菌 株 レ ベ ル で の 病 原 性 解 析 を 可 能 と す る
P. gingivalis お よ び T. forsythia の 分 離 ・ 定 量 法 の 確 立
洪 性 文 續 橋 治 渕 上 真 奈*
日 本 大 学 松 戸 歯 学 部 口 腔 健 康 科 学 講 座 歯 科 臨 床 検 査 医 学 分 野
〒271-8587 千 葉 県 松 戸 市 栄 町 西 2-870-1
1
Abstract
Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythia are regarded as a key factor in periodontal disease. A suitable selective medium for the isolation and quantification of P. gingivalis and T. forsythia has been needed for the pathogenic analysis at bacterial strain level. The purpose of present study was to develop the selective medium for the isolation and quantification of P. gingivalis and T. forsythia. A novel selective medium, designated PGTFSM, was developed for the isolation of these organisms. Using PGTFSM, the proportion of these organisms in gingival crevicular fluid samples collected from 30 periodontally healthy subjects and 30 patients with chronic periodontitis. PGTFSM was able to easily distinguish each bacterial species by the differences in each colony morphology. P. gingivalis and T. forsythia were detected in 3 (10%) and 5 (16.7%) periodontally healthy subjects, respectively. On the other hand, P. gingivalis and T. forsythia were detected in 18 (60%) and 28 (93.3%) patients with chronic periodontitis, respectively. The detection sensitivity of the culture method using PGTFSM was equivalent to that of the PCR method. It was indicated that PGTFSM was useful for the isolation and quantification of P. gingivalis and T.
forsythia.
Keywords: selective medium, red complex, Porphyromonas gingivalis ,
Tannerella forsythia
2
抄 録
目 的：歯 周 病 の 発 症・進 行 に 最 も 関 連 が 深 い
P. gingivalis
とT. forsythia
を 確 実 かつ 同 時 に 分 離 可 能 な 選 択 培 地 の 開 発 を 試 み た 。
方 法：開 発 し た 選 択 培 地（
PGTFSM
）を 用 い て 慢 性 歯 周 炎 患 者 お よ び 健 常 者 各30
名 の 歯 肉 溝 滲 出 液 試 料 か ら 両 菌 種 の 検 出 を 試 み た 。
結 果 お よ び 結 論 ： 両 菌 種 は
PGTFSM
上 で そ れ ぞ れ 特 徴 的 な 集 落 形 態 を 示 す こ とよ り 、
2
菌 種 を 判 別 す る こ と が 可 能 で あ っ た 。健 常 者 で はP. gingivalis
は3
名（10%
）、T. forsythia
は5
名 （16.7%
） か ら 検 出 さ れ た 。 慢 性 歯 周 炎 患 者 で はP. gingivalis
は
18
名（60%
）、T. forsythia
は28
名（93.3%
）の 被 験 者 か ら 検 出 さ れ た 。PGTFSM
を 用 い た 培 養 法 に よ る 検 出 感 度 は 、
PCR
法 と 比 較 し て 同 等 で あ っ た 。 こ れ ら の結 果 か ら 、
PGTFSM
は 両 菌 種 を 分 離 ・ 定 量 す る の に 有 用 で あ る と 考 え ら れ た 。Key word
：Selective medium, red complex, Porphyromonas gingivalis , Tannerella
forsythia
3
緒 言
歯 周 炎 は 歯 周 局 所 に お け る 正 常 細 菌 叢 バ ラ ン ス が 破 綻 し た 結 果 、病 的 な 細 菌 叢 に 変 遷 し 、 そ れ ら に よ り 形 成 さ れ た 細 菌 塊 （
dysbiotic biofilms
） に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る 歯 槽 骨 の 吸 収 を 伴 う 歯 周 組 織 の 炎 症 性 病 変 で あ る 1)。歯 周 病 関 連 細 菌 に つ い て は こ れ ま で 多 く 研 究 報 告 が な さ れ て お り 、 特 にred complex
と 名 付 け ら れ た 特 定 の 細 菌 種 、Porphyromoans gingivalis
（P. gingivalis
）、Treponema denticola
（
T. denticola
）、Tannerella forsythia
（T. forsythia
） が 重 度 の 歯 周 炎 と 有 意 に 関 連 し て い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 2) 。そ の 中 で もP. gingivalis
は 、歯 周 局 所 に お け る 正 常 細 菌 叢 コ ミ ュ ニ テ ィ ー を 撹 乱 し て 歯 周 組 織 に 慢 性 炎 症 を 引 き 起 こ す の に 重 要 な 役 割 を 果 た す 細 菌 種（keystone pathogen
）と 見 做 さ れ て い る 。し か し 、 歯 周 病 は 医 科 領 域 に お け る 細 菌 感 染 と は 異 な り 、Koch
の 原 則 が 適 応 さ れ な い 非 常 に ユ ニ ー ク な 疾 患 で 、起 炎 菌 が 存 在 し て も そ の 細 菌 に 対 応 し た 臨 床 症 状 を 呈 す る わ け で は な い 。ま た 、歯 周 病 関 連 細 菌 は 健 康 な 歯 周 組 織 の 歯 肉 溝 か ら も 検 出 さ れ る こ と も あ り 、細 菌 の 存 在 が 歯 周 病 の 発 症 と は 必 ず し も 一 致 し な い 場 合 も あ る 。 し か し な が ら 、歯 周 病 関 連 細 菌 、特 にP. gingivalis
やT. forsythia
な ど のred complex
の 分 布 状 況 を 検 索 す る こ と が 、現 時 点 に お い て は 歯 周 病 の 詳 細 な 進 行 実 態 を 把 握 す る 上 で 重 要 で あ る と 考 え ら れ る 3)。現 在 、 歯 科 臨 床 の 場 に お い て 活 用 さ れ て い る 歯 周 病 細 菌 検 査 は 、
red complex
を 含 む 歯 周 病 関 連 細 菌 を 定 性 的 に 検 出 す るPCR
法 4)や 定 量 的 に 検 出 す る リ ア ル タ イ ムPCR
法 （qPCR
）3)な ど に よ る 遺 伝 子 学 的 手 法 を 用 い た 菌 種 レ ベ ル の 解 析 が 主 流 で あ る 。一 方 で 、P. gingivalis
に は6
つ の 線 毛 遺 伝 子fimA
の 型 が あ り 、そ の 中 で Ⅱ 型 が 重 度 歯 周 病 患 者 か ら 高 頻 度 で 分 離 さ れ る こ と か ら 、Ⅱ 型 線 毛 を 保 有 す るP. gingivalis
の 病 原 性 が 強 い こ と が 示 唆 さ れ て い る 5,6,7)。P. gingivalis
と 同 様 にT. forsythia
に お い て も 、 同 一 の 菌 種 で あ っ て も 菌 株 に よ っ て 病 原 性 が 異 な る こ と が 推 定 さ れ 、菌 種 レ ベ ル で の 定 性・定 量 を 主 と し た 解 析 で は 、歯 周 疾 患 に 対4
す る 精 度 の 高 い リ ス ク 評 価 や 病 態 の 把 握 は 出 来 な い こ と が 窺 わ れ る 。 す な わ ち 、 細 菌 の 持 つ 能 力 や 病 原 因 子 は 、感 染 力 、環 境 適 応 能 力 、毒 素 産 生 性 等 々 、多 岐 に わ た り 複 雑 で 、 同 一 細 菌 内 の 株 に よ っ て も 多 様 性 （
diversity
） を 示 す た め 、 特 定 細 菌 の 定 性・定 量 解 析 で は 現 在 の 歯 周 病 の 重 症 度 や 進 行 の 程 度 を 把 握 す る こ と は 困 難 で あ り 、 菌 株 レ ベ ル で の 病 原 性 解 析 が 必 要 で あ る と 著 者 ら は 考 え た 。菌 株 レ ベ ル の 解 析 は 、先 述 の
P. gingivalis
の 線 毛 遺 伝 子 で あ るfimA
の 型 判 別 が 既 に 臨 床 応 用 さ れ て い る が 、そ の 他 に も 同 一 の 細 菌 種 で あ っ て も 、病 原 性 と 密 接 に 関 連 し 、ま た 菌 株 間 で 差 異 を 表 す 病 原 因 子 や 病 原 マ ー カ ー が 存 在 す る と 考 え ら れ る 。そ れ ら を 検 知・定 量 可 能 と な れ ば 歯 周 病 に 対 し て 高 い 特 異 性 を も っ た 検 査 法 を 確 立 で き 、本 疾 患 の 診 断・治 療・予 防 に 有 効 な ツ ー ル と な り 得 る と 推 定 さ れ る 。菌 株 レ ベ ル の 検 索・解 析 を 行 う た め に は 、分 離 菌 株 が 必 要 と な る 。即 ち 、歯 周 病 罹 患 の 有 無 や 程 度 が 異 な る 多 数 の 被 験 者 か ら 試 料 を 採 取 、選 択 培 地 を 用 い た 培 養 法 に よ り 細 菌 株 を 分 離 、得 ら れ た 分 離 菌 株 に お け る 病 原 性 状 と 被 験 者 の 病 態 を 比 較 検 討 す る こ と に よ り 、疾 患 特 異 的 な 指 標 と な り 得 る 病 原 マ ー カ ー の 検 索 ・ 解 析 が 可 能 と な る 。現 在 ま で 、 重 度 歯 周 炎 と 有 意 な 相 関 を 認 め る
P. gingivalis
ま た はT.forsythia
を 確 実 に 分 離 可 能 な 選 択 培 地 は 未 だ 開 発 さ れ て い な い 。そ こ で 著 者 ら は 、歯 肉 溝 滲 出 液 試 料（GCF
）か らP. gingivalis
とT. forsythia
両 菌 種 を 高 精 度 、か つ 同 時 に 分 離・定 量 可 能 な 選 択 培 地 を 開 発 し 、P. gingivalis
とT. forsythia
の 分 離・定 量 法 の 確 立 を 試 み た 。そ れ に よ り 、菌 株 レ ベ ル で の 解 析 、す な わ ち 病 原 マ ー カ ー の 検 索・解 析 が 可 能 と な る 。こ れ に よ り 、歯 周 病 に 対 し て 疾 患 特 異 的 な 病 原 マ ー カ ー が 特 定 さ れ れ ば 、単 な る 細 菌 数 の 定 量 で は な く 病 原 因 子 の 定 量 が チ ェ ア サ イ ド で 可 能 と な り 、歯 周 病 の 診 断 や 治 療 効 果 の 即 時 判 定 に 有 用 で あ る と 考 え ら れ る 。ま た 本 研 究 で は 、 慢 性 歯 周 炎 患 者 と 歯 周 組 織 が 健 常 な 被 験 者 （ 歯 周 健 常 者 ） か ら
GCF
を 採 取 し 、本 選 択 培 地 に よ る 培 養 法 、ま た 本 研 究 で 確 立 し たDirect Multiplex PCR
5
法 の
2
つ の 方 法 を 用 い て 、GCF
試 料 中 か らP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 検 出 を 試 み 、 そ れ ぞ れ の 検 出 結 果 に 対 し て 比 較 検 討 を 行 っ た 。材 料 お よ び 方 法
1.
供 試 菌 と 培 養 方 法表 １ 、
2
に 示 し た 細 菌 株 を 実 験 に 供 し た 。 偏 性 嫌 気 性 菌( Porphyromonas
属 、Tannerella
属 、Prevotella
属 お よ びFusobacterium
属)
はCDC
嫌 気 性 菌 用 血 液 寒 天 培 地（CDC
血 液 寒 天 培 地：Tryptic soy agar
（Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA
）、ビ タ ミ ンK
1（10 μg/ml
）、ヘ ミ ン（5 μg/ml
）、L-
シ ス テ イ ン（800 μg/ml
）、0.5
％yeast extract
、5 %
羊 血 液 ）を 継 代 用 培 地 と し て 用 い た 。さ ら に 、T. forsythia
の 培 養 に は 、本 菌 が 発 育 因 子 と し てN-
ア セ チ ル ム ラ ミ ン 酸 を 要 求 す る た め 、CDC
血 液 寒 天 培 地 上 中 央 に 直 径1
ｃ ｍ 大 の ペ ー パ ー デ ィ ス ク を 置 き 、1.5
％N-
ア セ チ ル ム ラ ミ ン 酸（20 µl
）を デ ィ ス ク に 浸 み 込 ま せ た 。こ れ ら 細 菌 株 の 培 養 は37
℃ 、48
時 間 、AnaeroPack
®（ 三 菱 ガ ス 化 学 ）に よ る ガ ス パ ッ ク シ ス テ ム を 用 い た 嫌 気 培 養 に て 行 っ た 。NUM-Pg 9020
、NUM-Tf 9503
お よ びNUM-Tf 9505
は 、 著 者 ら が 以 前 行 っ た 研 究 に お い て 、 非 選 択 培 地 で あ るCDC
寒 天 培 地 を 用 い て 分 離 さ れ た 細 菌 株 で あ る 。 偏 性 嫌 気 性 菌 以 外 の 細 菌 株 の 培 養 はCDC
血 液 寒 天 培 地 を 用 い て 、37
℃ 、24
時 間 、5
％CO
2に 設 定 し たCO
2イ ン キ ュ ベ ー タ ー（NAPCO
ⓇModel 5400
；Precision Scientific, Chicago, IL, USA
） に て 行 っ た 。2
． 抗 菌 薬 に 対 す る 薬 剤 感 受 性 試 験P. gingivalis
お よ びT. forsythia
菌 株 の 薬 剤 感 受 性 試 験 は デ ィ ス ク 拡 散 法（
Sensi-Disk, Becton Dickinson Co., MD, USA
） お よ び 希 釈 法 を 用 い て 行 っ た 8)。3
． 本 研 究 で 開 発 し た 選 択 培 地 のP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 回 収 率6
10 %
羊 血 清 と1.5
％N-
ア セ チ ル ム ラ ミ ン 酸（20 µl
）を 添 加 し たOTEB
液 体 培 地 （Anaerobe systems, Morgan Hill, CA, USA
） に て37
℃ 、48
時 間 、5 %CO
2イ ン キ ュ ベ ー タ ー に て 前 培 養 し た 供 試 菌 液 を0.9 mL PBS
（0.01 M pH7.2
） に て10
倍 段 階 希 釈 し 、 そ の 菌 液100 μl
を 本 研 究 で 開 発 し た 選 択 培 地 お よ びCDC
血 液 寒 天 培 地 に 塗 抹 し 、37
℃ 、7
日 間 、AnaeroPack
®に よ る ガ ス パ ッ ク シ ス テ ム を 用 い た 嫌 気 培 養 に て 行 っ た 。 培 養 後 、 形 成 さ れ た 集 落 数 か ら 集 落 形 成 単 位 （colony forming units
；CFU
） を 算 定 し 、 選 択 培 地 のP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 回 収 率 をCDC
血 液 寒 天 培 地 と 比 較 す る こ と に よ り 求 め た 。4
． 被 験 者 、 試 料 採 取 お よ び 培 養 法歯 周 健 常 者 、す な わ ち 全 て の 歯 肉 溝 の 深 さ が
2 mm
程 度 で あ り 、付 着 の 喪 失 の な い 歯 周 組 織 が 健 常 な 者30
名 （ 平 均 年 齢23.2
歳 ：18
歳-33
歳 ） か ら 、 歯 内 療 法 用 ペ ー パ ー ポ イ ン ト （JM
ペ ー パ ー ポ イ ン ト ； 株 式 会 社 モ リ タ ） に よ りGCF
を10
秒 間2
回 採 取 し た 。 ま た 、 慢 性 歯 周 炎 と 診 断 さ れ ア タ ッ チ メ ン ト レ ベ ル5mm
以 上 を3
か 所 以 上 有 し 、 レ ン ト ゲ ン で 骨 吸 収 を 認 め た 患 者30
名 （ 平 均 年 齢53.6
歳：39
歳 －66
歳 ）の プ ロ ー ビ ン グ 時 の 出 血（Bleeding on probing
、以 下BOP
）を 伴 う 最 も 深 い 歯 周 ポ ケ ッ ト か ら 、 同 様 にGCF
を 採 取 し た 。 試 料 採 取 後 、 速 や か に300 µl
の 滅 菌PBS
（0.01 M pH 7.2
）の 入 っ た 滅 菌 チ ュ ー ブ に 試 料 を 浸 漬 し た 。 試 料 を 氷 冷 し な が ら20
秒 間 超 音 波 処 理 （50 W, 20 kHz, Astrason
ⓇSystem model
XL 2020
；Farmingda, NY, USA
） に て 分 散 後 、10
倍 段 階 希 釈 し た 各 試 料 液100 μl
を 本 研 究 で 開 発 し た 選 択 培 地 に 塗 抹 し た 。 ま た 、 総 菌 数 用 培 地 と し て 、CDC
血 液 寒 天 培 地 を 使 用 し た 。 培 養 は37
℃ 、48
時 間 、AnaeroPack
®に よ る ガ ス パ ッ ク シ ス テ ム を 用 い た 嫌 気 培 養 に て 行 っ た 。な お ，こ の 研 究 は ，日 本 大 学 松 戸 歯 学 部 倫 理 審 査 委 員 会 に て 承 認 を 受 け た 後 に 実 施 し た （EC18-033
）。7
5
．P. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 菌 種 同 定選 択 培 地 上 に 発 育 し た 集 落 は 一 次 鑑 別 と し て
P. gingivalis
お よ びT. forsythia
様 集 落 形 態 の 確 認 、 グ ラ ム 染 色 に よ っ て グ ラ ム 陰 性 桿 菌 で あ る こ と を 確 認 し 、P.
gingivalis
お よ びT. forsythia
と し て 集 落 数（CFU
）を そ れ ぞ れ 算 定 し た 。算 定 後 、P. gingivalis
お よ びT. forsythia
様 集 落 を 各 試 料 あ た り5
菌 株 釣 菌 し ，CDC
血 液 寒 天 培 地 に て 純 培 養 後 、本 研 究 で 設 計 し たP. gingivalis
お よ びT. forsythia
に 特 異 的 な16S rDNA
の プ ラ イ マ ー を 用 い たPCR
法 に よ り 、 菌 種 同 定 を 行 っ た 。6
．Direct multiplex PCR
法 に よ るP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 検 出培 養 法 で 使 用 し た 残 り の
GCF
試 料 を 用 い て 、 本 研 究 で 設 計 し たP. gingivalis
お よ びT. forsythia
に 特 異 的 な16S rDNA
の プ ラ イ マ ー を 用 い たDirect multiplex PCR
法 に よ り 、GCF
試 料 か らP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 検 出 を 行 っ た 。7
．P. gingivalis
お よ びT. forsythia
特 異 的16S rDNA
プ ラ イ マ ー の 設 計両 菌 種 特 異 的
PCR
プ ラ イ マ ー は 、生 命 情 報・DDBJ
セ ン タ ー（ 大 学 共 同 利 用 法 人 情 報 ・ シ ス テ ム 研 究 機 構 国 立 遺 伝 学 研 究 所 ） か ら 得 ら れ たP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の16S rDNA
の 配 列 に 基 づ き 、CLUSTAL W
（Genome Net /
京 都 大 学 化 学 研 究 所 バ イ オ イ ン フ ォ マ テ ィ ク ス セ ン タ ー ）を 用 い て マ ル チ プ ル・シ ー ケ ン ス・ア ラ イ メ ン ト 解 析 を 行 う こ と に よ り 設 計 し た 。そ の 後 、設 計 し た プ ラ イ マ ー の 特 異 性 はBLAST Search
（ 同 ） に よ り 検 索 し た 。8
．Direct multiplex PCR
法 の 確 立Direct multiplex PCR
反 応 液 組 成 は 、 各 々 の プ ラ イ マ ー4.0 µl
、10 µl
の2×MightyAmp Buffer Ver.3
（ タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 ）、0.4 µl
のMightyAmp DNA
Polymerase
（ タ カ ラ バ イ オ ）、DNA
抽 出 処 理 を 行 わ ず にGCF
試 料5.6 µl
を そ の ま8
ま
PCR
テ ン プ レ ー ト と し 、反 応 液 総 量 を20 µl
と し た 。PCR
条 件 と 電 気 泳 動 は 、 我 々 が 以 前 行 っ た 研 究 と 同 様 の 方 法 で 行 っ た 9)。ま た 、既 知 の 細 菌 数 を 滅 菌 精 製 水 に て 段 階 希 釈 し た 試 料 液 をPCR
の テ ン プ レ ー ト と し て 増 幅 の 有 無 を 確 認 す る こ と に よ り 、 本 研 究 で 設 計 し た 菌 種 特 異 的 プ ラ イ マ ー を 用 い たDirect multiplex PCR
法 の 検 出 限 界 を 調 査 し た 。結 果
1.
選 択 培 地 の 組 成デ ィ ス ク 拡 散 法 に て 、
P. gingivalis
お よ びT. forsythia
菌 株 が 感 受 性 を 示 さ な か っ た 抗 菌 薬 は 、phosphomycin
、polymyxinB
、mupirocin
お よ びkanamycin
で あ っ た 。 最 小 発 育 阻 止 濃 度 （MIC
） は そ れ ぞ れ 、1000 mg/l
、250 mg/l
、100 mg/l
お よ び1000 mg/l
で あ っ た 。 口 腔 内 の 常 在 菌 叢 の 主 要 な メ ン バ ー で あ るStreptococcus
属 菌 、Actinomyces
属 菌 、Corynebacterium
属 菌 、Veillonella
属 菌 お よ びFusobacterium
属 菌 な ど は 、 こ の 様 な 高 い 濃 度 のphosphomycin
、polymyxin
、mupirocin
お よ びkanamycin
に 対 し て 高 い 感 受 性 を 示 し た 。 こ れ ら の 結 果 を 踏 ま え て 選 択 培 地 の 組 成 を 決 定 し た 。CDC
血 液 寒 天 培 地 を 基 礎 培 地 と し 、250 mg/l kanamycin
、300 mg/l phosphomycin
、50 mg/l polymyxin
お よ び2 mg/l mupirocin
を 添 加 し た も の を 選 択 培 地 と し 、 本 選 択 培 地 をPGTFSM
と 命 名 し た 。 さ ら に 還 元 系 発 色 色 素 で あ る 塩 化 ト リ フ ェ ニ ル テ ト ラ ゾ リ ウ ム（TTC
）試 薬 を 用 い る こ と に よ り 、 培 地 上 に 形 成 さ れ たT. forsythia
の コ ロ ニ ー が 暗 紫 色 を 呈 し 、 コ ロ ニ ー の 識 別 が 容 易 に な る と こ ろ か ら25 mg/l TTC
を 添 加 し た 。基 礎 培 地 を オ ー ト ク レ ー ブ で 滅 菌 後 、50
℃ に 冷 却 し 各 抗 生 物 質 お よ びTTC
試 薬 を 加 入 し た 。 ま た 、T.
forsythia
を 良 好 に 発 育 さ せ る た め に 、 試 料 をPGTFSM
に 塗 抹 後 、 培 地 上 中 央 に 直 径1 cm
大 の ペ ー パ ー デ ィ ス ク を 置 き 、1.5
％N-
ア セ チ ル ム ラ ミ ン 酸 （20 µl
） を デ ィ ス ク に 浸 み 込 ま せ た 後 、 培 養 を 行 っ た 。9
2. Direct multiplex PCR
法 に よ るP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 同 定 と 検 出 本 研 究 で 設 計 し たP. gingivalis
お よ びT. forsythia
特 異 的16S rDNA
プ ラ イ マ ー を 表3
に 示 す 。P. gingivalis
お よ びT. fortythia
の 増 幅 サ イ ズ は 、338 bp
お よ び959 bp
で あ っ た 。 本 方 法 に よ る 両 菌 の 検 出 限 界 は 、PCR
テ ン プ レ ー ト5.6 µL
あ た り5 cells
以 上 で あ っ た 。P. gingivalis
株 、T. forsythia
株 、 両 菌 の 同 属 菌 種 お よ び 代 表 的 な 口 腔 細 菌 お よ び 両 菌 が 検 出 さ れ たGCF
試 料 に お け る 本 方 法 を 用 い た 同 定 ・ 検 出 結 果 を 図1
に 示 す 。P. gingivalis
株 とT. forsythia
株 は 、 そ れ ぞ れ338 bp
お よ び959 bp
に 増 幅 物 を 認 め た 。 ま た 、 両 菌 の 同 属 菌 種 お よ び 代 表 的 な 口 腔 細 菌 は 増 幅 物 を 認 め な か っ た 。 さ ら に 、GCF
試 料 で はP. gingivalis
とT. forsythia
の 増 幅 サ イ ズ に 相 当 す る 増 幅 物 を 全 く 認 め な い も の 、P. gingivalis
とT. forsythia
の 増 幅 サ イ ズ で あ る338 bp
と959 bp
の2
つ の 増 幅 物 を 認 め る も の 、P. gingivalis
の 増 幅 サ イ ズ の み を 認 め る も の 、 ま たT. forsythia
の 増 幅 サ イ ズ の み を 認 め る も の と 明 瞭 に 判 別 す る こ と が 可 能 で あ っ た 。3. PGTFSM
に お け るP. gingivalis
、T. forsythia
お よ び 代 表 的 な 口 腔 細 菌 の 回 収 率CDC
血 液 寒 天 培 地 と 比 較 し たPGTFSM
で のP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 回 収 率 を 表1
に 示 す 。全 て のP. gingivalis
お よ びT. forsythia
株 に お い てPGTFSM
で の 回 収 率（ 平 均97.1%
）は 良 好 で あ っ た 。ま た 、PGTFSM
に お け る 両 菌 の 同 属 菌 種 お よ び 代 表 的 な 口 腔 細 菌 の 発 育 抑 制 率 を 表2
に 示 す 。PGTFSM
は 、こ れ ら 細 菌 株 の 発 育 を 著 し く 抑 制 し た 。4. PGTFSM
を 用 い たGCF
試 料 か ら のP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 検 出 状 況PGTFSM
を 用 い た 歯 周 健 常 者 と 慢 性 歯 周 炎 患 者 のGCF
か ら のP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 検 出 状 況 を 表4
に 示 す 。 歯 周 健 常 者 と 慢 性 歯 周 炎 患 者 か ら 採 取10
し た
GCF
に お け る 総 細 菌 数 は 、1.70 × 10
6CFU/ml
お よ び7.99 × 10
6CFU/ml
で あ っ た 。歯 周 健 常 者 に お い て 、P. gingivalis
数 は2.3 × 10
3CFU/ml
で 総 細 菌 数 に 対 す る そ の 割 合 は0.13%
、ま たT. forsythia
数 は8.7 × 10
2CFU/ml
で 総 細 菌 数 に 対 す る そ の 割 合 は0.05%
で あ っ た 。 一 方 、 慢 性 歯 周 炎 患 者 に お い て は 、P. gingivalis
数 は2.1 × 10
5CFU/ml
で 総 細 菌 数 に 対 す る そ の 割 合 は2.56 %
、ま たT. forsythia
数 は7.1 × 10
4CFU/ml
で 総 細 菌 数 に 対 す る そ の 割 合 は0.89 %
で あ っ た 。 慢 性 歯 周 炎 患 者 は 歯 周 健 常 者 と 比 較 し て 、 総 細 菌 数 、P. gingivalis
数 お よ びT. forsythia
数 が 多 く 検 出 さ れ 、 両 菌 種 共 に 総 細 菌 数 に 対 す る 割 合 も 高 か っ た 。GCF
試 料 を 接 種 ・ 塗 抹 ・ 培 養 後 にPGTFSM
上 に 形 成 し たP. gingivalis
とT.
forsythia
の コ ロ ニ ー 像 を 図2
に 示 す 。PGTFSM
上 で 、P. gingivalis
は 円 形 で ブ ラ ウ ン が か っ た 黒 色 の ス ム ー ス コ ロ ニ ー を 形 成 し 、T. forsythia
はP. gingivalis
と 比 較 し て 小 さ く 、紫 が か っ た 白 色 の 円 形 で 、中 央 が 暗 紫 色 を 呈 す る ス ム ー ス コ ロ ニ ー を 形 成 し た 。PGTFSM
上 で 、 特 徴 的 な 集 落 外 観 を 呈 す る 両 菌 種 の コ ロ ニ ー は 、 他 の 細 菌 の コ ロ ニ ー と 容 易 に 識 別 す る こ と が 可 能 で あ っ た 。5. Direct Multiplex PCR
法 とPGTFSM
を 用 い た 培 養 法 と の 検 出 比 較Direct Multiplex PCR
法 とPGTFSM
を 用 い た 培 養 法 に よ る 歯 周 健 常 者 と 慢 性 歯 周 炎 患 者 のGCF
試 料 か ら のP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 検 出 頻 度 を 表5
に 示 す 。Direct Multiplex PCR
法 とPGTFSM
を 用 い た 培 養 法 に よ る 両 細 菌 の 検 出 頻 度 に 差 は 認 め ら れ ず 、ま た 各 方 法 に よ っ て 検 出 ま た は 未 検 出 の 被 験 者 も 同 一 で あ っ た 。歯 周 健 常 者 で はP. gingivalis
が 単 独 で 検 出 さ れ た 者 は0
名（0
％ ）、T. forsythia
が 単 独 で 検 出 さ れ た 者 は2
名 （6.7%
）、P. gingivalis
とT. forsythia
の 両 方 が 検 出 さ れ た の は3
名 （10%
） で あ っ た 。 一 方 、 慢 性 歯 周 炎 患 者 で はP. gingivalis
が 単 独 で 検 出 さ れ た 者 は2
名（6.7
％ ），T. forsythia
が 単 独 で 検 出 さ れ た 者 は12
名（40%
）、P. gingivalis
とT. forsythia
の 両 方 が 検 出 さ れ た の は16
名 （53.3%
） で あ り 、 歯 周11
健 常 者 と 比 較 し て 両 菌 種 の 検 出 頻 度 は 高 か っ た 。ま た 、両 群 に お い て 両 菌 種 共 に 検 出 さ れ る 傾 向 が 強 く 、さ ら に
P. gingivalis
よ り もT. forsythia
の 検 出 頻 度 が 高 か っ た 。考 察
歯 肉 縁 下 プ ラ ー ク 中 の あ る 特 定 の 微 生 物 群 に 感 染 し た 者 の み が ア タ ッ チ メ ン ト ロ ス を 伴 う 歯 周 炎 に 発 展 す る の で は な い か と 考 え 始 め ら れ る よ う に な っ て 以 来 、 そ れ ら 特 定 の 歯 周 病 関 連 微 生 物 に 対 し て 、 多 く の 研 究 が な さ れ て き た 10)。 そ の 中 で も 、
P. gingivalis
は 代 表 的 な 歯 周 病 原 細 菌 の 一 つ で あ り 、LPS
、 線 毛 、gingipain
、外 膜 小 胞 な ど 細 胞 傷 害 性 を 有 す る 多 く の 病 原 因 子 を も つ こ と が 知 ら れ て い る 11,12)。し か し 、全 て のP. gingivalis
が 同 程 度 の 歯 周 病 原 性 を 保 有 し て い る の で は な く 、歯 周 病 原 性 は 本 菌 の 線 毛 遺 伝 子 の 型 に よ っ て 異 な る と 考 え ら れ て い る 。即 ち 、6
種 類 の 線 毛 遺 伝 子 型 の う ち 、最 も 歯 周 炎 と 関 連 を 示 す の は Ⅱ 型 で あ り 、Ⅱ 型 線 毛 の 歯 周 病 原 性 は 極 め て 高 い と さ れ て い る 5,6,7)。ま た 、限 局 性 侵 襲 性 歯 周 炎 と 強 い 関 連 性 を 示 すAggregatibacter actinomycetemcomitans
に お い て も 、 本 菌 の 有 力 な 病 原 因 子 で あ る ロ イ コ ト キ シ ン の 活 性 発 現 が 菌 株 に よ り 異 な る こ と が 判 明 し て い る 13)。 一 方 、T. forsythia
も 、P. gingivalis
と 同 様 に 重 度 歯 周 疾 患 者 の 歯 周 ポ ケ ッ ト 内 か ら 検 出 さ れ 、そ の 病 原 性 が 注 目 さ れ て い る 。本 菌 が 保 有 す る 病 原 因 子 はtrypsin-like protease
13)、sialidase SiaH
414)お よ びNanH
15)、Karilysin
16) な ど が 報 告 さ れ て い る 。し か し な が ら 、T. fortythia
は 培 養 や 変 異 株 の 作 製 が 困 難 で あ る た め 、未 だ 不 明 な 点 が 多 い の が 現 状 で あ る 。ま た 、同 一 の 菌 種 で あ っ て も 菌 株 に よ っ て 病 原 性 が 異 な る こ と が 推 定 さ れ る 。そ の た め 、現 在 主 流 で あ る 菌 種 レ ベ ル で の 定 性・定 量 を 主 と し た 解 析 で は 、歯 周 疾 患 に 対 す る 精 度 の 高 い リ ス ク 評 価 や 病 態 の 把 握 は 出 来 な い こ と が 窺 わ れ る 。現 在 、
GCF
な ど の 口 腔 試 料 に お け る 歯 周 病 原 細 菌 の 検 出 に は 、 培 養 を 行 わ ず12
に 採 取 し た 試 料 か ら 直 接 細 菌
DNA
を 抽 出 し 、 遺 伝 子 学 的 に 目 的 と す る 細 菌 の 有 無 を 確 認 す るPCR
法4)や 菌 量 を 定 量 す るqPCR
法3)に よ る も の が 主 流 で あ る 。PCR
法 は 判 定 に 要 す る 時 間 が 短 く 、多 く の 検 体 を 一 度 に 調 査 で き る な ど の 利 点 が あ る 。 一 方 で 、 本 方 法 は 試 料 中 の 死 菌 も 検 出 さ れ 、 さ ら に は 検 出 に 用 い るPCR
用 プ ラ イ マ ー が 、標 的 と す る 細 菌 の み に 反 応 を 示 す 特 異 性 の 高 い 遺 伝 子 配 列 が 求 め ら れ る 。そ の た め 、厳 密 な 手 順 で 行 わ な け れ ばpositive-negative error
の 可 能 性 は 否 定 で き な い 。 ま た 、PCR
法 な ど の 遺 伝 子 学 的 手 法 を 用 い た 検 出 方 法 で は 、 標 的 細 菌 のphenotype
、genotype
お よ び 病 原 因 子 の 検 索 や 解 析 、 ま た 歯 周 治 療 を 目 的 と し た 抗 菌 薬 療 法 に お い て 有 用 な 薬 剤 の 選 定 を 行 う こ と は で き な い 。故 に 、こ れ ら を 成 し え る 為 に は 単 一 の 標 的 細 菌 を 培 養 法 に よ り 分 離 す る 必 要 が あ り 、雑 多 な 口 腔 試 料 か ら 標 的 と す る 細 菌 を 正 確 に 分 離 す る た め に 選 択 培 地 が 必 須 と な る 。選 択 培 地 は 、検 体 に 存 在 す る 微 生 物 の う ち 、特 定 の 形 質 の 微 生 物 を 意 図 的 に 優 先 ま た は 選 択 的 に 培 養 す る た め の 培 地 の こ と で 、病 原 体 の 分 離 培 養 に 用 い ら れ る 。 本 方 法 は 起 因 微 生 物 を 最 終 的 に 確 定 し 、さ ら に は 薬 剤 感 受 性 を 明 ら か に す る こ と が 可 能 と な り 、抗 菌 薬 療 法 に 用 い る 薬 剤 の 選 定 や 薬 剤 耐 性 傾 向 を 把 握 す る こ と が 可 能 な 非 常 に 有 用 な 手 法 で あ る 。故 に 選 択 培 地 を 用 い た 分 離 培 養 法 は 、感 染 症 の 疫 学 を 正 し く 把 握 す る う え で 重 要 で あ り 、
empiric therapy
（ 経 験 的 治 療 ） の 貴 重 な 情 報 源 と も な る 17)。こ れ ま で 、
P. gingivalis
の 分 離 に はCDC
嫌 気 性 菌 用 血 液 寒 天 培 地 にkanamycin
とvancomycin
が 添 加 さ れ た 偏 性 嫌 気 性 グ ラ ム 陰 性 桿 菌 の 選 択 培 地 が 使 わ れ て き た 18)。し か し な が ら 、本 選 択 培 地 上 に はP. gingivalis
を 含 む 偏 性 嫌 気 性 グ ラ ム 陰 性 桿 菌 の 全 て が 発 育 す る た め に 、選 択 性 の 問 題 か ら 偽 陰 性 を 生 じ る 可 能 性 が あ り 、 本 菌 を 確 実 に 分 離 す る こ と が 困 難 で あ っ た 。す な わ ち 、口 腔 に は700
菌 種 を 超 え る 細 菌 種 が 存 在 す る た め 19)、 雑 多 な 細 菌 で 占 め ら れ る 試 料 中 か ら タ ー ゲ ッ ト で あ るP. gingivalis
の み を 本 選 択 培 地 を 用 い て 確 実 に 検 出 ・ 定 量 ・ 分 離 す る こ と は13
不 可 能 で あ っ た 。 現 在 ま で 、
P. gingivalis
ま た はT. forsythia
を 確 実 に 分 離 可 能 な 選 択 培 地 は 未 だ 開 発 さ れ て い な い 。 そ こ で 著 者 ら は 、GCF
な ど の 口 腔 試 料 か らP. gingivalis
とT. forsythia
両 菌 種 を 高 精 度 、 か つ 同 時 に 分 離 ・ 定 量 可 能 な 選 択 培 地 を 開 発 し 、P. gingivalis
とT. forsythia
の 分 離・定 量 法 の 確 立 を 試 み た 。CDC
血 液 寒 天 培 地 を 基 礎 培 地 と し ，こ れ にkanamycin 250 mg/l
、phosphomycin 300 mg/l
、polymyxin 50 mg/l
お よ びmupirocin 2 mg/l
を 添 加 す る こ と に よ り 選 択 性 を 向 上 さ せ た 。さ ら に ，還 元 系 発 色 色 素 で あ るTTC
試 薬25mg/l
を 添 加 し た も の を 選 択 培 地 （PGTFSM
） と し た 。TTC
添 加 に よ り 、 培 地 上 のT. forsythia
の コ ロ ニ ー が 暗 紫 色 を 呈 し て 識 別 が 容 易 と な っ た 。 ま た 、PGTFSM
はCDC
血 液 寒 天 培 地 と 比 較 し て 、P. gingivalis
とT. forsythia
の 供 試 菌 株 で 平 均97.1%
と 高 い 回 収 率 を 示 し た 。 さ ら に 、PGTFM
はP. gingivalis
とT. forsythia
以 外 の 本 研 究 で 用 い た 供 試 菌 株 の 発 育 を 顕 著 に 抑 制 し た 。そ の た め 、今 回 開 発 し たPGTFM
の 選 択 性 は 優 れ て い る こ と が 示 さ れ た 。こ れ ま で に 報 告 さ れ て い る 歯 周 健 常 者 の
GCF
試 料 に お け るP. gingivalis
のPCR
法 に よ る 検 出 者 率 は 、日 本 で27.1 %
20)、ま た 国 外 で14.3 %
21)で あ り 、今 回 の 我 々 の 結 果10 %
と 近 似 し て い た 。 一 方 、T. forsythia
のPCR
法 に よ る 検 出 者 率 は 、 国 外 で10.5 %
22)や100 %
21)と 非 常 に 幅 が あ り 、今 回 の 我 々 の 結 果16.7%
は 比 較 的 低 い 傾 向 を 認 め た 。 ま た 、 こ れ ま で に 報 告 さ れ て い る 慢 性 歯 周 炎 患 者 のGCF
試 料 に お け るP. gingivalis
のPCR
法 に よ る 検 出 者 率 は 、国 外 で36.4 %
21)と 今 回 の 我 々 の 結 果60 %
は 比 較 的 高 い 傾 向 を 示 し た 。一 方 、T. forsythia
のPCR
法 に よ る 検 出 者 率 は 、国 外 で73.4 %
22)や100 %
21)で あ り 、今 回 の 我 々 の 結 果93.3 %
と 近 似 し て い た 。 被 験 者 の 人 種 の 違 い やPCR
法 の 手 技 や 試 薬 な ど の 違 い が 検 出 結 果 の 違 い に 僅 か な 影 響 を 及 ぼ し て い る と 考 え ら れ る 。ま た 、こ れ ま で の 報 告 と 同 様 に 慢 性 歯 周 炎 患 者 と 比 較 し て 歯 周 健 常 者 で は 両 菌 種 の 検 出 頻 度 は 高 く 21,22)、 両 菌 種 を 含 むred complex
が 歯 周 病 の 発 症 と 進 行 に 関 与 し て い る こ と が 伺 わ れ る 。 さ ら に14
本 研 究 で は 、両 群 に お い て 両 菌 種 共 に 検 出 さ れ る 傾 向 が 見 受 け ら れ た 。こ の こ と は 、
P. gingivalis
とT. fortythia
は 共 生 す る こ と に よ り 歯 周 病 の 発 症 、 進 行 、 増 悪 に 関 与 す る と い う 報 告 と 一 致 し て い る 2)。本 研 究 で 確 立 し た
Direct multiplex PCR
法 に よ るP. gingivalis
お よ びT. forsythia
の 同 定 と 検 出 方 法 は 、タ カ ラ バ イ オ 社 のMigthy amp®
を 用 い る こ と に よ り 、DNA
抽 出 作 業 が 不 要 と な り 、試 料 採 取 か ら 結 果 が 得 ら れ る ま で に 要 す る 時 間 は2
時 間 以 内 、ま たPCR
チ ュ ー ブ 一 つ のPCR
反 応 で 同 時 に2
菌 種 検 出 可 能 で あ る た め に 簡 易 性 に 優 れ 、高 精 度 か つ 迅 速 な 結 果 が 得 ら れ る 有 用 な 手 法 で あ る と 考 え ら れ る 。 ま た 、Direct Multiplex PCR
法 とPGTFSM
を 用 い た 培 養 法 に よ る 両 細 菌 の 検 出 頻 度 に 差 は 認 め ら れ な か っ た た め に 、PGTFSM
は 高 感 度 に 両 細 菌 を 検 出 可 能 な 優 れ た ツ ー ル で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。細 菌 の 持 つ 能 力 や 病 原 因 子 は 、感 染 力 、環 境 適 応 能 力 、多 種 の 毒 素 産 生 な ど 多 岐 に わ た り 複 雑 で 、同 じ 細 菌 内 の 株 に よ っ て も 多 様 性 を 示 す 。今 後 、我 々 が 開 発 し た
PGTFSM
に よ り 、 菌 株 レ ベ ル で の 解 析 、 す な わ ち 病 原 マ ー カ ー の 検 索 ・ 解 析 が 進 み 、疾 患 特 異 的 病 原 マ ー カ ー の 特 定 に 繋 が る こ と が 期 待 さ れ る 。そ れ に よ り 、 単 な る 細 菌 数 の 定 量 で は な く 病 原 因 子 の 定 量 が チ ェ ア サ イ ド で 可 能 と な り 、 歯 周 病 の 診 断 や 治 療 効 果 の 即 時 判 定 に 有 用 な 細 菌 検 査 が 確 立 で き る と 思 わ れ る 。参 考 文 献
1) Papapanou PN, Sanz M, Buduneli N, Dietrich T, Feres M, Fine DH, Tonetti MS:
Periodontitis: consensus report of workgroup 2 of the 2017 world workshop on the classification of periodontal and peri-implant diseases and conditions, J Clin Periodont, 45: S162-S170, 2018
2) Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL: Microbial complexes
in subgingival plaque, J Clin Periodont, 25: 134-144, 1998
15
3) Marín MJ, Ambrosio N, O’Connor A, Herrera D, Sanz S, Figuero E: Validation of a multiplex qPCR assay for detection and quantification of Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythia in subgingival plaque samples. Arch Oral Biol, 102: 199-204, 2019
4) Ashimoto A, Chen C, Bakker I, Slots J: Polymerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions, Oral Microbiol Immunol, 11: 266-273, 1996
5) Nakagawa I, Amano A, Ohara-Nemoto Y, Endoh N, Morisaki I, Kimura S, Kawabata S, Hamada: Identification of a new variant of fimA gene of Porphyromonas gingivalis and its distribution in adults and disabled populations with periodontitis. J Periodontal Res, 37: 425-432, 2002
6) Missailidis CG, Umeda JE, Ota‐Tsuzuki C, Anzai D, Mayer MP: Distribution of fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis in subjects with various periodontal conditions, Oral Microbiol Immunol, 19: 224-229, 2004
7) Van Der Ploeg JR, Giertsen E, Ludin B, Morgeli C, Zinkernagel AS, Gmur R:
Quantitative detection of Porphyromonas gingivalis fimA genotypes in dental plaque, FEMS Microbiol Lett, 232: 31-37, 2004
8) Hirasawa M, Takada K: Susceptibility of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus to cell wall inhibitors and development of a novel selective medium for S.
sobrinus , Caries Res, 36: 155-160, 2002
9) Tsuzukibashi O, Uchibori S, Kobayashi T, Umezawa K, Mashimo C, Nambu T, Saito M, Hashizume-Takizawa T, Ochiai T: Isolation and identification methods of Rothia species in oral cavities, Microbiol Methods, 134: 21-26, 2017
10) Christersson LA, Zambon JJ, Genco RJ: Dental bacterial plaques. Nature and
role in periodontal disease, Clin Periodotol, 8: 441-446, 1991
16
11)
Olsen I, Lambris JD, Hajishengallis G: Porphyromonas gingivalis disturbs host-commensal homeostasis by changing complement function, J Oral Microbiol, 9: 1340085, 201712) Holt SC, Kesavalu L, Walker S, Genco CA: Virulence factors of Porphyromonas gingivalis , Periodontol 2000, 20: 168-238, 1999
13) Haubek D, Poulsen K, westergaard J, Dahlen G, Kilian M: Highly toxic clone of Actinobacillus actinomycetemcomitans in geographically wide-spread cases of juvenile periodontitis in adolescents of African origin, J Clin Microbiol, 34:
1576-1578, 1996
14) Grenier D: Nutritional interactions between two suspected periodontopathogens, Treponema denticola and Porphyromonas gingivalis , Infect Immun, 60: 5298-5301, 1992
15) Braham PH, Moncla BJ: Rapid presumptive identification and further characterization of Bacteroides forsythus , J Clin Microbiol, 30, 649-654, 1992 16) Thompson H, Homer KA, Rao S, Booth V, Hosie AH: An orthologue of
Bacteroides fragilis NanH is the principal sialidase in Tannerella forsythia , 191:
3623-3628, 2009
17) Karim AY, Kulczycka M, Kantyka T, Dubin G, Jabaiah A, Daugherty PS, Thogersen IB, Enghild JJ, Nguyen KA, Potempa J: A novel matrix metalloprotease-like enzyme (karilysin) of the periodontal pathogen Tannerella forsythia ATCC 43037, Biol Chem, 391: 105-117, 2010
18) Ndip RN, MacKay WG, Farthimg MJ, Weaver LT: Culturing Helicobacter pylori from clinical specimens: review of microbiologic methods, Pediatr Gastroenterol Nutr, 36: 616-622, 2003
19) van Winkelhoff AJ, J de Graaff: Vancomycin as a selective agent for isolation of
17
Bacteroides, J Clin Microbiol, 18:1282-1284, 1983
20) Aas JA, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst FE: Defining the normal bacterial flora of the oral cavity, J Clin Microbiol, 43: 5721-5732, 2005
21) Yoshida Y, Suzuki N, Nakano Y, Shibuya K, Ogawa Y, Koga T: Distribution of Actinobacillus actinomycetemcomitans serotypes and Porphyromonas gingivalis in Japanese adults, Oral Microbiol Immunol,18:135-139, 2003
22) van der Reijden WA, Bosch-Tijhof CJ, Strooker H, van Winkelhoff AJ: prtH in Tannerella forsythensis is not associated with periodontitis, J Periodontol, 77:
586-590, 2006
18
表
1 PGTFSM
におけるP. gingivalis
とT. forsythia
の回収率細菌株
CDC
血液寒天培地PGTFSM
回収率（%
）CFU/ml× 10
8CFU/ml× 10
8P. gingivalis
ATCC 33277 1.8 ± 0.2
a1.8 ± 0.1 98.9
JCM 8525 1.6 ± 0.3 1.6 ± 0.3 97.5
Strain 381 1.9 ± 0.3 1.8 ± 0.2 95.3
NUM-Pg 9020 1.6 ± 0.1 1.5 ± 0.3 94.5
T. forsythia
JCM 10910 2.1 ± 0.2 2.0 ± 0.1 96.7
NUM-Tf 9503 3.1 ± 0.1 3.1 ± 0.3 98.7
NUM-Tf 9505 1.8 ± 0.1 1.7 ± 0.2 97.2
a
Ave ± SD.
19
表
2 PGTFSM
における代表的な口腔細菌の発育抑制率細菌株
CDC
血液寒天培地PGTFSM
回収率CFU/ml× 10
8CFU/ml × 10
8% Porphyromonas endodontalis
ATCC 35406 1.1 0.003 <0.0
bPorphyromonas asaccharolyticus
JCM 6326 2.3 0 0
Porphyromonas bennonis
JCM 16335 1.8 0 0
Porphyromonas uenonis
JCM 13868 0.9 0 0
Tannerella sp.
JCM 31301 0.2 0 0
Prevotella intermedia
ATCC 25611 1.3 0 0
Prevotella nigrescens
ATCC 33563 0.5 0 0
Fusobacterium nucleatum
JCM 8532 1.1 0 0
Streptococcus oralis
ATCC 35037 1.5 0 0
Streptococcus salivarius
JCM 5707 2.8 0 0
Streptococcus anginosus
ATCC 11391 3.1 0.0009 <0.0
bStreptococcus mutans
NCTC 10449 5.5 0 0
Streptococcus sobrinus
ATCC 33478 7.4 0 0
Actinomyces naeslundii
ATCC 12104 1.2 0 0
Actinomyces oris
ATCC 27044 2.5 0 0
Actinomyces odontlyticus
ATCC 17929 2.2 0 0
Corynebacterium matruchotii
ATCC10790 1.9 0 0
Corynebacterium durum
ATCC22586 0.3 0 0
N. sicca
ATCC 29256 2.8 0 0
b
Less than 1 × 10
6CFU/ml.
20
表
3 P. gingivalis
およびT. forsythia
特異的16S rDNA
プライマーの配列Species Primer Sequence Product size (bp) Position Accession number
P. gingivalis PGF ACAGAGGGGGATAACCCGTT 338 139-158 AB547661
PGR ATGCAATACTCGTATCGCC 476-458
T. forsythia TFF GATGGTAGCAATACCTGTC 959 71-89 AB035460
TFR GACGCCCCGAAGGGAAGAAA 1029-1010
21
表
4 PGTFSM
を用いた歯肉溝滲出液試料からのP. gingivalis
およびT. forsythia
の検出状況被験者数 総細菌数
P. gingivalis T. forsythia
CDC
血液寒天培地PGTFSM
総細菌数に対する割合
PGTFSM
総細菌数に対する割合
CFU/ml× 10
6CFU/ml× 10
6% CFU/ml× 10
6%
歯周健常者
30 1.70 0.0023 0.13 0.00087 0.05
(1.0 - 3.1)
a(0 - 0.05)
a(0 - 0.01)
a慢性歯周炎患者
30 7.99 0.21 2.56 0.07 0.89
(2.2 - 14.0)
a(0 - 1.6)
a(0– 0.17)
aa
Range.
22
表
5 Direct Multiplex PCR
法とPGTFSM
を用いた培養法の検出比較Species
歯周健常者（N=30
） 慢性歯周炎患者（N=30
）PCR
培養法PCR
培養法検出者数（頻度
; %
）P. gingivalis alone 0 (0) 0 (0) 2 (6.7) 2 (6.7)
T. forsythia alone 2 (6.7) 2 (6.7) 12 (40) 12 (40)
P. gingivalis + T. forsythia 3 (10) 3 (10) 16 (53.3) 16 (53.3)
検出なし
25 (83.3) 25 (83.3) 0 (0) 0 (0)
23
図
1 Direct multiplex PCR
法によるP. gingivalis
およびT. forsythia
の同定と検出Primers are a mixture of PGF, PGR, TFF, and TFR.
Lanes: 1, Porphyromonas gingivalis ATCC 33277; 2, Tannerella forsythia JCM 10910; 3, P. endodontalis ATCC 35406; 4, P. asaccharolyticus JCM 6326;
5, P. bennonis JCM 16335; 6, P. uenonis JCM 13868; 7, Tannerella sp. JCM 31301; 8, Prevotella intermedia ATCC 25611; 9, P. nigrescens ATCC 33563;
10, Fusobacterium nucleatum JCM 8532; 11, Streptococcus oralis ATCC 35037; 12, S. salivarius JCM 5707; 13, S. mutans NCTC 10449; 14, Corynebacterium matruchotii ATCC 14266; 15, C. durum ATCC 33449; 16, Neisseria sicca ATCC 29256; 17, Veillonella parvula JCM 12972; 18, V.
dispar DSM 20735; 19, Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 33384; 20, P. gingivalis and T. forsythia negative sample; 22, P. gingivalis and T.
forsythia positive sample; 23, P. gingivalis positive sample; 24, T. forsythia positive sample. M, molecular size marker (100-bp DNA ladder).
24
図
