VEGF promotes tumorigenesis and angiogenesis of human glioblastoma stem cells

Title

VEGF promotes tumorigenesis and angiogenesis of human

_{glioblastoma stem cells( 内容の要旨(Summary) )}

Author(s)

岡, 直樹

Report No.(Doctoral

Degree)

博士（医学）甲 第721号

Issue Date

2007-09-12

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/23094

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学位論文題目 VEGF promotes tumorigenesis _and angiogenesis of human glioblastoma stem

Cel】s

審 査 委 員 (主査)教授 岩 間 号

(副査)教授 森 秀 樹 教授 園 貞 隆 弘

論文内容の要旨

多型神経膠腫(glioblastoma _{multiforme(GBM))は悪性脳腫瘍の中でも最も悪性度の高い腫瘍であ} る｡近年,悪性脳腫瘍における癌幹細胞(cancer stem _{cell(CSC))の存在を支持する研究成果が数多}

く報告されており,腫瘍形成や再発に重要な役割を演じると考えられている｡Vascular endothelial growth factor(VEGF)と VEGF _{receptor(VEGFR)は血管増生に関わる重要な因子であり腫瘍に対する}

分子標的療法のtarget として重要視されているが,それらのCSCに対する影響はまだ十分に解明さ

れていない｡

我々はhuman GBMの手術検体から多分化能,自己複製能を有する細胞群を同定し長期培養を行った｡ これらの細胞群(Ⅹ01GB)は,epidermalgrowth factor(EGF)及びfibroblast growth factor(FGト2) 存在下で浮遊培養するとtumor _{sphereを形成し,血清培養液で培養するとneuronとgliaの両方へ}

の分化を示し,更に免疫不全マウスの脳へ移植すると元のGBMと全く同じ表現型を示す腫瘍を形成す ることから,CSCであると考えられた｡retrOVirusを用いてXOIGBにVEGFを形質導入し強発現させ, CSCにおけるVEGFの役割を1D Vltz･0と1n vIvoで検討した｡

方法

(1)recombinant retrovirus:human VEGFを発現するretrovirus _{vector(pDNhVEGF)を作成し,}

markerとしてenhanced green fluorescent _{protein(EGFP)を発現するようにした｡paCkage}

細胞株はvesicular stomatitis virus G(VSV-G)を産生する293gpgを使用した｡

(2)CSCの樹立とVEGFの形質導入:患者から摘出したGBM組織片に0.05%tripsin処理を加え,

pipettingにより dissociate した｡EGF,FGF-2,1eukemiainhibitory factor(LIF)を加え

たDMEM/F12培養液にて37℃,5%CO2条件下で浮遊培養を行った｡50回継代後にDNEGFP-VEGF を形質導入し,その後FACS及び免疫染色を行った｡

(3)免疫不全マウスへの移植と生存期間の検討:2×105のEGFP-VEGF-XOIGB又はEGFP-Ⅹ01GBを

non-Obese diabetic-SeVere _{COmbinedimmunodeficiency(NOD-SCID)マウス脳に定位的に移}

植し観察を行い,mObidityの徴候が見られた時点で脳を摘出した｡Kaplan-Meier生存曲線を 作成し統計学的解析を行った｡

(4)免疫染色:組織はparaffin標本または凍結標本とし,hematoxylin-eOSin染色,各種免疫染 色(nestin,GFAP,TUJl,Ki67,CD31),periodic _{acid-Schiff(PAS)染色を行った｡}

-7-結果 (1)VEGFはID _{VltroTCCSCの腫瘍形成能に影響を与えなかった:} XOIGBのtumor sphereは神経幹細胞markerであるnestinに陽性を示した｡また,neurOnや gliaへの分化を示すことが免疫染色で証明された｡NOD-SCIDマウス脳へ移植すると強い浸潤 性の腫瘍を形成し,元のGBMと全く同じ表現型を示した｡EGFP-VEGF-XOIGBはVEGF-Aを強発 現しており,XOIGBと同様にtumor _{sphereを形成したが,その形成能に有意差は認められな} かった｡またEGFP-VEGF-XOIGBはXOIGBと同様にneuronやgliaへの分化を示した｡これら

のことからVEGFはin _{vitroにおいてCSCのtumor sphere形成能や多分化能に影響を与えな} いことが明らかになった｡ (2)VEGFを発現したCSCは腫瘍出血を伴う血管豊富な腫瘍を形成し生存期間を短縮させた: EGFP-VEGF-Ⅹ01GBを移植された群(n=8)は移植後64 日以内に全て腫瘍死し,有意な生存期間 の短縮が認められた｡その摘出脳では肉眼的腫瘍出血が多く観察された(5/8)｡EGFP-Ⅹ01GB を移植された群(n=6)では腫瘍出血は認められなかった(0/6)｡組織学的検索では,EGFP-VEGF-XOIGBから形成された二次腫瘍は,元のGBMの表現型に加え,著明な腫瘍内血管増生と 出血が認められた｡PAS染色では腫瘍細胞の間に網状に広がる血管内皮基底膜のmeshworkの 形成がみられた｡これらの血管内皮細胞(vascular _{endothelialcell(VEC))はanti-mOuSe} CD31に陽性で,CSC由来ではなくマウス脳の血管由来であると考えられた｡これらのことか ら,VEGFはVECの増生を促進しCSCからより血管豊富で腫瘍出血を来しやすく致命的な腫瘍 を形成させることが明らかになった｡ 考察■結語

VEGFを発現するhuman GBM stem _{cellはID Vl'voT血管増生の豊富な,出血しやすい腫瘍を形成し,}

生存期間に影響を与えることが示された｡VEGFは血管増生を促進しGBMの活動性に影響を与えること が知られており,これを裏付ける結果となった｡CSCはneuralstem _{cell(NSC)と同様に,その微} 小環境(niche)により厳密に維持されていると考えられている｡VECはneurotrophic _factor等の interactionを介してNSCの維持,運命決定に関わるnicheとして重要であると考えられている｡CSC はNSCの性質を示す腫瘍細胞であり,VECがnicheとして重要と考えられるが,CSCとVECの関係は 未解明な部分が多い｡ 本研究では,VEGFを発現するCSCはVECの増殖を促進し,血管豊富な出血性のagressiveな腫瘍を 形成することが示された｡VEGFをはじめとする血管増生因子や,VECのsignaling _{moleculesは分子} 標的療法の有効なtargetとなり得ると考えられる｡今後,CSCやnicheをtargetとした治療法の開 発･応用が期待される｡ 論文審査の結果の要旨

申請者 岡 直樹は,VEGFはID _{Vltroではhuman} GBM stem cellのtumor _{sphere形成能や多分化}

能に影響を与えないが,VEGFを発現するhuman GBM stem _{cellをマウス脳内に移植すると,腫瘍内出}

血を伴う血管増生の豊富なGBMを形成し,生存期間を有意に短縮させることを明らかにした｡ 本研究の成果は,CSCやVEGFが分子標的療法の有効なtargetとなり得ることを示すものであり, 悪性脳腫瘍患者に対する治療の進歩,脳神経外科学の発展に少なからず寄与するものと認める｡

[主論文公表誌]

VEGF _{promotes tumorigenesis and angiogenesis of} human _{glioblastoma stem cells}

Biochemicaland BiophysicalResearch _{Communications360(3),553-559(2007).}