PowerPoint プレゼンテーション

バイオ情報解析演習

2013年11月20日(水)

ウェブツールを活用した生物情報解析

(4) 遺伝子のクローニング設計

有用物質生産菌を合理的に作ろう！

設計

試作

ベンチ

テスト

完成

プラスミド

効率的な代謝経路を設計する。

文献調査 代謝パスウェイの探索 代謝シミュレーション

実際に微生物に組み込む。

データベースから有用遺伝子を探索する 遺伝子組換え技術

培養をして問題点を突き止める。

培養 代謝物量、フラックスのデータを解析し、 問題点を突き止める。

今日の授業のモチベーション

• 大腸菌でブタノールを生産したい

– ブタノールを生産する他の生物の遺伝子を大腸菌に組み込む

• そのためには・・・

1. ブタノールを生産する生物種を探す

2. ブタノール合成経路の遺伝子を探す

3. 遺伝子をクローニングするために塩基配列を獲得する

4. 遺伝子およびその酵素の情報を収集する

5. 遺伝子を大腸菌に導入する

KEGGを用いた解析 (10/30) 相同性検索 (11/13) NCBIやKEGGから獲得 (10/30) NCBIやKEGGから獲得(10/30) アライメント解析・相同性検索 (11/6, 11/13)

遺伝子を大腸菌に導入する実験の流れ

1. 生物XのゲノムDNAを抽出する

2. ゲノムDNAから目的の遺伝子領域をPCRに

より増幅する

 PCRにより目的に領域だけを増幅する

3. 制限酵素処理し、ベクターに組み込む

 PCR増幅した遺伝子を大腸菌で保持させるために、 大腸菌内で複製可能なベクターに組み込む

4. 大腸菌に導入する

3 大腸菌 遺伝子 生物X ゲノム DNA 遺伝子 PCR クローニング

遺伝子を大腸菌に導入する実験の流れ

1. 生物XのゲノムDNAを抽出する

2. ゲノムDNAから目的の遺伝子領域をPCRに

より増幅する

 PCRにより目的に領域だけを増幅する

3. 制限酵素処理し、ベクターに組み込む

 PCR増幅した遺伝子を大腸菌で保持させるために、 大腸菌内で複製可能なベクターに組み込む

4. 大腸菌に導入する

大腸菌 遺伝子 生物X ゲノム DNA 遺伝子 PCR クローニング

プライマーの設計

制限酵素サイトの選択

目的の遺伝子をPCRにより増幅する

• PCR (Polymerase Chain Reaction)

– 目的の遺伝子の上流と下流に結合するプライマー(DNA断片)を用いる

ことで、目的の遺伝子領域のみを増幅することが可能

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ Denature 94℃ Annealing 60℃ Extension 72℃ プライマー DNAポリ メラーゼ _5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 1 cycle 2 cycle ゲノム 遺伝子 遺伝子 遺伝子 遺伝子 遺伝子 遺伝子 遺伝子 遺伝子 遺伝子 遺伝子 繰り 返す

プライマー

• プライマー

– 20 bp程度の短いDNA断片 – DNAポリメラーゼがDNAを合成する(dNTPを付加する)開始点となる

• DNAポリメラーゼ

– 一本鎖DNAを鋳型に相補的な塩基配列を合成する酵素 – DNA合成の開始点が必要 – 5’から3’方向にDNAを合成する 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ DNA ポリメラーゼ プライマー プライマー無し プライマー有り 一本鎖DNA

遺伝子を含む領域を増幅するプライマーを設計する(1)

1. データベースから遺伝子の上流と下流領域を含む塩基配列を獲得

 KEGGやNCBIを使用

2. 遺伝子の上流と下流領域にそれぞれプライマーを設計

5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 遺伝子 ATG・ ・ TAA 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 遺伝子 ATG・ ・ TAA 5’ DNAポリメラーゼは 5’から3’方向にDNAを合成する ことを考慮する ATG・ ・ TAA 5’ 3’ 5’ 3’ 遺伝子 上流側のプライマー 遺伝子と相補鎖の配列と 結合する配列 || 遺伝子と同じ鎖を 合成する足場となる 下流側のプライマー 遺伝子と同じ鎖の配列と 結合する配列 || 遺伝子と相補鎖を 合成する足場となる

遺伝子を含む領域を増幅するプライマーを設計する(2)

CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA…TGTGTAATTGTTATCCGCTCACA GATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGT…ACACATTAACAATAGGCGAGTGT CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA…TGTGTAATTGTTATCCGCTCACA GCGAGTGT CTAAATAG GATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGT…ACACATTAACAATAGGCGAGTGT プライマー上側 プライマー下側 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 遺伝子 5’ 3’ 5’ 3’ CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA…TGTGTAATTGTTATCCGCTCACA TAGTACCAGT…ACACATTAACAATAGGCGAGTGT CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA…TGTGTAATTG GATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGT…ACACATTAACAATAGGCGAGTGT 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 1. 遺伝子の上流と下流領域を含む塩基配列を獲得 上流領域 下流領域 2. 遺伝子の上流と下流領域にそれぞれプライマーを設計 3. PCRによりプライマーを足場に各相補鎖が合成される 遺伝子と相補 鎖の配列と 結合する配列 遺伝子と 同じ鎖の 配列と 結合する 配列

プライマー配列の記述方法

• 左側を5’として書く (塩基配列の記述方法と同じ)

– プライマー上側

• 5’- CTAAATAG -3’

– プライマー下側

• 5’- TGTGAGCG –3’ ※配列の向きに注意 (5’-CGCTCACA-3’ではない) 9 CTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA…TGTGTAATTGTTATCCGCTCACA GCGAGTGT CTAAATAG GATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGT…ACACATTAACAATAGGCGAGTGT プライマー上側 _{プライマー下側} 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’

プライマーの設計指針

• 長さ

– 20 bp前後 (18～25 bp程度) • 短すぎると相補鎖と結合効率が下がる • 長すぎると非特異的な結合 (他の領域への結合) が生じる

• GC含量 (プライマー全長に占めるGCの割合)

– 40~60%かつGC・ATの偏りがない • 範囲外になると非特異的結合の増加

• Tm (二本のDNAが解離する温度)

– 55℃以上かつ二本のプライマーで同じ程度 • 長さとGC含量を満たしていれば、基準を満たす

• その他

– ゲノム上の他の領域と相同性が低い – プライマーダイマー (プライマー同士での増幅) が生じない

例題(1)

• Synechocystis sp. PCC 6803のsll0823遺伝子の上流、

下流それぞれ100bp以内に結合するプライマーを

設計せよ。

1. KEGGデータベースでsll01823を検索

2. 遺伝子とその上流・下流を含む配列を獲得

3. プライマー配列を考える

11

解説 (1) : 遺伝子の上流・下流を含む配列を取得

(1) KEGGで目的の遺伝子を検索

(2) 数字を入力することで、ORF領域に加え、 その上流と下流の配列を得ることが可能 例)ORF上流・下流100 bpの配列が欲しい時 + upstream 100 nt + downstream 100 nt

(3) NT seqをクリック

解説 (2) : 遺伝子の上流・下流を含む配列を取得

1. 遺伝子の上流100bpと下流100bpを探す 2. その領域からプライマーを考える

解説 (3) : プライマーの配列例

• プライマー上側

– CCGTAATAGGAAGGTCGAGC (20 bp, GC 55%)

• プライマー下側

– TTTGTGCTCCACAGTGAAGG (20 bp, GC 50%) TCTATGGAATTTTGCCGGGACCAGGAATAAAAATTATTGCCCCCGGCCCTTCCGTAATAGGAAGGTC GAGCCTTTTTTGCCCTGTTGATTTCCTCATACCATGGAAATTGTTTGCAAAATACAACGACAACTAACT GATGGCGATCGCCATTGGCAGAATTATTATTTGGATGTTGATCCCCAAACCAGCATCCTAAATTGTTTA AATCAGATCAAATGGCAACAGGATGGCAGCTTGGCCTTCCGCAAGAATTGCCGTAATGCCATCTGTG GTAGCTGCGCCGTGAGGGTGAACGATCGCCCGGTGTTGGCCTGCAAAGAAAGTATTAAAAGCTTGG GCCAGTGGTTAGCCGAAAGTAACCAGGAAAATACCGGAGTTTTCACCATCAGTCCCCTGGGGAATT TACCCGTTATTAAAGACTTGGTGGTGGATATGGAGAAATTTTTTGCCGGGTTAGATGCGGTTTATCCC TATTTGATTAATAAGCACCAAGGGGAAAAAGGAGCAGAATTTTCCCAATCCCCAGAGCAGCGGGCT GCCCTCAACGATGTGAGCAATTGTGTTCTTTGTGGAGTTTGTTATTCCGACTGCGACGCCAAAAAGA AAAACGAAAATTTTGTCGGGCCCCATGCCCTAGCCAAAGCTAACCGTTTGATTTTAGATAATCGGGAT ATGGCCACTAAGGCCCGCCTCGAAGCCCTGGGCAAAGATAAACAGGGGGTGTGGGGATGCAACAA CTGCCGCATGTGTAGTGATTCTTGCCCCACTGGGGTGGCTCCTCTGTCCCAGATTGAAGCCTTAAAA ATTCGTTTATTTGACTTGATGGATCCCCTTTAAATTCCTAAATTTAAGTTTACTTAAACCATTATTCAGA AATTAGTTCTAGGGTTTCCGCCATTGTTAAATTGCCTTCACTGTGGAGCACAAAGGGCAACCC 青字：遺伝子領域 赤字：設計したプライマー領域

遺伝子を大腸菌に導入する実験の流れ

1. 生物XのゲノムDNAを抽出する

2. ゲノムDNAから目的の遺伝子領域をPCRに

より増幅する

 目的に領域だけを獲得することが可能したい  増幅しないと実験で扱えない(扱いにくい)

3. 制限酵素処理し、ベクターに組み込む

 PCR増幅した遺伝子を大腸菌で保持させるために、 大腸菌内で複製可能なベクターに組み込む

4. 大腸菌に導入する

15 大腸菌 遺伝子 生物X ゲノム DNA 遺伝子 PCR クローニング

プライマーの設計

制限酵素サイトの選択

PCR増幅した遺伝子 (DNA断片) をベクターに組み込む

• ベクターに遺伝子を組み込む

 遺伝子はあくまでATGCからなる化学物質 (DNA) であるので、PCR増幅した 遺伝子を他の生物に導入しても、細胞内で保持されない  目的の生物 (細胞) で複製可能なベクターに遺伝子をクローニングした後に 目的の細胞に導入する ベクター：遺伝子のクローニングなどに用いる環状DNA。 16 遺伝子 ベクター 大腸菌 大腸菌 目的の遺伝子をベクターにクローニング

DNAの切り貼り

• 切る : 制限酵素

– 特定の配列を認識し、二本鎖のDNAを切断する

17 5‘-CAG AATTCAT-3’

3‘-GTCTTAA GTA-5’ 5‘-CAGAATTCAT-3’

3‘-GTCTTAAGTA-5’ EcoRI P O O 塩基 P OH O 塩基

• 貼る : DNA ligase

– DNAの「3’末端の水酸基」と「5’末端のリン酸基」を結合する EcoRI認識配列 相補的な配列は、水素結合により結合 AATTCAT-3’ GTA-5’ 5‘-CAG 3‘-GTCTTAA DNAligaseが末端を結合 DNA ligase

5‘-CAGAATTCAT-3’ 3‘-GTCTTAAGTA-5’

ある制限酵素で切断した DNAは、同じ制限酵素で

切断したDNAと

• 5’ 突出末端

– EcoRI (由来：大腸菌 Escherichia coli)

• 3’突出末端

– KpnI (由来：肺炎桿菌 Klebsiella pneumoniae)

• 平滑末端

– EcoRV (由来：大腸菌 Escherichia coli)

様々な制限酵素

5‘-GATATC-3’ 3‘-CTATAG-5’ 5‘-GAT ATC-3’ 3‘-CTA TAG-5’ 5‘-GGTACC-3’ 3‘-CCATGG-5’ 5‘-GGTAC C-3’ 3‘-C CATGG-5’ 5‘-GAATTC-3’ 3‘-CTTAAG-5’ 5‘-G AATTC-3’ 3‘-CTTAA G-5’ 5’末端 5’末端

制限酵素を用いたクローニング

• ベクターに遺伝子を組み込む

– 両方サンプルと、同じ制限酵素で処理することで、両者を結合することが可能 19 5‘-G AATTC-3’ 3‘-CTTAA G-5’ 5‘-GAATTG---GAATTC-3’ 3‘-CTTAAG---CTTAAG-5’ 5‘-AATTC---G-3’ 3‘-G---CTTAA-5’ 5‘-GAATTC---GAATTC-3’ 3‘-CTTAAG---CTTAAG-5’ 5‘-GAATTC-3’ 3‘-CTTAAG-5’ PCR増幅した遺伝子を含むDNA ベクター 制限酵素処理 (EcoRI) Ligation (DNA ligase) 両末端に EcoRI認識配列 があれば EcoRI認識配列 遺伝子

制限酵素を用いたクローニングの実験計画

1. 遺伝子とベクターの配列に含まれる制限酵素サイトを検索

遺伝子 CTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCG GAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGAACCGC

2. “ベクターには存在”し、”遺伝子には存在”しない制限酵素サイトを選択

 遺伝子配列内に存在する制限酵素を用いると、遺伝子自体が切

断されてしまう

3. 遺伝子を増幅する際のプライマーに選択した制限酵素サイトを付加

HindIII XbaI

(1) 制限酵素サイトの検索-1

• Takara Cut-Site Navigator

– http://www.takara-bio.co.jp/enzyme/enzyme_search.php

21

(2) Setting Detailを

クリック

(1) 制限酵素サイトの検索-2

(3) 検索対象の制限酵素を認 識配列の長さが「6」塩基以上 のものに指定

(6) Submitで実行

(4) 入力配列内に含まれる制 限酵素サイトの出現頻度で検 索条件を設定 例) Not Zero 1回以上出現する制限酵素を 検索 (5) 結果の表示形式 それぞれ試してみる

(1) 制限酵素サイトの検索-3

23

• 検索結果 (Enzyme list)

• 検索結果 (Sequence)

Enzyme Name : 制限酵素の名前 Frequency : 配列内に存在する数 Cutting position : 配列内の存在位置 Recognition Sequence : 認識配列 入力した配列 _{存在することを意味する}ここにPvuI認識配列が

(2) クローニングに用いる制限酵素サイトの選択

• ベクターと、遺伝子DNA断片の両末端を同じ制限酵素で処理し、

DNA ligaseにより結合することでクローニングする

遺伝子 すべて同じ制限酵素で処理したい

• ベクターには存在し、遺伝子には存在しない制限酵素サイトを抽出

– 遺伝子配列内に存在する制限酵素サイトを用いると、遺伝子自体が切断される 遺伝子 ベクター：切断したい 遺伝子：遺伝子の内部では切断したくない 全長をクローニングしないとそのタンパク 質が機能しない Ligation (DNA ligase)

(3)遺伝子DNA断片に制限酵素サイトを付加する

25 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ プライマー 遺伝子 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 遺伝子 5’ 制限酵素サイト 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ PCR：1 cycle 2 cycle PCRの過程で プライマーに含めた 制限酵素サイトに対しても 相補鎖が合成される

• PCRのプライマーに、制限酵素サイトを付加したプライマーを用いる

制限酵素サイトは、ゲノム配列と 相補する配列ではないので結合しないが、 先に設計したプライマーである3’側は 相補する配列であるので結合する 目的の領域を増やすだけの場合 制限酵素サイトを付加する場合 プライマーの5’側に制限酵素サイトを付加する

例題

• pUC19というベクターにSynechocystis sp. PCC 6803のsll0823遺伝子を

クローニングするためのプライマーを設計せよ。

 遺伝子はpUC19のマルチクローニングサイト (MCS) にクローニングすること  MCSに含まれる、6塩基以上からなる制限酵素サイトを使用すること http://en.wikipedia.org/wiki/PUC19 EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII MCS 制限酵素サイト ・MCSとは クローニングを容易に行うため、 複数の制限酵素サイトが配置さ れた領域

解説(1)

1. プライマーを設計 (解説済み)

2. sll0823をPCR増幅した断片に含まれる制限酵素サイトをTakara

Cut-Site Navigatorで検索する

27 TCTATGGAATTTTGCCGGGACCAGGAATAAAAATTATTGCCCCCGGCCCTTCCGTAATAGGAAGGTCGAGCCTTTT TTGCCCTGTTGATTTCCTCATACCATGGAAATTGTTTGCAAAATACAACGACAACTAACTGATGGCGATCGCCATTG GCAGAATTATTATTTGGATGTTGATCCCCAAACCAGCATCCTAAATTGTTTAAATCAGATCAAATGGCAACAGGATG GCAGCTTGGCCTTCCGCAAGAATTGCCGTAATGCCATCTGTGGTAGCTGCGCCGTGAGGGTGAACGATCGCCCGG TGTTGGCCTGCAAAGAAAGTATTAAAAGCTTGGGCCAGTGGTTAGCCGAAAGTAACCAGGAAAATACCGGAGTT TTCACCATCAGTCCCCTGGGGAATTTACCCGTTATTAAAGACTTGGTGGTGGATATGGAGAAATTTTTTGCCGGGT TAGATGCGGTTTATCCCTATTTGATTAATAAGCACCAAGGGGAAAAAGGAGCAGAATTTTCCCAATCCCCAGAGCA GCGGGCTGCCCTCAACGATGTGAGCAATTGTGTTCTTTGTGGAGTTTGTTATTCCGACTGCGACGCCAAAAAGAA AAACGAAAATTTTGTCGGGCCCCATGCCCTAGCCAAAGCTAACCGTTTGATTTTAGATAATCGGGATATGGCCACT AAGGCCCGCCTCGAAGCCCTGGGCAAAGATAAACAGGGGGTGTGGGGATGCAACAACTGCCGCATGTGTAGTG ATTCTTGCCCCACTGGGGTGGCTCCTCTGTCCCAGATTGAAGCCTTAAAAATTCGTTTATTTGACTTGATGGATCCC CTTTAAATTCCTAAATTTAAGTTTACTTAAACCATTATTCAGAAATTAGTTCTAGGGTTTCCGCCATTGTTAAATTGCC TTCACTGTGGAGCACAAAGGGCAACCC 青字：ORF 赤字：設計したプライマー領域 解析には、プライマーで挟まれた配列(プ ライマー領域を含む)を用いる (下線部)

解説(2)

• MCSに含まれる制限酵素サイト

 EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, HindIII

• sll01823とMCSの両方に含まれ

る制限酵素サイト

 BamHI, HindIII

• クローニングには、”EcoRI, SacI,

KpnI, SmaI, XbaI, SalI, PstI, SphI”

の制限酵素を選択すればよい。 制限酵素サイトの検索結果

解説(3)

• 最初に設計した、遺伝子領域を増幅するためのプライマー

– プライマー上側 • CCGTAATAGGAAGGTCGAGC (20 bp, GC 55%) – プライマー下側 • TTTGTGCTCCACAGTGAAGG (20 bp, GC 50%)

• EcoRIでクローニングする場合、認識配列を付加 (

GAATTC

) をプライ

マーの5’側に付加する

– プライマー上側 • GAATTCCCGTAATAGGAAGGTCGAGC – プライマー下側 • GAATTCTTTGTGCTCCACAGTGAAGG ※制限酵素サイトの付加によるGC含有量の変化は考慮しなくて良い。鋳型 (DNA)に結合する領域だけについて考えれば良い。 29