） お よ び 戸 田 工 業 （ 株 ）（ F と 省 略 ）。 A か ら F ま で の 順 番 は 、 便 宜 上 、 長 さ の 短 い 順 と し た 。 各 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 長 さ 、 直 径 、 純 度 お よ び 鉄 含 有 量 を 表 １ に 示 し た 。 ２ − ３ ． 投 与 用 懸 濁 液 各 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ あ る い は ア ス ベ ス ト は 、 腹 腔 内 投 与 で は 1 0 m L / k g 体 重 で 投 与 す る 投 与 懸 濁 液 に 目 的 の 被 検 物 質 の 重 量 （m g ） が 含 ま れ る 様 に 、 気 管 内 投 与 で は 1 m L / k g 体 重 で 投 与 す る 投 与 懸 濁 液 に 目 的 の 被 検 物 質 の 重 量（ m g ）が 含 ま れ る 様 に( 表 ２ ) 、 ２ ％ カ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス ナ ト リ ウ ム に 懸 濁 し 、 高 圧 蒸 気 滅 菌 し て 投 与 検 体 と し た 。 対 照 群 に は 、 高 圧 蒸 気 滅 菌 し た ２ ％ カ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス ナ ト リ ウ ム を 投 与 検 体 と し た 。 ２ − ４ ． 動 物
雌 雄 の C r l j : C D 1 ( I C R ) ( S P F グ レ ー ド ) を 、 日 本 チ ャ ー ル ス リ バ ー（ 株 ）か ら ４ − ６ 週 齢 で 購 入 し 、床 敷 き を 入 れ た プ ラ ス チ ッ ク 飼 育 箱 に 、 雄 は １ 匹 飼 い 、 雌 は 集 団 （ ３ − ４ 匹 ） 飼 い で 、 餌 （ 日 本 ク レ ア （ 株 ） 製 の 標 準 資 料 C E 2 ） と 水 （ 給 水 瓶 ） を 自 由 に 摂 取 さ せ た 。雄 ９ 週 齢 以 上 、雌 ８ − １ ２ 週 齢 で 、雌 雄 の マ ウ ス の 一 夜 同 居 に よ り 翌 朝 膣 栓 の み と め ら れ た 雌 を 、 妊 娠 ０ 日 と し て 、 以 後 、 １ 匹 飼 い に て 飼 育 し た 。 動 物 室 は 、 温 度 2 3 − 2 5 ℃ 、 相 対 湿 度 5 0 − 6 0 ％ 、 換 気 毎 時 1 0 回 、 1 2 時 間 明 暗 サ イ ク ル に 維 持 し た 。 実 験 に 用 い る 妊 娠 マ ウ ス は 、 投 与 日 の 体 重 が 投 与 群 間 で 均 等 に な る よ う に 、 適 宜 分 散 し て 用 い た 。 ２ − ５ ． 胎 仔 毒 性 実 験 ２ − ５ − １ ．多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与（ 実 験 １ ） 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ M W N T - 7 の 、２ 、３ 、４ あ る い は ５ m g / k g 体 重 と な る よ う に 腹 腔 内 注 射 で 、 妊 娠 ９ 日 の 午 前 中 、 妊 娠 マ ウ ス に 投 与 し た 。 被 投 与 マ ウ ス は 、 毎 日 、 体 重 と 餌 の 消 費 量 を 測 定 し 、一 般 症 状 を 観 察 し た 。妊 娠 1 8 日 の 午 前 中 に 、イ ソ フ ル ラ ン 麻 酔 下 で 、下 腿 静 脈 か ら E D T A 2 K 抗 凝 固 剤 入 り の 試 験 管 に 血 液 を 採 取 し 、 放 血 致 死 の 後 、 母 体 の 主 要 臓 器 （ 肝 、 腎 、 心 、 肺 、 脾 、 副 腎 、 胸 腺 ） の 重 量 を 測 定 し 、 子 宮 内 の 早 期 死 胚（ 着 床 痕 や 四 肢 の 形 成 前 の 不 定 形 の 固 ま り ）、 後 期 死 胚 （ 四 肢 形 成 後 の 死 亡 胎 仔 ） お よ び 生 存 胎 仔 の 位 置 お よ び 数 を 確 認 し た 。 生 存 胎 仔 は 、 雄 雌 の 外 性 器 で の 判 別 後 、 重 量 を 測 定 し 、 外 表 奇 形 の 検 査 後 、 腹 部 よ り 開 い て 、 主 要 臓 器 の 有 無 を 確 認 し 、 内 性 器 で の 雌 雄 の 再 確 認 後 、 9 5 ％ エ タ ノ
ー ル で １ 週 間 以 上 固 定 し た 。 新 鮮 血 で 、 自 動 血 球 計 数 装 置 （S Y S M E X K X 2 1 - N V 、 S Y S M E X 社 ） を 用 い て 、 白 血 球 数 、 赤 血 球 数 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 、 血 球 容 積 率 、 平 均 血 球 容 積 、 平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 量 、 平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 お よ び 血 小 板 数 を 測 定 し た 。 同 時 に 、 血 液 塗 抹 標 本 を 作 製 し 、 D i f f - Q u i k （ S Y S M E X 社 ） で 染 色 後 、 光 学 顕 微 鏡 下 で 、 白 血 球 百 分 率 を 計 数 し た 。白 血 球 サ ブ タ イ プ（ リ ン パ 球 、好 中 球 、 好 酸 球 お よ び 単 球 ） の 実 数 は 、 白 血 球 数 に 百 分 率 を か け て 算 出 し た 。 固 定 し た 胎 仔 は 、 表 皮 お よ び 背 面 上 部 の 筋 肉 を 除 去 し 、0 . 5 ％ K O H 溶 液 に 2 4 時 間 、0 . 5 % K O H / 0 . 0 0 2 % ア リ ザ リ ン R に 2 4 時 間 、0 . 5 % K O H / 2 0 % グ リ セ リ ン 溶 液 に 2 4 時 間 、5 0 % グ リ セ リ ン 溶 液 に 2 4 時 間 以 上 浸 漬 し た 後 、実 体 顕 微 鏡 下 で 骨 格 の 検 査 を し た 。 ２ − ５ − ２ ．多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 気 管 内 投 与（ 実 験 ２ ） 妊 娠 ９ 日 の 午 前 中 、 妊 娠 マ ウ ス を イ ソ フ ル ラ ン 吸 入 で 麻 酔 し 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ M W N T - 7 の 、３ 、４ あ る い は ５ m g / k g 体 重 と な る よ う に 、 気 管 内 噴 霧 注 入 ゾ ン デ （P e n n - C e n t u r y 社 、 M i c r o S p r a y e r M o d e l I A - 1 B ） で 、 吸 気 の タ イ ミ ン グ に あ わ せ て 気 管 内 に 投 与 し た 。 以 後 の 観 察 お よ び 検 査 は 、 実 験 １ に 同 じ で あ っ た 。 な お 、 母 体 解 剖 時 に 、 肺 に 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ に よ る 黒 色 化 を 認 め な か っ た 個 体 は 、 投 与 に 失 敗 し た と み な し て 、 実 験 群 か ら 削 除 し た 。 ２ − ５ − ３ ． ア ス ベ ス ト の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 ３ ） 被 検 物 質 で あ る ３ 種 の ア ス ベ ス ト を 、 腹 腔 内 注 射 で 、 4 0 m g / k g 体 重 と な る よ う に 、妊 娠 ９ 日 の 午 前 中 、妊 娠 マ ウ ス
に 投 与 し た 。以 後 の 観 察 お よ び 検 査 は 、実 験 １ に 同 じ で あ っ た 。 ２ − ５ − ４ ．サ イ ズ の 異 な る ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 ４ ） 表 １ に 示 し た サ イ ズ の 異 な る ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ を 、腹 腔 内 注 射 で 、4 m g / 1 0 m L / k g 体 重 と な る よ う に 、 妊 娠 ９ 日 の 午 前 中 、 妊 娠 マ ウ ス に 投 与 し た 。 投 与 直 前 と 、 投 与 ２ 時 間 後 の 母 体 直 腸 体 温 を シ チ ズ ン 社 製 の 電 子 体 温 計 で 測 定 し た 。体 温 予 測 機 能 付 き で あ っ た が 予 測 値 は 信 憑 性 に 乏 し か っ た の で 、 表 示 部 の 体 温 が 1 5 秒 間 一 定 値 を 示 す ま で 待 ち 、 そ の 値 を 体 温 と し た 。 ま た 、 投 与 ２ 時 間 後 に 、 母 体 の 尾 静 脈 を 注 射 針 で 穿 刺 し 、 末 梢 血 を 約 1 0 μ L 採 取 し 、 ３ μ L で 血 液 塗 抹 標 本 を 作 製 し 、 残 り を E L I S A キ ッ ト の サ ン プ ル 希 釈 液 ２ ０ ０ μL に 加 え て 冷 凍 （ − 2 0 ℃ ） 保 存 し た 。 以 後 の 観 察 お よ び 検 査 は 、 実 験 １ に 同 じ で あ っ た 。 ま た 、 投 与 ２ 時 間 後 の 血 液 塗 抹 標 本 の 処 理 は 、母 体 解 剖 時 の 血 液 塗 抹 標 本 に 同 じ で あ っ た 。 凍 結 保 存 し た 血 液 を 用 い て 、 後 日 、T h e r m o F i s c h e r S c i e n t i f i c 社 製 の E L I S A キ ッ ト ( E M 2 I L & 6 お よ び E M M C P 1 ) を 用 い て 、 イ ン タ ー ロ イ キ ン - 6 （ I L - 6 ） お よ び 単 球 走 化 性 因 子 （M C P - 1 ） の 濃 度 を 測 定 し た 。 ２ − ６ ． 統 計 解 析 数 値 の デ ー タ は S c h e f f e の 多 重 比 較 検 定 を 用 い て 、 頻 度 の デ ー タ は χ ２ 乗 検 定 を 用 い て 、 対 照 群 と 投 与 群 間 の 差 を 解 析 し 、 p 値 が 0 . 0 5 以 下 を 有 意 差 有 り と し た 。
３ ． 結 果 ３ − １ ． 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 １ ） 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ ２ − ５m g / k g 体 重 ） に よ り 、 投 与 の 翌 日 か ら 妊 娠 1 8 日 ま で 、 対 照 群 に 比 べ て 投 与 群 で 用 量 依 存 性 に 母 体 の 体 重 の 低 下 が 見 ら れ た が 、投 与 に よ る 母 体 の 死 亡 は 見 ら れ な か っ た 。妊 娠 指 標 の 変 化 と 奇 形 発 現 頻 度 を 表 ３ に 示 し た 。対 照 群 と 投 与 群 の ほ と ん ど の マ ウ ス は 妊 娠 し て い た 。 妊 娠 母 体 の １ 母 体 あ た り の 着 床 数 は 、 対 照 群 と 投 与 群 間 で 差 は な か っ た 。し か し 、着 床 数 に 対 す る 早 期 死 胚 の パ ー セ ン テ ー ジ は 、投 与 群 で 用 量 依 存 性 に 増 加 し 、 ４ お よ び ５m g / k g 体 重 投 与 群 で は 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 で あ っ た 。着 床 数 に 対 す る 後 期 死 胚 の パ ー セ ン テ ー ジ は 、投 与 に よ る 変 化 が な か っ た 。早 期 死 胚 の 増 加 に よ り 、投 与 群 で は 用 量 依 存 性 に １ 母 体 あ た り の 生 存 胎 仔 数 が 低 下 し 、４ お よ び ５ m g / k g 体 重 投 与 群 で は 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 で あ っ た（ 図 １ ）。 ま た 、投 与 群 で 用 量 依 存 性 に 生 存 胎 仔 を 有 す る 母 体 の 頻 度 が 低 下 し 、４ お よ び ５m g / k g 体 重 投 与 群 で は 、そ の 頻 度 の 低 下 は 対 照 群 に 比 べ て 有 意 で あ っ た 。生 存 胎 仔 の 重 量 は 、雌 雄 と も 、２ 、３ お よ び ４m g / k g 体 重 投 与 群 で ほ ぼ 用 量 依 存 性 に 低 下 し 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 で あ っ た （ 図 ２ ）。 ５ m g / k g 体 重 投 与 群 で 生 存 胎 仔 重 量 の 低 下 が 用 量 に 比 し て 少 な く 、対 照 群 と の 有 意 な 差 が 認 め ら れ な か っ た の は 、生 存 胎 仔 数 が 極 端 に 低 下 し 、か え っ て １ 胎 仔 あ た り の 栄 養 が 行 き 届 い て 発 育 が 良 く な っ た た め と 思 わ れ る 。 生 存 胎 仔 を 有 し た 母 体 中 の 外 表 奇 形 を 有 し た 母 体 の 頻 度
が 、４m g / k g 体 重 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。 群 の 総 生 存 胎 仔 中 の 外 表 奇 形 仔 の 頻 度 が 、全 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た （ 図 ３ ）。 ま た 、 生 存 胎 仔 を 有 し た 母 体 中 の 骨 格 奇 形 を 有 し た 母 体 の 頻 度 が 、全 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。群 の 総 生 存 胎 仔 中 の 骨 格 奇 形 仔 の 頻 度 が 、全 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た（ 図 ４ ）。 外 表 奇 形 検 査 で は 、 無 尾 あ る い は 短 尾 、 口 蓋 列 や 四 肢 の 形 成 不 全 （ 写 真 １B ） な ど が 認 め ら れ た 。 骨 格 検 査 で は 、 外 表 奇 形 に 合 っ た 指 骨 の 欠 損 や 肢 骨 の 欠 損 に 加 え て 、肋 骨 の 癒 合 、脊 椎 の 癒 合 、指 骨 の 過 剰 な ど の 骨 格 奇 形 が 認 め ら れ た 。 投 与 群 の 母 体 の 肝 臓 、 腎 臓 、 心 臓 、 肺 、 副 腎 お よ び 胸 腺 の 重 量 は 、 対 照 群 と 比 べ て 変 化 は な か っ た 。 し か し 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 ２ − ５m g / k g 体 重 投 与 に よ り 、 対 照 群 に 比 べ て 、用 量 依 存 性 に 、脾 臓 重 量 が 有 意 に 増 加 し た（ 図 ５ ）。 脾 臓 は 骨 髄 と と も に 血 球 数 制 御 や 造 血 を 司 る 器 官 で あ る こ と か ら 、 血 球 検 査 に よ り 血 球 に 対 す る 影 響 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ 腹 腔 内 投 与 群 の 赤 血 球 数 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 、 血 球 容 積 率 、 平 均 血 球 容 積 、 平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 量 、平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 お よ び 血 小 板 数 は 、 対 照 群 と 比 べ て な ん ら 変 化 は な か っ た 。 し か し 、 白 血 球 総 数 は 、多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ 投 与 群 で ２ 、３ お よ び ４m g / k g 体 重 投 与 群 で 対 照 群 の 約 ２ 倍 に 上 昇 し 、 3 m g / k g 体 重 投 与 群 で 対 照 群 と 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。白 血 球 サ ブ タ イ プ で は 、リ ン パ 球 数 は 投 与 に よ り 変 化 せ ず 、好 中 球 数 お よ び 好 酸 球 数 が 、２ 、３ お よ び ４m g / k g 体 重 群 で 対 照 群 に 比 べ て
有 意 に 高 か っ た （ 図 ６ ）。 他 に 、 特 記 す べ き 点 と し て 、 腹 腔 内 各 臓 器 表 面 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ 付 着 に よ る 黒 色 化 と 、 胸 腔 内 の 縦 隔 洞 リ ン パ 節 の 腫 脹 と 黒 色 化 が 見 ら れ た 。 ３ − ２ ． 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 気 管 内 投 与 （ 実 験 ２ ） 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 気 管 内 投 与 （ ３ − ５m g / k g 体 重 ） に よ り 、 投 与 の 翌 日 か ら 妊 娠 1 8 日 ま で 、 対 照 群 に 比 べ て 、５m g / k g 体 重 投 与 群 で 体 重 の 低 下 が 見 ら れ た 。投 与 に よ る 母 体 の 死 亡 は 見 ら れ な か っ た 。妊 娠 指 標 の 変 化 と 奇 形 発 現 頻 度 を 表 ４ に 示 し た 。対 照 群 と 投 与 群 の ほ と ん ど の マ ウ ス は 妊 娠 し て い た 。妊 娠 母 体 の １ 母 体 あ た り の 着 床 数 は 、対 照 群 と 投 与 群 間 で 差 は な か っ た 。着 床 数 に 対 す る 早 期 死 胚 の パ ー セ ン テ ー ジ は 、４ お よ び ５ m g / k g 体 重 投 与 群 で 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た が 、 対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た （ 図 ７ ）。 着 床 数 に 対 す る 後 期 死 胚 の パ ー セ ン テ ー ジ は 、５m g / k g 体 重 投 与 群 で 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た が 、対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た 。１ 母 体 あ た り の 生 存 胎 仔 数 は 、５m g / k g 体 重 投 与 群 で 減 少 す る 傾 向 が 見 ら れ た が 、対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た 。生 存 胎 仔 を 有 す る 母 体 の 頻 度 は 、投 与 に よ る 変 化 は 見 ら れ な か っ た 。 生 存 胎 仔 の 重 量 は 、 雌 雄 と も 、 ３ 、 ４ お よ び ５ m g / k g 体 重 投 与 群 で 用 量 依 存 性 に 低 下 し 、５ m g / k g 体 重 投 与 群 で 対 照 群 に 比 べ て 有 意 で あ っ た （ 図 ８ ）。 生 存 胎 仔 を 有 し た 母 体 中 の 外 表 奇 形 を 有 し た 母 体 の 頻 度 が 、４ お よ び ５m g / k g 体 重 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。群 の 総 生 存 胎 仔 数 の 外 表 奇 形 仔 の 頻 度 が 、４ お よ び ５m g / k g 体 重 投 与 群 で 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た
（ 図 ９ ）。 ま た 、 生 存 胎 仔 を 有 し た 母 体 中 の 骨 格 奇 形 を 有 し た 母 体 の 頻 度 が 、４ お よ び ５m g / k g 体 重 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。群 の 総 生 存 胎 仔 数 の 骨 格 奇 形 仔 の 頻 度 が 、４ お よ び ５m g / k g 体 重 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た （ 図 １ ０ ）。 外 表 奇 形 検 査 で は 、 無 尾 あ る い は 短 尾 、口 蓋 列 や 四 肢 の 形 成 不 全（ 写 真 １A ）な ど が 認 め ら れ た 。 骨 格 検 査 で は 、外 表 奇 形 に 合 っ た 指 骨 の 欠 損 や 肢 骨 の 欠 損 に 加 え て 、 肋 骨 の 癒 合 、 脊 椎 の 癒 合 ( 写 真 １ C ) 、 指 骨 の 過 剰 な ど が 認 め ら れ た 。 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 気 管 内 投 与 群 の 母 体 の 肝 臓 、 腎 臓 、 心 臓 、 副 腎 お よ び 胸 腺 の 重 量 は 、 対 照 群 と 比 べ て 変 化 は な か っ た 。し か し 、多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 気 管 内 投 与 に よ り 、５m g / k g 体 重 投 与 群 の 肺 重 量 が 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。全 投 与 群 の 肺 に は 、気 管 支 を 中 心 に 黒 い 着 色 が 肉 眼 で 観 察 さ れ た 。脾 臓 重 量 は 、４ お よ び ５m g / k g 体 重 投 与 群 で 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た が 、対 照 群 と の 有 意 差 は な か っ た 。多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ 気 管 内 投 与 群 の 赤 血 球 数 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 、 血 球 容 積 率 、 平 均 血 球 容 積 、 平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 量 、平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 お よ び 血 小 板 数 は 、 対 照 群 と 比 べ て 変 化 は な か っ た 。 し か し 、 白 血 球 総 数 は 、 ４ お よ び ５m g / k g 体 重 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 増 加 し た （ 図 １ １ ）。 白 血 球 サ ブ タ イ プ は 、 好 酸 球 が 投 与 群 で 若 干 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た が 、 対 照 群 と の 有 意 差 は な か っ た 。 実 験 １ お よ び 実 験 ２ の 結 果 の 概 要 を 表 ５ に 示 し た 。腹 腔 内 投 与 の １ m g / k g 体 重 群 は 予 備 実 験 （ 0 . 2 、 1 . 0 、 5 . 0 m g / k g 体 重
を 投 与 ） の 1 . 0 m g / k g 体 重 を 参 照 し た 。 ３ − ３ . ア ス ベ ス ト の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 ３ ） ３ 種 の ア ス ベ ス ト の 腹 腔 内 投 与（4 0 m g / k g 体 重 ）に よ り 、 投 与 翌 日 か ら 数 日 間 、す べ て の 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 較 し て 母 体 体 重 の 低 下 が 見 ら れ 、ク リ ソ タ イ ル 投 与 群 で 投 与 翌 日 か ら ５ 日 間 の 体 重 が 、対 照 群 よ り 有 意 に 低 か っ た 。投 与 に よ る 母 体 の 死 亡 は 見 ら れ な か っ た 。妊 娠 指 標 の 変 化 と 奇 形 発 現 頻 度 を 表 ６ に 示 し た 。対 照 群 と 投 与 群 の ほ と ん ど の マ ウ ス は 妊 娠 し て い た 。妊 娠 母 体 の １ 母 体 あ た り の 着 床 数 は 、対 照 群 と 投 与 群 間 で 、有 意 な 差 は な か っ た 。着 床 数 に 対 す る 早 期 死 胚 の パ ー セ ン テ ー ジ は 、ク ロ シ ド ラ イ ト 投 与 群 、ク リ ソ タ イ ル 投 与 群 お よ び ア モ サ イ ト 投 与 群 で 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た が 、 対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た （ 図 １ ２ ）。 し か し 、 早 期 死 胚 を 有 す る 母 体 の 頻 度 が 、ク リ ソ タ イ ル 投 与 群 お よ び ア モ サ イ ト 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た（ 図 １ ３ ）。 着 床 数 に 対 す る 後 期 死 胚 の パ ー セ ン テ ー ジ は 、 す べ て の ア ス ベ ス ト 投 与 群 で 、 対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た 。 １ 母 体 あ た り の 生 存 胎 仔 数 は ク ロ シ ド ラ イ ト 投 与 群 、ク リ ソ タ イ ル 投 与 群 お よ び ア モ サ イ ト 投 与 群 で 低 下 す る 傾 向 が 見 ら れ 、着 床 数 に 対 す る 生 存 胎 仔 数 の パ ー セ ン テ ー ジ が 、ク ロ シ ド ラ イ ト 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 低 か っ た（ 図 １ ２ ）。 生 存 胎 仔 重 量 は 、 す べ て の ア ス ベ ス ト 投 与 群 で 、 対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た 。 生 存 胎 仔 を 有 し た 母 体 中 の 外 表 奇 形 を 有 し た 母 体 の 頻 度 が 、 ア モ サ イ ト 投 与 群 で 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。
群 の 総 胎 仔 数 中 の 外 表 奇 形 仔 の 頻 度 が 、ア モ サ イ ト 投 与 群 で 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た （ 図 １ ４ ）。 ま た 、 生 存 胎 仔 を 有 し た 母 体 中 の 骨 格 奇 形 を 有 し た 母 体 の 頻 度 が 、ク リ ソ タ イ ル 投 与 群 お よ び ア モ サ イ ト 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。群 の 総 胎 仔 数 中 の 骨 格 奇 形 仔 の 頻 度 が 、す べ て の ア ス ベ ス ト 投 与 群 で 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た（ 図 １5 ）。観 察 さ れ た 奇 形 は 、眼 瞼 開 裂 、顔 面 裂 や 四 肢 の 形 成 不 全 、 無 尾 な ど の 外 表 奇 形 と 、 指 骨 の 欠 損 、 尾 椎 の 不 整 欠 損 、 肋 骨 の 癒 合 、 脊 椎 の 癒 合 な ど の 骨 格 奇 形 で あ っ た 。 ３ 種 の ア ス ベ ス ト 投 与 群 の 母 体 の 腎 臓 、副 腎 お よ び 胸 腺 の 重 量 は 、 対 照 群 と 比 べ て 変 化 は な か っ た 。 し か し 、 ク ロ シ ド ラ イ ト 投 与 群 と ア モ サ イ ト 投 与 群 の 肝 臓 重 量 と 脾 臓 重 量（ 図 １ ６ ） が 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た 。 ３ 種 の ア ス ベ ス ト 投 与 群 の 赤 血 球 数 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 、 血 球 容 積 率 、 平 均 血 球 容 積 、平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 量 、平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 お よ び 血 小 板 数 は 、対 照 群 と 比 べ て 変 化 は な か っ た 。し か し 、白 血 球 総 数 は 、ク ロ シ ド ラ イ ト 投 与 群 と ア モ サ イ ト 投 与 群 で 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 増 加 し た （ 図 １ ７ ）。 白 血 球 サ ブ タ イ プ は 、好 中 球 数 が ク ロ シ ド ラ イ ト 投 与 群 と ア モ サ イ ト 投 与 群 で 、 対 照 群 と 比 べ て 有 意 に 増 加 し た 。 ま た 、 ア モ サ イ ト 投 与 群 で は 、単 球 数 も 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 増 加 し た 。 ３ − ４ . サ イ ズ の 異 な る ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ 実 験 ４ ） ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 （ 4 m g / k g 体 重 ） ２ 時 間 後 の 母 体 の 直 腸 体 温 は 、 B 投 与 群 と C 投 与 群 で
最 も 低 下 し た （ 有 意 差 あ り ）。 次 に D 投 与 群 と E 投 与 群 で も 有 意 に 低 下 し て い た が 、A 投 与 群 と F 投 与 群 で は 、 わ ず か に 低 下 し た だ け で 対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た （ 図 １ ８ ）。 投 与 ２ 時 間 後 の 、 白 血 球 百 分 率 は 、D 投 与 群 で 、 対 照 群 と 比 べ て 、 リ ン パ 球 の パ ー セ ン テ ー ジ が 有 意 に 低 下 し 、 好 中 球 の パ ー セ ン テ ー ジ が 有 意 に 上 昇 し て い た 。次 い で 、B 群 、C 群 、 E 群 お よ び F 群 が 同 様 傾 向 を 示 し （ 有 意 差 な し ）、 A 群 で は 、 最 も 変 化 が 少 な か っ た 。 ま た 、 好 酸 球 の パ ー セ ン テ ー ジ が 、 B 群 C 群 で 上 昇 す る 傾 向 が 見 ら れ た （ 有 意 差 な し ）。 投 与 ２ 時 間 後 の 母 体 血 中 I L - 6 濃 度 お よ び M C P - 1 濃 度 は 、 B 群 と C 群 で 著 し く 、対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 上 昇 し 、次 い で 、 D 群 お よ び E 群 で 上 昇 し （ 有 意 差 は な し ）、 A 群 お よ び F 群 で は 上 昇 は 軽 微 で あ っ た （ 図 １ ９ ）。 投 与 翌 日 、B 群 お よ び C 群 の 母 体 の 体 重 が 、 対 照 群 に 比 べ て 著 し く 有 意 に 低 下 し た 。 ま た 、D 群 お よ び E 群 の 母 体 の 体 重 も 対 照 群 に 比 べ て 低 下 し た 。し か し 、A 群 お よ び F 群 で は 、 投 与 後 の 体 重 低 下 は 見 ら れ な か っ た 。 E 群 の 母 体 が ２ 例 、 投 与 １ 日 後 と ３ 日 後 に 死 亡 し た 。 検 死 解 剖 で は 、 子 宮 内 に 著 し い 出 血 が 認 め ら れ た 。 妊 娠 指 標 の 変 化 を 表 ７ に 示 し た 。 対 照 群 と 投 与 群 の ほ と ん ど の マ ウ ス は 妊 娠 し て い た 。 妊 娠 母 体 あ た り の 着 床 数 は 、対 照 群 と 投 与 群 間 で 、有 意 な 差 は な か っ た 。 着 床 数 に 対 す る 早 期 死 胚 の パ ー セ ン テ ー ジ は 、 B 投 与 群 で 1 0 0 ％ 、 C 投 与 群 で 5 9 ％ と 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 増 加 し 、 D 投 与 群 と E 投 与 群 で 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た が 、 有 意 差 は な か っ た （ 図 ２ ０ ）。 早 期 死 胚 を 有 す る 母 体 の 頻 度 は 、B 投 与
群 、 C 投 与 群 、 D 投 与 群 、 E 投 与 群 お よ び F 投 与 群 で 、 対 照 群 に く ら べ て 有 意 に 高 か っ た が 、A 投 与 群 で は 有 意 差 は な か っ た（ 表 ７ ）。着 床 数 に 対 す る 後 期 死 胚 の パ ー セ ン テ ー ジ お よ び 後 期 死 胚 を 有 す る 母 体 の 頻 度 は 、 す べ て の 投 与 群 で 対 照 群 と 比 べ て 有 意 差 は な か っ た（ 表 ７ ）。母 体 あ た り の 生 存 胎 仔 数 は 、 B 投 与 群 （ ゼ ロ ） お よ び C 投 与 群 で 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 低 く 、D 投 与 群 と E 投 与 群 で 低 下 す る 傾 向 が 見 ら れ た が 、 有 意 差 は な か っ た （ 図 ２ ０ ）。 投 与 群 の 母 体 の 腎 臓 、 副 腎 お よ び 胸 腺 の 重 量 は 、 対 照 群 と 比 べ て 変 化 は な か っ た 。 し か し 、 脾 臓 重 量 が 、B 投 与 群 と C 投 与 群 で 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 高 く 、D 投 与 群 と E 投 与 群 で 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た （ 図 ２ １ ）。 投 与 群 の 赤 血 球 数 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 、 血 球 容 積 率 、 平 均 血 球 容 積 、 平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 量 、 平 均 血 球 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 お よ び 血 小 板 数 は 、 対 照 群 と 比 べ て 変 化 は な か っ た 。 し か し 、 白 血 球 総 数 は 、 C 投 与 群 で 、 対 照 群 に 比 べ て 有 意 に 増 加 し 、 次 い で B 投 与 群 で 高 い 傾 向 が あ っ た が 有 意 差 は な か っ た（ 図 ２ ２ ）。白 血 球 サ ブ タ イ プ で は 、B 投 与 群 の 好 中 球 数 、 C 投 与 群 の 好 中 球 数 、 好 酸 球 数 お よ び 単 球 数 が 、D 投 与 群 の 好 酸 球 数 が 、 対 照 群 と 比 べ て 有 意 に 増 加 し た 。 ４ ． 考 察 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 実 験 （ 実 験 １ ） と 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 腹 腔 内 投 与 実 験 （ 実 験 ２ ） の 概 要 を 表 ５ に ま と め た 。 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ は 、 腹 腔 内 投 与
お よ び 気 管 内 投 与 で 、 用 量 依 存 性 に 催 奇 形 性 お よ び 早 期 死 胚 の 増 加 を も た ら し た 。１ ２ ） こ れ は 、 ナ ノ チ ュ ー ブ に よ る 催 奇 形 性 お よ び 胎 死 毒 性 に つ い て の 、 世 界 で 初 の 報 告 で あ っ た 。 奇 形 発 現 あ る い は 早 期 死 胚 の 増 加 な ど の 胎 仔 毒 性 の 、 腹 腔 内 投 与 に お け る 最 低 有 効 投 与 量 は ２m g / k g 体 重 、 気 管 内 投 与 に お け る 最 低 有 効 投 与 量 は ４ m g / k g 体 重 で あ っ た 。 ま た 、 腹 腔 内 投 与 に お け る 最 大 無 作 用 量 は １m g / k g 体 重 、 気 管 内 投 与 に お け る 最 大 無 作 用 量 は ３m g / k g 体 重 で あ っ た 。 こ れ は 、 農 薬 ・ 食 品 添 加 物 等 に お け る N O A E L : N o O b s e r v e d A d v e r s e E f f e c t s L e v e l に 相 当 し 、 こ の 実 験 で は 、 食 餌 中 の 濃 度 L e v e l で は な く 、 単 回 の 体 重 あ た り の 投 与 量 で あ る 。 腹 腔 内 投 与 実 験 、 気 管 内 投 与 実 験 と も に 、 有 効 投 与 量 の 投 与 群 で 、 白 血 球 総 数 の 増 加 、 あ る い は 白 血 球 サ ブ タ イ プ の 好 中 球 と 好 酸 球 な ど の 炎 症 性 血 球 の 増 加 や 脾 臓 重 量 の 増 加 が 見 ら れ た 。 有 効 投 与 量 が 腹 腔 内 投 与 と 気 管 内 投 与 と で わ ず か ２ 倍 の 違 い で あ り 、観 察 さ れ た 奇 形 の タ イ プ も 異 な ら ず 、 胎 仔 毒 性 に 伴 う 母 体 の 炎 症 性 反 応 も 同 様 に 見 ら れ た こ と か ら 、 腹 腔 内 投 与 が 気 管 内 投 与 で の 母 体 お よ び 胎 仔 へ の 影 響 を 模 し て い る と 考 え 、 以 後 の 実 験 を 、 母 体 に 負 担 が 少 な く 、 簡 便 で 確 実 に 投 与 が 出 来 る 腹 腔 内 投 与 で 行 う こ と と し た 。 気 管 内 投 与 実 験 で は 、 投 与 に 失 敗 し た 個 体 を 各 実 験 群 か ら 削 除 す る な ど の 無 駄 が 出 て 、動 物 実 験 倫 理 に 反 す る 点 と 、実 験 群 間 の 母 体 数 の 変 動 、 例 え ば 気 管 内 投 与 ４m g / k g 体 重 群 で は １ ５ 母 体 に 対 し 気 管 内 投 与 ５ m g / k g 体 重 群 で は ５ 母 体 と い う ば ら つ き 、 が 実 験 結 果 の 信 頼 性 を 多 少 な り と も 損 な い 、 統 計 解 析 時 の 有 意 差 の 判 定 を 困 難 に さ せ る 点 、 と い う ２ 点 が 避 け ら れ な い 事 も 要 因 で あ る 。
腹 腔 内 投 与 実 験 に お い て 、 母 体 解 剖 時 に 観 察 さ れ た 胸 腔 内 の 縦 隔 洞 リ ン パ 節 の 腫 脹 と 黒 色 化 に よ り 、 腹 腔 内 に 投 与 さ れ た 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 少 な く と も 一 部 は 、 リ ン パ あ る い は 血 流 に の っ て 体 内 を 移 動 し た と 推 測 さ れ た 。 ま た 、 す で に 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ と 類 似 し た 形 体 （ 高 ア ス ペ ク ト 比 ） を 持 つ ア ス ベ ス ト に つ い て は 、 胎 盤 通 過 と 胎 児 ・ 胎 仔 へ の 移 行 が 確 認 さ れ て い る 。８ — １ １ ）そ こ で 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 催 奇 形 性 と 死 胚 増 加 の 作 用 機 序 の 解 明 の 一 助 に な る だ ろ う と い う 予 測 と 、 ア ス ベ ス ト に よ る 胎 仔 毒 性 の 有 無 を 確 認 す る 事 が 必 要 で あ る と い う 、 二 つ の 理 由 で 、 実 験 ３ で ア ス ベ ス ト の 催 奇 形 性 試 験 を 行 っ た 。 鉱 物 で あ る ア ス ベ ス ト に お い て も 、 有 機 物 で あ る 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ と 同 様 の 催 奇 形 性 や 早 期 死 胚 の 増 加 が 認 め ら れ 、 さ ら に 、 母 体 の 炎 症 性 反 応 も 同 様 に 見 ら れ た 。１ ３ ）こ れ は 、 ア ス ベ ス ト に よ る 催 奇 形 性 お よ び 胎 死 毒 性 に つ い て の 、 世 界 で 初 の 報 告 で あ っ た 。 こ こ に 述 べ た ３ 種 の ア ス ベ ス ト （ ク ロ シ ド ラ イ ト 、 ク リ ソ タ イ ル お よ び ア モ サ イ ト ） の 投 与 量 は 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 投 与 量 の 約 １ ０ 倍 で あ る 。 予 備 実 験 と し て 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ と 同 重 量 の ４ m g / k g 体 重 の 腹 腔 内 投 与 実 験 を 行 っ た が 、有 意 な 奇 形 発 現 や 死 胚 増 加 を 認 め な か っ た 。 実 験 計 画 策 定 当 時 （2 0 1 2 年 ）、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 密 度 は 、ア ス ベ ス ト の 密 度（ 2 . 4 - 3 . 2 5 g / c m3）と ほ ぼ 同 等 の 1 . 8 - 2 . 0 g / c m3 と 製 品 情 報 に 記 載 さ れ て い た が 、 こ れ は 、 グ ラ フ ェ ン シ ー ト（ 炭 素 １ 層 の 結 晶 構 造 の ナ ノ シ ー ト ）と し て の 密 度 で あ り 、 グ ラ フ ェ ン シ ー ト が 筒 状 に な っ た カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 直 径
2 - 1 0 ナ ノ メ ー ト ル の 中 空 部 分 を 無 視 し た 値 で あ っ た 。わ ず か に １ 社 の み 、『 嵩 密 度 （ b u l k d e n s i t y ）』 と い う 「 実 際 に 一 定 の 空 間 （ １ c m3） を 占 め て い る 物 の 重 さ 」 と し て 0 . 1 4 - 0 . 2 8 g / c m3 を 表 示 し て お り 、 こ の 値 に 基 づ く と 、 鉱 物 で あ り 中 空 を 持 た な い ア ス ベ ス ト 繊 維 は 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ と 同 重 量 で は 、 繊 維 数 （ あ る い は 繊 維 長 ） が 著 し く 少 な い （ 写 真 ２ ） こ と に な る 。 ア ス ベ ス ト の 中 皮 腫 発 現 の 作 用 機 序 と し て 、 繊 維 の 数 が 問 題 視 さ れ て い る こ と か ら 、 催 奇 形 性 と 胎 仔 毒 性 に つ い て も 、 同 じ こ と を 予 測 し て 、 あ え て 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の １ ０ 倍 重 量 の （ 写 真 ３ ） 投 与 量 で 実 験 を 行 っ た 結 果 、 ３ 種 の ア ス ベ ス ト の い ず れ に お い て も 、 奇 形 発 現 と 死 胚 の 増 加 を 認 め た 。 中 皮 腫 発 現 の 作 用 機 序 と し て 、炎 症 の 持 続 が 推 定 さ れ て お り 、 実 験 １ か ら ３ ま で の 結 果 か ら 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ と ア ス ベ ス ト の 催 奇 形 性 お よ び 死 胚 の 増 加 に つ い て も 、 母 体 に お け る 炎 症 性 反 応 と の 関 連 が 可 能 性 と し て 示 唆 さ れ た 。 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の ラ ッ ト に お け る 中 皮 腫 発 現 作 用 に は 、 製 品 間 で 著 し い 差 異 が あ る こ と が 知 ら れ て お り 、 そ の 差 異 が 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 長 さ に 依 存 す る と 推 測 さ れ て い る 。 マ ウ ス に お け る 催 奇 形 性 お よ び 死 胚 の 増 加 に つ い て 、 同 様 な 差 異 が あ る か ど う か を 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 長 さ の 異 な る ６ 種 の 製 品 で 、 胎 仔 毒 性 を 比 較 検 討 す る 必 要 が あ る と 考 え て 実 験 ４ を 行 っ た 。 ま た 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ お よ び ア ス ベ ス ト に よ る 死 胚 の 増 加 は 、 早 期 死 胚 に 限 ら れ て い た 。 実 験 方 法 の 部 で す で に 述 べ た よ う に 、 早 期 死 胚 と は 、 四 肢 の 形 成 の 完 成 前 に 死 亡 し た 胚 で あ る 。 過 去 の 東 京 都 立 衛 生 研 究 所 毒 性 部 時 代 か
ら 現 在 の 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 生 体 影 響 研 究 科 ま で お け る 、様 々 な 化 合 物 の 催 奇 形 性 お よ び 胎 仔 毒 性 の 研 究 実 績１ ４ — １ ７ ） か ら 、 マ ウ ス に お け る 妊 娠 ９ 日 が 四 肢 の 形 成 時 期 に あ た る こ と が 明 ら か で 、 こ の 時 期 （ 妊 娠 ９ 日 ） に 毒 性 の あ る 化 合 物 を 投 与 す る と 、 特 異 的 に 、 四 肢 の 形 成 不 全 奇 形 が 検 出 さ れ る 。 す な わ ち 、 妊 娠 の 他 の 時 期 （ 妊 娠 ６ — ８ 日 や 妊 娠 １ ０ — １ ５ 日 ） で は 、 四 肢 の 形 成 不 全 奇 形 は 発 現 し な い 。 実 験 １ か ら ３ で 、 腹 腔 内 や 気 管 内 に 投 与 さ れ た 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ や ア ス ベ ス ト が 、 妊 娠 １ ８ 日 の 母 体 解 剖 時 ま で 、（ お そ ら く 大 部 分 が ）投 与 さ れ た 部 位 内 に 留 ま っ て い る の が 観 察 さ れ 、 母 体 に お け る こ れ ら 投 与 物 質 の 暴 露 は 、 妊 娠 １ ８ 日 ま で 継 続 さ れ て い た 状 態 で あ る と 考 え ら れ る 。し か し 、妊 娠 １ ０ − １ １ 日 で 特 異 的 に 見 ら れ る 口 唇 裂 （ い わ ゆ る ウ サ ギ 口 ） は 観 察 さ れ ず 、 ま た 、 四 肢 形 成 後 の （ 妊 娠 １ ０ 日 以 降 で 起 き る ）後 期 死 胚 は 、全 く 増 加 し て い な か っ た 。 こ の 結 果 か ら 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ と ア ス ベ ス ト は 、 妊 娠 ９ 日 の 投 与 直 後 だ け に 特 異 的 に 作 用 し て い る 事 が 示 唆 さ れ た 。 実 験 １ か ら ３ で 、 催 奇 形 性 や 死 胚 の 増 加 を も た ら し た 投 与 群 に お け る 母 体 の 炎 症 性 反 応 が 明 ら か に な っ た が 、 そ れ は 、 妊 娠 １ ８ 日 に お け る 観 察 で あ っ た の で 、 母 体 の 炎 症 性 反 応 と 催 奇 形 性 お よ び 死 胚 の 増 加 の 関 係 を 詳 し く 検 討 す る た め に は 、 投 与 直 後 の （ 妊 娠 ９ 日 内 の ） 母 体 に つ い て 調 べ る 必 要 が あ る と 考 え ら れ た 。 そ こ で 、 実 験 ４ で は 、 投 与 ２ 時 間 後 の 母 体 の 状 況 を 検 討 す る た め に 、 直 腸 体 温 の 測 定 と 白 血 球 百 分 率 の 観 察 お よ び 血 中 サ イ ト カ イ ン 、 ケ モ カ イ ン の 測 定 を 試 み た 。 ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 4 m g / k g 体 重 の 腹 腔 内 投
与 に よ る 母 体 の 反 応 は 、 著 し く 異 な っ て い た 。１ ８ ）投 与 後 ２ 時 間 の 白 血 球 百 分 率 に お け る 変 化 お よ び 傾 向 に つ い て 以 下 の 様 に 考 え る こ と が 出 来 る 。 実 験 １ か ら ３ の 母 体 解 剖 時 の 白 血 球 サ ブ タ イ プ 分 析 結 果 か ら 、投 与 群 に お け る リ ン パ 球 数 は 変 化 せ ず に 、 好 中 球 数 や 好 酸 球 数 の 増 加 に よ っ て 、 総 白 血 球 数 増 加 を ま ね い て い た 事 が あ き ら か で あ っ た 。 そ こ で 、 仮 に 、 投 与 ２ 時 間 後 に お け る リ ン パ 球 数 が 変 わ ら な か っ た と し た ら 、（ 相 対 的 な ）好 中 球 ％ の 増 加 は 白 血 球 総 数 の 増 加 を 示 唆 し て い る と 推 測 さ れ る 。 母 体 血 中 の サ イ ト カ イ ン 、 ケ モ カ イ ン に つ い て は 、 予 備 実 験 と し て C （ 実 験 １ お よ び ２ で 使 用 し た 製 品 ） の 腹 腔 内 投 与 後 の 妊 娠 母 体 血 中 の 、 イ ン タ ー ロ イ キ ン - 1 β 、 - 2 、 - 4 、 - 6 、 - 1 0 、 - 1 2 、 - 1 8 お よ び 好 中 球 走 化 性 因 子 - 1 （ C I N C - 1 ： げ っ 歯 類 に お い て 、 ヒ ト の イ ン タ ー ロ イ キ ン- 8 と 同 じ と 考 え ら れ て い る ）、 単 球 走 化 性 因 子 - 1 、 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - γ 、 腫 瘍 壊 死 因 子 - α を 測 定 し た 。 そ の 結 果 、 イ ン タ ー ロ イ キ ン- ６ （ I L - 6 ） お よ び 単 球 走 化 性 因 子- 1 （ M C P − １ ） が 、 対 照 群 に 比 べ て 数 百 倍 か ら 数 万 倍 に 上 昇 し て い た 。 C I N C - 1 も 、 対 照 群 と 比 べ て 有 意 に 上 昇 し て い た が 、 わ ず か 1 0 % 程 度 の 上 昇 で あ っ た 。 そ こ で 、 実 験 ４ で は 、 投 与 ２ 時 間 後 の I L - ６ お よ び M C P - 1 に 的 を し ぼ っ て 測 定 し た 。顆 粒 球 コ ロ ニ ー 刺 激 因 子 （G - C S F ） は 測 定 し な か っ た 。 そ の 理 由 は 、母 体 解 剖 時 の 好 中 球 数 と 好 酸 球 数 の 変 化 が 実 測 さ れ た こ と 、 投 与 ２ 時 間 後 の 白 血 球 百 分 率 観 察 を し た こ と 、 さ ら に 、 採 取 血 液 量 が 非 常 に 少 な か っ た こ と で あ る 。 実 験 ４ に 用 い た ６ 種 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 胎 仔 毒 性 と サ イ ズ 、 純 度 お よ び 鉄 含 量 と の 関 係 を 表 ８ に ま と め た 。 長 さ
が 2 . 0 μ m 以 下 の A は 胎 仔 毒 性 が な く 、 数 十 μ m 以 上 の F も 胎 仔 毒 性 が ほ と ん ど な く 、中 間 の 長 さ の B お よ び C は 胎 仔 毒 性 が 非 常 に 高 く 、D お よ び E は 胎 仔 毒 性 が 疑 わ れ た 。 直 径 の 太 い D と E は 胎 仔 毒 性 が 低 く 、 直 径 の 似 通 っ て い る （ 4 0 − 8 0 n m ） A 、 B 、 C 、 E の 中 で 、 A は 全 く 胎 仔 毒 性 が 見 ら れ な か っ た 。 純 度 の 低 い F は 胎 仔 毒 性 が な く 、 純 度 の 比 較 的 高 い A 、 B 、 C 、 D 、 E の 中 で 、A は 全 く 胎 仔 毒 性 が 見 ら れ な か っ た 。 酸 化 的 ス ト レ ス の 原 因 と な る と い わ れ る 鉄 の 含 量 の 高 い D と F は 、胎 仔 毒 性 が 低 か っ た 。 こ の よ う に 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 直 径 、 純 度 お よ び 鉄 含 量 は 、 胎 仔 毒 性 と は 無 関 係 で 、 ２ μm 以 上 数 十 μ m 以 下 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ が 、 胎 仔 毒 性 が 高 い よ う に 思 わ れ る 。 そ し て 、D お よ び E に つ い て は 、 直 径 が 大 き い 事 が 胎 仔 毒 性 を 弱 め て い る と い う 可 能 性 も 考 え ら れ る 。 な ぜ な ら 、 直 径 が １ ５ ０ n m 以 上 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ は 、 １ ５ ０ n m 以 下 の 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー よ り も 細 胞 毒 性 が 低 い と 報 告 さ れ て い る１ ９ ）か ら で あ る 。 ま た 、E 投 与 群 で 母 体 が ２ 例 死 亡 し て お り 、 子 宮 内 に 著 し い 出 血 が 見 ら れ た こ と か ら 、 胚 仔 の 死 亡 も あ っ た と 考 え ら れ 、 そ れ を 考 慮 す れ ば 、E も い く ぶ ん 胎 仔 毒 性 が あ る と い え る か も し れ な い 。 実 験 １ か ら ４ ま で の 、 胎 仔 毒 性 と 母 体 の 炎 症 性 反 応 な ど と の 関 係 を 表 ９ に ま と め た 。 ま ず 、 母 体 の 直 腸 体 温 は 、 胎 仔 毒 性 の な い D と E で も 観 察 さ れ て 、胎 仔 毒 性 と は 無 関 係 な 可 能 性 が あ る 。 あ る い は 、 胎 仔 毒 性 の あ っ た B 、 C で は 、 多 の 製 品 よ り 長 時 間 低 体 温 が 持 続 し た か も し れ な い 。 ま た 、 胎 仔 毒 性 の な か っ た D で 投 与 ２ 時 間 後 の 白 血 球 百 分 率 に 有 意 な 変 化 が 見 ら れ 、こ
れ に つ い て も 時 間 的 な 経 過 観 察 が 必 要 か と 感 じ ら れ る 。 経 時 的 観 察 の 必 要 性 は サ イ ト カ イ ン や ケ モ カ イ ン の 測 定 も 同 じ で あ る が 、 マ ウ ス の 負 担 を 考 慮 す る と 、 実 現 は 困 難 で あ っ た 。 マ ウ ス に お け る 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ （ C ） お よ び ア ス ベ ス ト （ ク ロ シ ド ラ イ ト ） の 投 与 後 の 持 続 的 炎 症 作 用 を 山 口 が 詳 し く 報 告 し て い る 。２ ０ ） し か し 、 そ の 報 告 で は 、 サ イ ト カ イ ン の m R N A 発 現 は 投 与 後 １ ４ 日 以 降 に つ い て し か 書 か れ て い な い 。 ま た 、 山 口 の 使 っ た マ ウ ス は 、 同 じ C r l j : C D 1 （ I C R ） マ ウ ス で あ る が 、 妊 娠 マ ウ ス で は な い 。 雄 マ ウ ス と 雌 マ ウ ス 、 そ し て 妊 娠 マ ウ ス は 、 免 疫 応 答 が 異 な る の で 、 山 口 の 報 告 と 今 回 の 実 験 で の 白 血 球 サ ブ タ イ プ の 変 化 が 異 な っ て い て も 、 矛 盾 は し な い 。 実 験 ４ を 行 っ た 理 由 は 、 中 皮 腫 の 発 現 が 製 品 間 で 異 な る と い う 結 果 が 、 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 生 体 影 響 研 究 科 内 で 得 ら れ て い た か ら で あ る が 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 中 皮 腫 発 現 と 胎 仔 毒 性 発 現 に 関 し て は 、 以 下 に 述 べ る 様 な 興 味 深 い 食 い 違 い が あ る 。 C は す で に ラ ッ ト お よ び 遺 伝 子 改 変 マ ウ ス で 中 皮 腫 の 発 生 が 報 告 さ れ て い る 。 ま た 、B お よ び E の 投 与 で も ラ ッ ト で 中 皮 腫 の 発 生 が 見 ら れ た と い う 情 報 （ 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 生 体 影 響 研 究 科 坂 本 、 私 信 ） も 得 て い る 。 し か し な が ら 、「p 5 3 遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス に お け る 中 皮 腫 発 現 」 ３ ）の 背 景 に は 、 遺 伝 子 改 変 し な い マ ウ ス で は 、 中 皮 腫 が 発 現 し な い と い う 事 実 が あ る （ 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 生 体 影 響 研 究 科 坂 本 、 高 橋 ， 藤 谷 、 私 信 ）。 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 胎 仔 毒 性 は 、ラ ッ ト で は 見 ら れ な か っ た（ 国 立 医 薬 品 食 品 安 全 研 究 所 小
林 、東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 生 体 影 響 研 究 科 小 縣 、私 信 ） と の 情 報 も あ る 。 す な わ ち 、 ラ ッ ト で は 長 期 の 炎 症 性 反 応 の 持 続 に よ る 中 皮 腫 の 発 現 が 見 ら れ る が 、 短 期 の （ 投 与 直 後 ） の 影 響 に よ る 胎 仔 毒 性 は 見 ら れ な い 。 一 方 、 マ ウ ス で は 、 長 期 の 炎 症 性 反 応 の 持 続 に よ る 中 皮 腫 の 発 現 が み ら れ ず 、 短 期 の （ 投 与 直 後 ） の 影 響 に よ る 胎 仔 毒 性 が 見 ら れ る 。 さ ら に 、 中 皮 腫 発 現 し て い た ラ ッ ト 個 体 で は 血 清 の I L - 6 濃 度 お よ び M C P - 1 濃 度 が （ 中 皮 腫 を 発 現 し て い な い ラ ッ ト に 比 べ て ） 有 意 に 高 い が 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 投 与 後 １ 週 の ラ ッ ト で は 、I L - 6 濃 度 も M C P - 1 濃 度 も 上 昇 し て い な か っ た（ 著 者 の 予 備 実 験 ）。一 方 、 マ ウ ス で は 、 長 期 （ 投 与 後 ４ 週 以 降 ） で は 、I L - 6 の 低 下 が 観 測 さ れ 、 短 期 （ 投 与 直 後 ） の I L - 6 は 上 昇 し て い る 。 こ の 、 I L - 6 と M C P - 1 に 象 徴 さ れ る 炎 症 性 反 応 と 毒 性 発 現 の 関 係 は 、 今 後 の 課 題 と 思 わ れ る 。 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ と ア ス ベ ス ト と い う 外 来 性 繊 維 状 異 物 に よ る 胎 仔 毒 性 の 作 用 機 序 と し て 、 ま ず 、 細 胞 分 裂 阻 害 作 用 が 考 え ら れ る 。 単 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ が 初 代 培 養 ヒ ト 気 道 表 皮 細 胞 に お い て 紡 錘 糸 の か く 乱 に よ り 異 数 倍 数 体 を 生 じ る と い う 報 告 が あ り 、２ １ ）ナ ノ チ ュ ー ブ の 束 が 紡 錘 糸 と 同 じ 様 な 直 径 を 持 っ て い て 、 紡 錘 糸 に カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ が 紛 れ 込 ん だ た め と 推 測 さ れ て い る 。 ア ス ベ ス ト の 腹 腔 内 投 与 後 ２ ４ 時 間 以 内 に 、 ア ス ベ ス ト を 貪 食 す る た め に 腸 間 膜 表 面 か ら 夥 し い マ ク ロ フ ァ ー ジ の 遊 離 が 起 き る と 報 告 さ れ て い る 。 ２ ２ ）実 験 １ 、 ２ お よ び ３ の 母 体 解 剖 時 に 、 胸 郭 内 の 縦 隔 洞 リ ン パ 節 の 腫 大 が 確 認 さ れ て 、 リ ン パ 流 あ る い は 血 流 に よ る 、 こ れ ら 繊 維 状 異 物
の 投 与 部 位 か ら の 母 体 内 移 動 が 推 測 さ れ て い る 。 ア ス ベ ス ト に つ い て は 、 す で に 胎 盤 通 過 と 胎 児 お よ び 胎 仔 へ の 移 行 が 確 認 さ れ て お り 、８ — １ １ ）多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ に お い て も 同 様 の こ と が 予 測 さ れ る 。 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ に は 細 胞 毒 性 ２ ３ ）、 ア ス ベ ス ト に は 細 胞 毒 性２ ４ ， ２ ５ ）お よ び 遺 伝 毒 性 ２ ６ — ２ ９ ） が あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 急 速 な 増 殖 を し て い る 胎 仔 の 細 胞 に 、こ れ ら の 繊 維 状 異 物 が 作 用 し て 細 胞 分 裂 を 阻 害 し た な ら 、 容 易 に 奇 形 あ る い は 胎 仔 の 死 亡 （ 死 胚 ） を も た ら す で あ ろ う 。 次 に 、 外 来 性 繊 維 状 異 物 に よ る 胎 仔 毒 性 の 作 用 機 序 と し て 考 え ら れ る の は 、 免 疫 抑 制 状 態 の か く 乱 で あ る 。 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ ３ ０ ）あ る い は ア ス ベ ス ト３ １ ）の 中 皮 腫 発 現 の 作 用 機 序 と し て 、 慢 性 の 炎 症 反 応 が 考 え ら れ て い る 。 実 際 に 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ や ア ス ベ ス ト を 投 与 さ れ て 奇 形 や 死 胚 を 生 じ 投 与 群 で は 、 母 体 の 白 血 球 数 （ 特 に 炎 症 に 関 与 す る サ ブ タ イ プ ） の 上 昇 が 観 察 さ れ た 。 実 験 ４ で 観 察 さ れ た 母 体 血 中 の I L - 6 や M C P - 1 の 上 昇 も 炎 症 反 応 の 活 性 化 を 示 唆 し て い る 。イ ン タ ー ロ イ キ ン − ２（ I L - 2 ）に は 胎 仔 毒 性 が あ る こ と が３ ２ ）わ か っ て お り 、 妊 娠 母 体 へ の 投 与 は 禁 忌 で あ る 。 そ こ で 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ で 母 体 血 中 濃 度 の 有 意 な 上 昇 が 認 め ら れ た 、（ マ ウ ス ） I L - 8 、 I L - 6 お よ び M C P - 1 を 、 妊 娠 ９ 日 の マ ウ ス に 腹 腔 内 投 与 し た が 、 胎 仔 毒 性 お よ び 母 体 毒 性 は 全 く 見 ら れ な か っ た （ デ ー タ は 示 し て い な い ）。し か し な が ら 、本 研 究 で 測 定 し な か っ た 他 の サ イ ト カ イ ン ・ ケ モ カ イ ン に つ い て は 、 胎 仔 毒 性 は 未 知 で あ り 、 今 後 の 検 討 が 必 要 で あ ろ う 。 い ず れ に し て も 、妊 娠 と い う の は 、母 体 の 中 に 、「 自 己 と は 異
な る 遺 伝 子 を 持 つ 生 体 の 育 成 を 拒 絶 し な い 」 と い う 、 極 度 に そ し て 微 妙 に 免 疫 系 を 抑 制 し た 状 態 で 成 り 立 つ 。 ３ ３ — ３ ５ ） こ の 微 妙 な バ ラ ン ス を 崩 す 様 な 、 免 疫 系 の 活 性 化 は 、 妊 娠 の 継 続 を 困 難 に さ せ 流 産 、 死 胚 が 起 き る と 考 え ら れ る 。 総 括 近 年 、 様 々 な 分 野 で の 利 用 が 期 待 さ れ て い る ナ ノ 物 質 の 中 で も 、特 に 、多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ は 、医 薬 品 、医 療 用 器 具 、 家 電 ・ 電 子 製 品 、 繊 維 、 塗 料 ・ イ ン ク な ど に 使 用 あ る い は 使 用 の 検 討 が な さ れ て い る が 、 マ ウ ス お よ び ラ ッ ト で 中 皮 腫 の 発 現 が 確 認 さ れ 、 ア ス ベ ス ト と 同 様 の 健 康 被 害 が 懸 念 さ れ て い る 。 ア ス ベ ス ト が 、 ヒ ト お よ び マ ウ ス で 胎 盤 通 過 と 胎 児 あ る い は 胎 仔 へ の 移 行 が 実 証 さ れ て お り 、 形 状 の 似 通 っ た 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ も 同 様 に 胎 盤 通 過 と 胎 児 あ る い は 胎 仔 へ の 移 行 が 推 測 さ れ る ． し か し 、 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ と ア ス ベ ス ト の 胎 仔 に 対 す る 影 響 に つ い て 、 公 表 さ れ た デ ー タ が 皆 無 で あ っ た の で 、 こ の ２ 種 類 の 物 質 の 胎 仔 へ の 影 響 を マ ウ ス で 検 討 し た 。 数 あ る 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ 製 品 の う ち 、 中 皮 腫 発 現 が 証 明 さ れ た 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ （ 三 井 M W N T - 7 ） を 被 検 物 質 と し て 、 妊 娠 ９ 日 の I C R マ ウ ス に 、 ２ − ５ m g / k g 体 重 の 腹 腔 内 投 与 お よ び ３ − ５ m g / k g 体 重 の 気 管 内 噴 霧 投 与 を 行 っ た 結 果 、 腹 腔 内 投 与 で は ２ − ５ m g / k g 体 重 で 、 気 管 内 噴 霧 投 与 で は ４ − ５ m g / k g 体 重 で 、 用 量 依 存 性 に 、 死 胚 の 増 加 、 生 存 胎 仔 重 量 の 低 下 、 外 表 奇 形 お よ び 骨 格 奇 形 の 発 現 が 観 察 さ れ た 。 同 時 に 、 母 体 の 脾 臓 重 量 の 増 加 と 白 血 球 数 、 特 に 好 中 球 数 と 好 酸 球
数 の 増 加 が 観 察 さ れ た 。 ク ロ シ ド ラ イ ト 、 ク リ ソ タ イ ル 、 ア モ サ イ ト を 被 検 物 質 と し て 、 同 様 に 、 ４ ０ m g / k g 体 重 の 腹 腔 内 投 与 を 行 っ た 結 果 、 死 胚 の 増 加 、 外 表 奇 形 お よ び 骨 格 奇 形 の 発 現 母 体 の 脾 臓 重 量 の 増 加 と 白 血 球 数 、 特 に 好 中 球 数 と 好 酸 球 数 の 増 加 が 観 察 さ れ た 。 サ イ ズ の 異 な る 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ ６ 種 を 被 検 物 質 と し て 、 同 様 に 、 ４ m g / k g 体 重 の 腹 腔 内 投 与 を 行 っ た 結 果 、 死 胚 の 発 生 率 が 、 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 種 類 に よ っ て ゼ ロ か ら 1 0 0 ％ と 著 し く 異 な っ た 。 死 胚 の 発 生 率 の 高 か っ た 製 品 の 投 与 群 で は 、 母 体 の 脾 臓 重 量 の 増 加 や 白 血 球 数 増 加 に 加 え て 、 投 与 ２ 時 間 後 の 母 体 血 中 の イ ン タ ー ロ イ キ ン − ６ 濃 度 と 単 球 走 化 性 因 子 − １ 濃 度 の 上 昇 が 顕 著 に み ら れ た 。多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の 胎 仔 毒 性 お よ び 母 体 の 炎 症 性 反 応 は 、 製 品 の 直 径 ・ 純 度 ・ 鉄 含 量 と は 無 関 係 で 、 長 さ に 依 存 し て い る と み ら れ た 。 謝 辞 本 論 文 を ま と め る に あ た り 、 主 査 と し て 感 染 制 御 学 研 究 室 教 授 、 池 田 玲 子 先 生 、 副 査 と し て 衛 生 化 学 研 究 室 教 授 、 石 井 一 行 先 生 お よ び 分 析 化 学 研 究 室 教 授 、 小 笠 原 裕 樹 先 生 に 、 ご 指 導 を 賜 り ま し た 。 深 く 感 謝 申 し 上 げ ま す 。 催 奇 形 性 試 験 の 手 法 に つ い て 、 元 ・ 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 環 境 保 健 部 長 の 小 縣 昭 夫 先 生 に 、 毒 性 学 全 般 に つ い て 、 元 ・ 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 薬 事 環 境 化 学 部 長 、 中 江 大 先 生 に ご 指 導 賜 り ま し た こ と を 深 く 感 謝 申 し 上 げ ま す 。 東 京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 生 体 影 響 研 究 科 の 田 山 邦 明 氏 の E L I S A 分 析 技 術 指 導 に 、 安 藤 弘 氏 、 久
保 喜 一 氏 、 湯 沢 勝 広 氏 お よ び 長 沢 明 道 氏 の 技 術 援 助 に 深 く 感 謝 い た し ま す 。 参 考 文 献 １ ） M a r t i n C . R . , K o h l i P . , N a t . R e v . D r u g D i s c o v . , 2 , 2 9 - 3 7 ( 2 0 0 3 ) . ２ ） S c o t t N . R . , R e v . S c i . T e c h . , 2 4 , 4 2 5 - 4 3 2 ( 2 0 0 5 ) . ３ ） T a k a g i A . , H i r o s e A . , N i s h i m u r a T . , F u k u m o r i N . , O g a t a A . , O h a s h i N . , K i t a j i m a S . , K a n n o J . , J . T o x i c o l . , S c i . , 3 3 , 1 0 5 - 1 1 6 ( 2 0 0 8 ) . ４ ） S a k a m o t o Y . , N a k a e D . , F u k u m o r i N . , T a y a m a K . , M a e k a w a A . , I m a i K . , H i r o s e A . , N i s h i m u r a T . , O h a s h i N . , O g a t a A . , J . T o x i c o l . , S c i . , 3 4 , 6 5 - 7 6 ( 2 0 0 9 ) . ５ ） L a m C . - W . , J a m e s J . T . , M c C l u s k e y R . , A r e p a l l i S . , H u n t e r R . L . , C r i t . R e v . T o x i c o l . , 3 6 , 1 8 9 - 2 1 7 ( 2 0 0 6 ) . ６ ） P a c u r R i M . , C a s t r a n o v a V . , V a l l y a t h a n V . , T o x i c o l . E n v i r o n . H e a l t h P a r t A , 7 3 , 3 7 8 - 3 9 5 ( 2 0 1 0 ) . ７ ） H u b b s A . F . , M e r c e r R . R . , B e n k o v i c S . A . , H a r k e m a J . , S r i r a m K . , S c h w e g l e r - B e r r y D . , G o r a v a n a h a l l y M . P . , N u r k i e w i c z T . R . , C a s t r a n o v a V . , S a r g e n t L M . , T o x i c o l . P a t h o l . , 3 9 , 3 0 1 - 3 2 4 ( 2 0 1 1 ) . ８ ） C u n n i n g h a m H . M . , P o n t e f r a c t R . D . , N a t u r e , 2 4 9 , 1 7 7 - 1 7 8 ( 1 9 7 4 ) . ９ ） H a q u e A . K . , M a n c u s o M . G . , W i l l i a m s M . G . ,
D o n a l d s o n R . F . , E n v i r o n . R e s . , 5 8 , 1 6 3 - 1 7 5 ( 1 9 9 2 ) . １ ０ ） H a q u e A . K . , B r a z e l D . M . , B u l l . E n v i r o n . , C o n t a m . , T o x i c o l . , 6 0 , 6 2 0 - 6 2 5 ( 1 9 9 8 ) . １ １ ） H a q u e A . K . , B r a z e l D . M . , U c h i d a T . , A r c h . , E n v i r o n . , C o n t a m . , T o x i c o l . , 3 5 , 5 3 2 - 5 3 8 ( 1 9 9 8 ) . １ ２ ） F u j i t a n i T . , O h y a m a K . , H i r o s e A . , N i s h i m u r a T . , N a k a e D . , O g a t a A . , J T o x i c o l . S c i . , 3 7 , 8 1 - 8 9 ( 2 0 1 2 ) . １ ３ ） F u j i t a n i T . , H o j o M . , I n o m a t a A . , O g a t a A . , H i r o s e A . , N i s h i m u r a T , N a k a e D . , J T o x i c o l . S c i . , 3 9 , 3 6 3 - 3 7 0 ( 2 0 1 4 ) . １ ４ ） O g a t a A . , A n d o H . , K u b o Y . , H i r a g a K . , F o o d C h e m . T o x i c o l . , 2 2 , 5 0 9 - 5 2 0 ( 1 9 8 4 ) . １ ５ ） O g a t a A . , Y o n e y a m M . , S a s a k i M . , S u z u k i K . , I m a m i c h i T . , F o o d C h e m . T o x i c o l . , 2 5 , 1 1 9 - 1 2 5 ( 1 9 8 7 ) . １ ６ ） O g a t a A . , F u j i t a n i T . , Y o n e y e m a M . , S a s a k i M . , S u z u k i K . , F o o d C h e m . T o x i c o l . , 2 7 , 1 1 7 - 1 2 3 ( 1 9 8 9 ) . １ ７ ） O g a t a A . , A n d o H . , K u b o Y . , N a g a s a w a A . , O g a w a H . , Y a s u d a K . , A o k i N . , F o o d C h e m . T o x i c o l . , 3 7 , 1 0 9 7 - 1 1 0 4 ( 1 9 9 9 ) . E r r a t u m i n F o o d C h e m . T o x i c o l . , 3 8 , 1 2 5 ( 2 0 0 0 ) . １ ８ ） F u j i t a n i T . , I n o m a t a A . , O g a t a A . , S a k a m o t o Y . , H i r o s e A . , N i s h i m u r a T . , I k e d a R . , N a k a e D . , T o x i c o l o g y R e p o r t s , 2 , 1 4 0 4 - 1 4 0 8 ( 2 0 1 5 ) . １ ９ ） N a g a i H . , O k a z a k i Y . , C h e w S . H . , M i s a w a N . , Y a m a s h i t a Y . , A k a t s u k a S . , I s h i h a r a T . , Y a m a s h i t a
K . , Y o s h i k a w a Y . , Y a s u i H . , J i a n g L . , O h a r a H . , T a k a h a s h i T . , I c h i k a w a G . , K o s t a r e l o s K . , M i y a t a Y . , S h i n o h a r a H . , T o y o k u n i S . , P N A S , 1 0 8 , E 1 3 3 0 - E 1 3 3 8 ( 2 0 1 1 ) . ２ ０ ） Y a m a g u c h i A . , F u j i t a n i T . , O h y a m a K . , N a k a e D . , N i s h i m u r a T . , H i r o s e A . , O g a t a A . , J T o x i c o l . S c i . , 3 7 , 1 7 7 - 1 8 9 ( 2 0 1 2 ) . ２ １ ） S a r g e n t L . M . , S h v e d o v a A . A . , H u b b s A . F . , S a l i s b u r y J . L . , B e n k o v i c S . A . , K a s h o n M . L . , L o w r y D . T . , M u r r a y A . R . , K i s i n E . R . , F r i e n d S . , M c K n s t r y K . T . , B a t t e l l i L . , R e y n o l d s S . H . , E n v i r o n . M o l . M u t a g e n . , 5 0 , 7 0 8 - 9 1 9 ( 2 0 0 9 ) . ２ ２ ） W i n k l e r G . C . , R u t t n e r J . R . , E x p . C e l l B i o l . , 5 0 , 1 8 7 - 1 9 4 ( 1 9 8 2 ) . ２ ３ ） A s a k u r a M . , S a s a k i T . , S u g i y a m a T . , T a n a k a M . , K o d a S . , N a g a n o K . , A r i t o H . , F u k u s h i m a S . , J . O c c u p . H e a l t h , 5 2 , 1 5 5 - 1 6 6 ( 2 0 1 0 ) . ２ ４ ） L i p k i n L . E . , H e a l t h P e r s p e c t . , 3 4 , 9 1 - 1 0 2 ( 1 9 8 0 ) . ２ ５ ） L o c k S . O . , C h a m b e r l a i n M . , H e a l t h P e r s p e c t . , 5 1 , 1 8 9 - 1 9 3 ( 1 9 8 3 ) . ２ ６ ） L i b b u s B . L . , I l l e n y e S . A . , C r a i g h e a d J . E . , C a n c e r R e s . , 4 9 , 5 7 1 3 - 5 7 1 8 ( 1 9 8 9 ) . ２ ７ ） M a r c z y n s k i B . , C z u p p o n A . B . , M a r e k W . , R e i c h e l G . , B a u r X . , H u m . E x p e r . T o x i c o l . , 1 3 , 3 - 9 ( 1 9 9 4 ) . ２ ８ ） D o p p E . , S c h u l e r M . , S c h i f f m a n n D . , E a s t m o n d D . A . ,
M u t a t . R e s . , 3 7 7 , 7 7 - 8 7 ( 1 9 9 7 ) . ２ ９ ） D o p p E . , S c h i f f m a n n D . , T o x i c o l . L e t t . , 9 6 - 9 7 , 1 5 5 - 1 6 2 ( 1 9 9 8 ) . ３ ０ ） M u r p h y F . A . , S c h i n w a l d A . , P o l a n d C . A . , D o n a l d s o n K . , P a r t i c l e a n d F i b r e T o x i c o l o g y , 9 , 8 ( 2 0 1 2 ) . ３ １ ） S c h i n w a l d A . , M u r p h y F . A . , P r i n a - M e l l o A . , P o l a n d C . A . , B y r n e F . , M o v i a D . , G l a s s J . R . , D i c k e r s o n J . C . , S c h u l t z D . A . , J e f f r e e C . E . , M a c N e e W . , D o n a l d s o n K . , T o x i c o l . S c i . , 1 2 8 , 4 6 1 - 4 7 0 ( 2 0 1 2 ) . ３ ２ ） T e z a b l a w a B . U . , J o h n s o n P . M . , R e e s R . C . , I m m u n o l o g y , 6 7 , 1 1 5 - 1 1 9 ( 1 9 8 9 ) . ３ ３ ） P a r h a m P . , C u r r . B i o l . , 6 , 6 3 7 - 6 4 1 ( 1 9 9 6 ) . ３ ４ ） Y o k o y a m a W . M . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . , 9 4 , 5 9 9 8 - 6 0 0 0 ( 1 9 9 7 ) . ３ ５ ） M e l l o r A . L . , M u n n D . H . , A n n u . R e v . I m m u n o l . , 1 8 , 3 6 7 - 3 9 1 ( 2 0 0 0 ) ．
表１. 多層カーボンナノチューブのサイズおよび純度 被検物質 長さ(μm) 直径(nm) 純度(%) 鉄含量(%) A# 0.5-2 40-70 - 0.046 B$ 1-4 ; 50.9% 50-80 ; 94.8% >98 0.046 5-20 ; 27.5% 20- ; 21.6 C$ 1-4 ; 38.6% 50-80 ; 97.2% >95 0.35 5-20 ; 58.3% 20- ; 3.1% D# 0.5-10 85-200 - 6.504 E# 平均 6 平均 150 >99.95 <0.005 F# 数10〜数 100 20-100 85-94 3.822 # : 企業情報、$：電子顕微鏡像からの算出 表２ 多層カーボンナノチューブ投与用懸濁液組成例 腹腔内投与用 被検物質投与量 投与容量 被検物質濃度 例 35g のマウスに 2mg/kg 体重 10mL/kg 体重 2mg/10mL 被検物質0.070mg/0.35mL : 5mg/kg 体重 10mL/kg 体重 5mg/10mL 被検物質0.175mg/0.35mL 気管内投与用 被検物質投与量 投与容量 被検物質濃度 例 35g のマウスに 3mg/kg 体重 1mL/kg 体重 3mg/1mL 被検物質0.105mg/0.035mL : 5mg/kg 体重 1mL/kg 体重 5mg/1mL 被検物質0.175mg/0.035mL
