[目的] 我々はコバス TaqMan48（ロシュ・ダイアグノス テックス㈱）を用いた液体培地からの抗酸菌検出に関する 基礎的検討を実施した。 [対象および方法] 対象はマイコアシッド（極東製薬工業 ㈱）にて陽性と判定された25 例を用い、判定後の液体培地 を生理食塩水にて100 倍および 1000 倍に希釈し、 100μL を 13000×g にて 5 分間の遠心後のペレットを解析に 供した。試料の調整はアンプリコアマイコバクテリウム検 体前処理試薬セット（ロシュ）およびタックマンマイコ用 検体処理試薬添加剤セット「SOL-M」（ロシュ）を用いて 能書に従い実施した。処理後の試料はコバスTaqMan MTB（ロシュ、以下 MTB）およびコバス TaqMan
MAI（ロシュ、以下 MAI）を用いてコバス TaqMan 48 で増 幅・検出を行い、AmpliLink ソフトウエア（ロシュ）にて 判定し、さらにTaqMan MYCO 内部コントロール（ロシュ、 以下IC）の Ct 値の解析を実施し、得られた Ct 値と
TaqMan MTB(+)コントロール（以下、MTB）,TaqMan MAV(+)コントロール(以下、MAV)および TaqMan MIN
(+)コントロール（以下、MIN）の Ct 値を比較した。併せ てdirect sequence 法で得られた結果と判定とを比較した。 [結果] 判定は M. tuberculosis 1 例、M. avium 12 例、M. intracellulare 9 例および混合感染 1 例の陽性を示した。 MTB では 100 倍希釈で 6 例の IC の増幅不良（Invalid）を 示したが、1000 倍希釈およびコバス MAI ではいずれの希 釈倍率においてもIC の増幅を認めた。コントロールにおけ るIC の Ct 値（mean ± SD）は TB, MAV および MIN でそれ ぞれ37.5 ± 0.4, 36.8 ± 0.4 および 37.4 ± 1.3 を示した。試料 におけるCt 値は TB の 100 倍および 1000 倍で 38.7 ± 1.7 お よび37.6 ± 1.0 となり、MAV および MAI では 37.0 ± 1.4 お よび36.7 ± 0.8 を示し、MTB の 100 倍において高値傾向を 示した。direct sequence 法の結果よりコバス TaqMan48 の判 定は妥当であった。 [考察およびまとめ] コバス TaqMan48 による液体培地から の抗酸菌検出は可能であると考えられた。TB における IC の増幅不良および IC の Ct 値の高値傾向から、当院のシ ステムは試料の1000 倍希釈が適切であると考えられた。
コバス
TaqMan48 を用いた液体培地からの抗酸菌検出
◎澤村 卓宏1)、森部 龍一2) 社会医療法人大雄会 第二医科学研究所1)、社会医療法人大雄会 総合大雄会病院2)274
【目的】
近年、各種抗菌薬に対し耐性を獲得した菌株が出現し、 院内感染の問題となっている。当院から第3 世代セファロ スポリン耐性のEscherichia coli、Proteus mirabilis、
Klebsiella pneumoniae、イミペネム耐性のPseudomonas aeruginosa が検出され、それらの株について解析を行った。 【方法】 2013 年 11 月～2014 年 2 月に提出された検体 56 件を対象と した。第3 世代セファロスポリン耐性 E.coli P.mirabilis K.pneumoniae、および、イミペネム耐性P.aeruginosa につ いて基質拡張型 β ラクタマーゼ（ESBL）、メタロ β ラク タマーゼ（MBL）の確認試験を武蔵臨床検査所に依頼した。 ESBL が陽性と判定された株については PCR 法による耐性 遺伝子解析を実施した。 【結果】 セファロスポリン耐性3 菌種のすべての株は ESBL 陽性 と判定された。検体材料は、喀痰、尿がほとんどを占めた。 菌種はP.mirabilis が半数を占め、次いで E.coli が多かった。 耐性遺伝子はCTX-M1 型 16 M2 型 21 株、CTX-M9 型 7 株、SHV 型 2 株、不明 6 株であった。材料別にみ ると喀痰では、P.mirabilis が大半を占め、全て CTX-M2 型 であった。尿はE.coli が半数以上を占め CTX-M1 型が多か った。イミペネム耐性P.aeruginosa は 32 株。主に喀痰から 検出され、そのうち3 株が多剤耐性緑膿菌（MDRP）であ った。3 株のうち 1 株から MBL 陽性菌が検出されたが、材 料は尿であった。 【考察とまとめ】 本邦ではCTX-M9 型が最も多く検出されるが、当院では CTX-M2 型、次いで CTX-M1 型が多かった。現在 MBL 陽 性菌およびMDRP は検出されていない。当院の患者は半数 が気管切開、大半がオムツを使用するため人の手を介する 患者が多い。そのため、医療従事者が菌の伝搬をしている 可能性が示唆される。医療従事者のみならず、全職員が知 識の共有、周知が必要と考える。今後、臨床検査技師がで きることとして薬剤感受性結果のチェックや、耐性遺伝子 の解析をすることはますます重要になると考えられる。
長期療養型病院における耐性菌の解析
基質拡張型β‐ラクタマーゼ（ESBL)とメタロ β ラクタマーゼ（MBL) ◎大竹 京子1)、松村 充2) 医療法人社団富家会 富家病院1)、帝京大学医療技術学部2)275
はじめに：Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 法 は一定温度でDNA を増幅できるため特別な機器を必要と せず簡易・迅速・精確な検査法で感染症の簡易迅速診断が 可能となり臨床検査の現場にも多く導入されている。 LAMP 法は 6 つ領域にプライマーを設定することにより感 度・特異性に優れLAMP プライマーの設計は専用ソフトを 使用し比較的簡単にプライマーの設計が可能である。そこ で耐性遺伝子解析にLAMP 法の適用を図った。
目的・方法：本研究では、Escherichia coli の GyrA 遺伝子を 標的DNA としてプライマーを設計し LAMP 法により増幅 する。その増幅産物から標的DNA の塩基配列の確認がで きることを検討する。対象は当園で分離した株を使用した。 結果：65℃40 分の反応において LAMP 産物の増幅を確認し た。今回はループプライマーを使用していないので増幅曲 線の立ち上がりが32 分前後から認められため 60 分に反応 時間を変更した。LAMP 産物を電気泳動にて確認した。 LAMP 産物はループ状に増幅されるため泳動像はラダーパ ターンを示した。 また、DNA シークエンス解析は読み始めの 10～30 塩基は エラーが起こり80 塩基前後からシグナルの減少が起こった。 塩基を読めたのは180 塩基前後までとなった。3 つの株 （E4,18,21）の塩基配列を解析すると GyrA 83,87 に塩基配 列の変異を確認した。 まとめ：今回我々は、LAMP 法を用いて任意の DNA 領域 を増幅しDNA シークエンスを解析することができた。 LAMP 法ではプライマー設計が大きな壁となるが、「プラ イマーエクスプローラー」により比較的簡単に設計するこ とができた。 LAMP 法の使用目的のほとんどが検出用であると思われる が、プライマーをどの領域に設定するのかによって検出だ けに留まらない。今後は使用目的が広がり応用範囲は拡大 するものと考える。 連絡先 国立療養所沖縄愛楽園 研究検査科 梅谷昌司 0980-52-8331
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 法を利用した GyrA 遺伝子変異の検出
◎梅谷 昌司1)、松永 洋1)、中嶌 雅信1)、馬場 義広1) 国立療養所沖縄愛楽園1)
【はじめに】 MRSA は院内感染対策上、最も重要な耐性菌 のひとつであり、当院では2003 年より入院時、術前、化学 療法前、血液内科病棟およびICU 入室時などを対象とした、 鼻腔によるMRSA アクティブサーベイランスを行っている。 2014 年 8 月から POT 法を導入し、入院・外来問わず新規 検出MRSA 全例の POT 型を解析したので報告する。 【対象】当院にて2014 年 8 月以降に検出された新規 MRSA 60 株を対象とした。 【方法】菌株をヒツジ血液寒天培地(日本 BD)にて 24 時間 培養後、シカジーニアス分子疫学解析キット(関東化学)を 用いてPOT 値を測定し、POT 型を決定した。 【結果】新規検出MRSA60 株は、34 の POT 型に分けられ、 60 株中 28 株は 1 株ずつ独立した POT 型を示した。同一株 が複数見られた型は6 種で、POT 型 106-137-80 が 20 株と 最も多く、次いでPOT 型 106-183-40、POT 型 106-9-80 が 3 株、POT 型 93-217-56、POT 型 64-24-80、POT 型 70-18-81 が 2 株であった。 【考察】POT 型 106-137-80 の 20 例の内、入院 48 時間以 降に検出された2 例は、院内伝播が疑われる事例であった。 残り18 例の内 17 例は、外来または入院時の鼻腔スクリー ニングからの検出で、その内10 例は当院への入院歴があり、 入院中に院内伝播した可能性が否定できず、残り7 例は、 当院への入院歴はなく、市中での流行株の可能性が考えら れた。 【まとめ】POT1 が 106 の MRSA は、市中感染型と言われ ているが、今回解析した結果、POT 型 106-137-80 の株は、 市中での流行株もしくは院内での定着、伝播の両方の可能 性が示唆された。今後症例数を増やし、院内や地域におけ るMRSA の POT 値の分布などを解析し、POT 法の有用性 についてさらに検討していきたい。 連絡先：06-6443-1261(内線 6040)
当院における
POT 法を用いた MRSA の分子疫学解析の検討
◎森崎 隆裕1)、中井 依砂子1)、黒田 亜里沙1)、幸福 知己1)、川口 正彦1) 一般財団法人 住友病院1)277
【はじめに】メチシリン耐性ブドウ球菌(MRSA)は代表的な 院内感染の原因菌であり、感染制御上重要な菌である。 Phage Open Reading Frame Typing 法(POT 法)はマルチプレッ クスPCR により MRSA クローンを簡便に同定できるため、 MRSA の院内伝播を把握する上で非常に有用である。しか し健常者においてもMRSA 保菌者は散見されるため、検出 された株が院内感染によるものかを同定することはしばし ば困難である。近年、院内型MRSA（HA-MRSA）と比較 して非常に強い病原性を持つ市中感染型 MRSA(CA-MRSA)が問題となっている。そこで、今回、我々は市中に おけるMRSA クローンの実態を把握するため、新規に外来 患者より検出されたMRSA 株について POT 法ならびに毒 素産生遺伝子解析を行ったので報告する。【対象および方 法】対象は2013 年 7 月~2014 年 11 月までの外来患者より 新規に検出されたMRSA89 株。POT 法は鈴木らの方法に従 い、またPCR により各種毒素産生遺伝子 (PVL ・ TSST-1 ・ ETA ・ ETB)の有無を調べた。【結果】外来患者由来 株についてPOT 法を実施した結果、59 種類の MRSA クロ ーンが検出され、そのうち複数クローンは10 種類検出され た。数種類のクローンにおいては、同時期における入院患 者からも複数検出された。また、毒素産生遺伝子について も検討したがPOT ナンバーとの関連性はなかった。また、 CA-MRSA において特に問題となっている PVL 産生遺伝子 についても調べたが、今回測定した株では認められなかっ た。【考察】外来患者より検出されたMRSA 株を用いて POT 法を実施した結果、院内でも検出されたクローンが複 数検出された。また、POT1 の数値は MRSA クローンと相 関しており、いわゆる院内感染型と言われる株も多数検出 されたため、入院時におけるスクリーニングや入院歴の把 握が重要であると考えられた。今回の検討ではPVL 産生遺 伝子を持つMRSA は認めなかったが、本邦においても CA-MRSA による症例は報告されており、今後増加することが 予想されるため毒素産生株について詳細に把握することは 非常に重要と考える。 連絡先(072)804-0101(内線 3259）
