皮膚・気道・鼻粘膜局所におけるresidential cellによる生体防御機構のアレルギー疾患 における役割の解析に関する研究 主任研究者 岩本逸夫（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学 助教授） 分担研究者 福田 健（獨協医科大学呼吸器・アレルギー内科教授） 秋山一男（国立相模原病院臨床研究センター長） 田村 弦（東北大学医学部附属病院感染症・呼吸器内科講師） 研究協力者 中島裕史（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学助手） 須藤 明（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学） 鈴木浩太郎（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学） 広瀬晃一（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学） 前沢裕子（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学） 瀬戸洋平（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学） 池田 啓（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学） 玉地智宏（千葉大学大学院医学研究院細胞治療学） 杉山公美弥（獨協医科大学呼吸器・アレルギー内科） 成 剛（獨協医科大学呼吸器・アレルギー内科） 平田博国（獨協医科大学呼吸器・アレルギー内科） 本多京子（獨協医科大学呼吸器・アレルギー内科） 釣木澤尚実（国立相模原病院臨床研究センター） 谷口正実（国立相模原病院臨床研究センター室長） 斎藤博士（国立相模原病院臨床研究センター室長） 粒来崇博（国立相模原病院臨床研究センター） 冨田君子（国立相模原病院臨床研究センター） 西山晃好（国立相模原病院臨床研究センター） 豊田信明（国立相模原病院臨床研究センター） 森田園子（国立相模原病院臨床研究センター） 大友 守（国立相模原病院臨床研究センター） 前田裕二（国立相模原病院臨床研究センター） 佐野公仁夫（東北大学医学研究科内科病態学感染症部門助教授） 大河原雄一（東北大学医学部附属病院感染症・呼吸器内科助手）
研究要旨 本研究班は、重症喘息の病因・病態の解明と新規治療法の開発を目的とし、本年度 は以下の重要な研究成果を得た。 1)アレルギー性気道炎症の制御機構について、T細胞サイトカインIL-21は、IFN-γ 産生誘導を介しIgE産生及びアレルギー性気道炎症を抑制的に制御していることを 明らかにした。さらに肺特異的IL-25トランスジェニックマウスの解析により、新 規のTh2細胞サイトカインIL-25は、アレルギー性気道炎症を増強し、遷延化・重症 化に関与することが示唆された。 2)アレルギー性気道炎症の新規免疫療法として、CpGDNA-アレルゲン結合体結合 体は樹状細胞の抗原取り込みを劇的に増加させ、成熟・活性化を誘導することによ り、気道炎症を抗原特異的に強力に抑制することを明らかにした。 3)気道リモデリングによる気道過敏性の発症機序について、Th2細胞のIL-5が好酸 球性炎症を介さず、直接気道平滑筋の反応性亢進を惹起する可能性が示唆された。 4)喘息患者のT細胞活性化異常について、喘息患者のnaive CD4+T細胞は健常者に比 しMDCとTARCを大量に産生し、Th2型気道炎症の誘導、維持に関与している可能 性が示唆された。 5)重症喘息であるChurg-Strauss症候群 (CSS) の早期診断と治療効果の判定には、活 性化好酸球と活性化CD4+T細胞が指標になることが明らかにされた。 これらの成果から、重症喘息の気道炎症及び気道リモデリングの発症維持・重症化 に関与する分子群をターゲットとする新しい治療薬開発の可能性が示唆される。 気管支喘息の病態であるアレルギー性気道炎症は、Th2細胞の選択的活性化、Th2 細胞と好酸球を主体とする炎症細胞浸潤、気道過敏性、粘液細胞の増加により特徴 づけられる。さらに持続性気道炎症による気道構成細胞の活性化とその結果生じる 気道リモデリングが重症化を促す。したがって、重症喘息の病因・病態の解明と新 規治療法の開発には、1)アレルギー性気道炎症の成立機序及びその制御機構の解明が 必須であるとともに、2)気道リモデリングの発症機序の解明と制御法の開発が必要と なる。さらに、3)重症喘息のT細胞、好酸球の異常活性化機序の解明とその制御法の 開発が重要である。本研究班は、これら研究テーマを明らかにし、その成果に基づ く重症喘息の新治療法を開発することを目的とする。 1)アレルギー性気道炎症の新たな制御機構の解明 1．IL-21によるアレルギー性気道炎症の制御機構(岩本) IL-21は活性化CD4陽性T細胞から産生される新規サイトカインで、T細胞増殖及 びNK細胞分化を誘導することが示されている。本研究では、IL-21のB細胞の免疫グ ロブリン産生に対する効果、ヘルパーT細胞の分化制御に対する効果、さらにアレル ギー性気道炎症制御における役割をマウス喘息モデルを用い検討した。さらにIL-21 のIgE産生抑制の分子機構を解析した。感作マウスにリコンビナントIL-21を投与す ると、抗原特異的IgE産生が著明に抑制され、抗原吸入によるアレルギー性気道炎症 も抑制された。しかし、 IL-21産生はTh1細胞/Th2細胞間で差はなく、またIL-21 は、Th1細胞/Th2細胞分化に影響を与えなかった。IL-21は、LPS+IL-4刺激によるB 細胞からのIgE産生を用量依存的に抑制し、その作用は、IL-21に対して中和活性を 有するsoluble IL-21 receptorの投与により解除された。しかし IL-21は他のクラスの 免疫グロブリン産生には影響を与えなかった。そしてIL-21は、LPS+IL-4刺激によ るB細胞におけるgermline Ce transcript産生を抑制したが、IL-4によるStat6のリン酸化 及びLPSによるNF-kBの活性化を抑制しなかった。さらにIL-21によるIgE産生抑制 は、抗IFN-γ抗体により部分的に阻害され、IFN-γ産生誘導を介することが示唆さ れた。以上より、IL-21はIgE産生及びアレルギー性気道炎症を抑制的に制御してい
ることが明らかとなった。
2．新規サイトカインIL-25のアレルギー性気道炎症の遷延化・重症化における役割( 岩本)
IL-25は新規のTh2細胞性サイトカインで、非T細胞からIL-4, IL-5, IL-13産生を惹 起することから、アレルギー性炎症の増強及び遷延化に関与している可能性が推測 されている。しかしながら、アレルギー性炎症におけるIL-25の役割は依然不明であ る。そこで本研究では、肺特異的IL-25トランスジェニック (Tg) マウスを作製し、ア レルギー性気道炎症におけるIL-25の役割を検討した。CC10 promoterの制御下にIL-25を発現するTgマウスは5ラインが樹立された。肺特異的IL-25 Tgマウスは、いずれ においても肺特異的IL-25 mRNAの発現が確認された。しかし、IL-25発現のみでは アレルギー性気道炎症は惹起されなかった。次に肺におけるIL-25過剰発現の効果を マウス喘息モデルを用い検討した。肺特異的IL-25 Tgマウスを感作、抗原吸入すると アレルギー性気道炎症及び気道のTh2サイトカイン産生が増強された。これらの結果 から、IL-25は、アレルギー性気道炎症を増強し、遷延化・重症化に関与することが 示唆される。 2)CpGDNA-アレルゲン結合体によるアレルギー性気道炎症の制御機構の解明(田村) 昨年度の本研究で、CpGDNAを抗原と直接結合するという新しい方法を導入する ことによって、アレルギー性好酸球性気道炎症の抑制効果が著しく増強 し、CpGDNAの投与量を1/100に減量できることを発見した。したがって、CpG-抗原 結合体は将来有望な抗原特異的な抗アレルギーDNAワクチン療法として、その有用 性が期待される。 今年度の本研究では、CpG-抗原結合体によるアレルギー性気道炎症の制御機構を 解明するために、CpGを介した樹状細胞による抗原取り込みを解析した。樹状細胞に よるCpG-抗原結合体の取り込みを観察するため、蛍光蛋白であるR-PEをCpGと結合 させ、樹状細胞に取り込まれたR-PEをフローサイトメトリーで解析した。R-PEの み、R-PEとCpGを同時に、もしくはCpG-R-PE結合体をマウス樹状細胞に加え、3時 間培養した。R-PEのみを加えた場合はR-PE陽性の樹状細胞は数％であり、R-PE とCpGを同時に加えてもその割合は増加しなかった。しかし、R-PEとCpGを結合体 にするとR-PE陽性細胞が劇的に上昇し、88％となり、ほとんどの樹状細胞にR-PEが 結合、もしくは取り込まれたと考えられた。 次に樹状細胞のCpG-抗原結合体取り込みによる成熟化・活性化について、その指 標であるCD40とCD86の発現をCpGとR-PEの同時投与と結合体投与を比較した。樹 状細胞にCpG-R-PE結合体を加え一晩培養した。R-PEのみを加えた場合はR-PEを取 り込んだ樹状細胞のCD40の発現が弱く、CpGを同時に加えるとR-PEを取り込んだ樹 状細胞のCD40発現は高かった。CpG-R-PE結合体を加えるとほとんどの樹状細胞がR-PEを取り込み、CD40もCD86の発現も増強しており、CpG-抗原結合体により抗原が 効率よく樹状細胞に取り込まれると同時に成熟・活性化されることが示された。 3)気道リモデリングによる気道過敏性の発症機序の解明(福田) 慢性喘息の気道過敏性亢進には持続的Th2型気道炎症と気道リモデリングが関与す るが詳細は不明である。最近、IL-5が気管支平滑筋のアセチルコリンに対する反応 性を亢進することが報告された。本研究では、IL-5が慢性喘息における気道反応性 亢進に関与しているか否かをマウス慢性喘息モデルを用い検討した。 感作マウスに抗原吸入を3日間あけて2回行い急性モデルとした。また、連日14日 間抗原吸入で気道リモデリングを誘発した後に再度抗原吸入を行ったものを慢性モ デルとした。両モデル共に、最終抗原吸入曝露24時間前に抗IL-5抗体または抗IL-5 受容体抗体を腹腔投与し、抗原吸入24時間後にアセチルコリンに対する気道反応性 測定と気管支肺胞洗滌(BAL)を行った。 抗IL-5抗体ないし抗IL-5受容体抗体を投与した急性喘息モデルでは、 BAL液中好 酸球数はコントロール抗体投与群に比し有意に少なく、気道反応性亢進も有意に抑 制されていた。一方、慢性モデルでは抗IL-5抗体投与は好酸球数増加を抑制した が、気道反応性亢進は抑制しなかった。しかし、抗IL-5受容体抗体投与により気道 反応性亢進も有意に抑制された。今回の結果は、慢性喘息における気道過敏性亢進 にはIL-5が好酸球を介せず直接関与する可能性を示唆する。
4)喘息患者CD4+T細胞およびサブセットのMDC/TARC産生能の解析(福田) 昨年度までの本研究で、Th2型気道炎症の誘導・維持機構については、IL-9 やPGD2 刺激で気道上皮細胞から産生されるTh2細胞特異的遊走ケモカインのMDC やTARCが関与する可能性を示してきた。今回は喘息患者のT細胞はこれらケモカイ ンを産生するか否か、どのT細胞サブセットが産生するかを明らかにすることを目的 とした。健常人、喘息患者末梢血CD4+T細胞は共に抗CD3 抗体+抗CD28抗体刺激に よりMDC、TARCを産生したが、産生量は圧倒的に喘息患者で大であった。これら ケモカインを産生するサブセットはCD45RO+CD4+T細胞 (memory/effector T細胞)では なく、CD45RA+CD4+T細胞 (naive T 細胞)であった。さらにin vitroで分化させたTh2 細胞株はTh1細胞株に比し有意に多い MDCとTARCを産生したが、naive T細胞ほどで はなかった。本研究により、喘息患者naive T細胞はMDCとTARCを大量に産生 し、Th2型気道炎症の誘導、維持に寄与している可能性が示唆された。 5)Churg-Strauss syndrome (CSS)の早期診断法と治療法の開発(秋山) CSSは重症喘息と末梢血好酸球増多を呈する全身性壊死性血管炎で、一般喘息とは 病態が異なり、11T細胞及び好酸球活性化による好酸球性炎症を主体とした過敏性と 考えられる。本研究は、CSSの病態と早期診断及び治療法を明らかにするため、血管 炎発症前から臨床経過を追跡できたCSS(11症例)について末梢血T細胞、好酸球の活 性化マーカーを発症時、ステロイド減量後、再燃時に検討し、さらにCD25+CD4+T 細胞とCD25-CD4+T細胞のIL-5産生能の差異について検討した。 一般喘息では重症度により末梢血好酸球数には差を認めないが、CSS発症時に著明に 増加した。活性化好酸球(CD69+CCR3+)は重症喘息の一部でのみ検出され、CSS発症 時に著明に増加した。ステロイド減量後再燃時のCSSでは末梢血好酸球数は治療後安 定期と比較して有意差を認めないが、活性化好酸球(％)は増加した。一般喘息全体で はCD25+CD4+T細胞数が高値であるが、CSS発症時は低値であった。CD69+CD4+T細 胞数は喘息重症度に応じて増加しCSS発症時に著増した。CSS発症時に はCD69+CD4+T細胞数高値、CD25+CD4+T細胞数低値であるのに対し、治療後安定 期にはCD69+CD4+T細胞数低下、CD25+CD4+T細胞数増加した。また再燃時に はCD69+CD4+T細胞数増加、CD25+CD4+T細胞数低下した。IL-5産生 はCD25+CD4+T細胞では一般喘息、CSSともに産生し(76.9% vs. 85.7%)、CD25-CD4+T細胞では一般喘息での産生率が23.1%であるのに対し、CSSでは85.7%が産生 した。 今回の結果からCSSの発症、鎮静化、増悪のメカニズムにCD25+CD4+T細胞が関与 している可能性が示唆される。またCSSでは一般喘息と比較してCD25-CD4+T細胞 のIL-5産生能が亢進しており、CSSと一般喘息の病態が異なることを示唆している。 以上から、活性化T細胞の解析により、CSSの発症予知、早期診断、治療効果の判 定、治療薬減量の基準が確立できる可能性がある。 倫理面への配慮 本研究を遂行するにあたり、対象とする喘息患者から提供される検体の取得に際 しては、担当医師から研究の方法、必要性、危険性及び有用性さらに拒否しても不 利益にならないことを十分に説明した後、同意が得られた場合のみ行った。また実 験動物を用いた研究は、動物愛護に配慮し、実験は実験動物委員会の規定に従い遂 行した。 本年度の研究により、重症喘息の病因・病態の解明、治療法の開発に重要な多く の研究成果が得られた。 1)アレルギー性気道炎症の制御機構について、T細胞サイトカインIL-21は、IFN-γ 産生誘導を介しIgE産生及びアレルギー性気道炎症を抑制的に制御していることが明 らかとなった。さらに肺特異的IL-25トランスジェニックマウスの解析により、新規 のTh2細胞サイトカインIL-25は、アレルギー性気道炎症を増強し、遷延化・重症化 に関与することが示唆された。
2)CpGDNA-アレルゲン結合体によるアレルギー性好酸球性気道炎症の制御機構を解 析し、CpGDNA-抗原結合体が樹状細胞の抗原取り込みを劇的に増加させ、かつ成熟 ・活性化を誘導することを明らかにした。したがって、CpGDNA-抗原結合体は有望 な抗原特異的な抗アレルギーDNAワクチン療法である。 3)気道リモデリングによる気道過敏性の発症機序について、Th2細胞のIL-5が好酸球 性炎症を介さず、直接気道平滑筋の反応性亢進を惹起する可能性が示唆された。 4)喘息患者のnaive CD4+T細胞は健常者に比しMDCとTARCを大量に産生し、Th2型気 道炎症の誘導、維持に関与している可能性が示唆された。 5)重症喘息であるCSSの早期診断と治療効果の判定には、活性化好酸球と活性 化CD4+T細胞が指標になることが明らかにされた。さらにCD25-CD4+T細胞のIL-5 産生能も有用である。 これらの成果から、重症喘息の気道炎症及び気道リモデリングの発症維持・重症化 に関与する分子群をターゲットとする新しい治療薬開発の可能性が示唆される。 なし 1. 論文発表
1. Suzuki K, Nakajima H, Ikeda K, Maezawa Y, Suto A, Takatori H, Saito Y, Iwamoto I. IL-4-Stat6 signaling induces tristetraprolin expression and inhibits TNF-a production in mast cells. J Exp Med. 2003; 198: 1717-1727.
2. Suzuki K, Nakajima H, Ikeda K, Tamachi T, Hiwasa T, Saito Y, Iwamoto I. Stat6-protease but not Stat5-protease is inhibited by an elastase inhibitor, ONO-5046. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 309: 768-773.
3. Seto Y, Nakajima H, Suto A, Shimoda K, Saito Y, Nakayama K, Iwamoto I. Enhanced Th2 cell-mediated allergic inflammation in Tyk2-deficient mice. J. Immunol. 2003; 170: 1077-1083.
4. Ikeda K, Nakajima H, Suzuki K, Kagami S, Hirose K, Suto A, Saito Y, Iwamoto I. Mast cells produce interleukin-25 upon FceRI-mediated activation. Blood 2003; 101: 3594-3596. 5. Maezawa Y, Nakajima H, Seto Y, Suto A, Kumano K, Kubo S, Karasuyama H, Saito Y, Iwamoto I. IgE-dependent enhancement of Th2 cell-mediated allergic inflammation in the airways. Clin. Exp. Immunol. 2004; 135: 12-18.
6. Mori Y, Hirose K, Suzuki K, Nakajima H, Seto Y, Ikeda K, Shimoda K, Nakayama K, Saito Y, Iwamoto I. Tyk2 is essential for IFN-a-induced gene expression in mast cells. Int. Arch. Allergy Immunol. In Press.
7. Honda K, Arima M, Cheng G, Taki S, Hirata H, Eda F, Fukushima F, Yamaguchi B, Hatano M, Tokuhisa T, Fukuda T. Prostaglandin D2 reinforces Th2 type inflammatory responses of airways to low-dose antigen through bronchial expression of macrophage-derived chemokine. J Exp Med. 2003; 198: 533-43.
8. Hirata H, Arima M, Cheng G, Honda K, Fukushima F, Yoshida N, Eda F, Ishii Y, Fukuda T. Production of TARC and MDC by naive T cells in asthmatic patients. J Clin Immunol 2003; 23: 34-45．
9. 福田健. 好酸球．小林節雄, 宮本昭正, 中島重徳 編, 第22回六甲カンファレンス, 喘息 に関する細胞をめぐって(最近の進歩),ライフサイエンス出版, pp.57-65, 2003． 10. Shirota H, Sano K, Hirasawa N, Terui T, Ohuchi K, Hattori T, Shirato K, Tamura G.
Novel roles of CpG oligodeoxynucleotides as a leader for the sampling and presentation of CpG-tagged Ag by dendritic cells. J Immunol. 2001; 167: 66-74.
11. Shirota H, Sano K, Hirasawa N, Terui T, Ohuchi K, Hattori T, Tamura G. B cells capturing Ag conjugated with CpG oligodeoxynucleotides induce Th1 cells by elaborating IL-12. J Immunol. 2002; 169: 787-94.
12. Sano K, Shirota H, Terui T, Hattori T, Tamura G. Oligodeoxynucleotides without CpG motifs work as adjuvant for the induction of Th2 differentiation in a sequence-independent manner. J Immunol. 2003; 170: 2367-73.
13. Tsurikisawa N, Taniguchi M, Saito H, Himeno H, Ishibashi A, Suzuki S, Akiyama K. Treatment of Churg-Strauss syndrome with high-dose intravenous immunoglobulin. Annals Allergy Asthma Immunol. 2004; 92: 80-87.
14. 釣木澤尚実 秋山一男. Churg-Strauss症候群と神経症状(ニューロパチー). 呼 吸22(4): 349-356, 2003. 2. 学会発表 1．高取宏昌、中島裕史、鈴木浩太郎、齋藤康、岩本逸夫(2003) Stat6非依存性Th2細 胞分化におけるStat5aの役割. 第33回日本免疫学会総会 33:206. 2．須藤 明、中島裕史、岩本逸夫、齋藤 康 (2003) IL-21によるIgE産生抑制機構の 解明. 第53回日本アレルギー学会総会 アレルギー 52:925. 3．鈴木浩太郎、中島裕史、岩本逸夫、齋藤 康 (2003) 蛋白分解によるStatシグナル の負の制御. 第53回日本アレルギー学会総会 アレルギー 52:865. 4．玉地智宏、森由美子、廣瀬晃一、鈴木浩太郎、中島裕史、岩本逸夫、齋藤 康、 下田和哉、中山敬一 (2003) 肥満細胞におけるIFN-a-Tyk2シグナルの役割. 第53回日 本アレルギー学会総会 アレルギー 52:866. 5．池田 啓、中島裕史、鈴木浩太郎、前沢裕子、岩本逸夫、齋藤 康 (2003) 肥満細 胞からのIL-25産生機構の解明. 第53回日本アレルギー学会総会 アレルギー 52:865. 6. Nakajima H, Ikeda K, Suzuki K, Suto A, Iwamoto I. (2003) Mast cells produce Interleukin-25 upon IgE-mediated activation. 90th AAI meeting.
7. Ikeda K, Nakajima H, Suzuki K, Suto A, Iwamoto I (2003) Characterization of mast cell-specific Stat6 protease. 90th AAI meeting.
8. Maezawa Y, Nakajima H, Saito Y, Iwamoto I(2003) IgE-dependent enhancement of Th2 cell-mediated allergic inflammation in the airways. WAO 2003.
9. Takatori H, Nakajima H, Hirose K, Kagami S, Saito Y, Iwamoto I (2003) Role of Stat5a in T helper 2 cell differentiation. WAO 2003.
10. Sugiyama K, Cheng G, Aoki Y, Fukuda T. Anti-IL-5 receptor antibody, but not anti-IL-5 antibody, inhibits airway hyperresponsiveness in murine model of chronic asthma. American Thoracic Society 2003 International Conference, Seattle, 2003.
11. 田村弦. シンポジウム「アレルギー疾患の免疫療法の展望」CpG ODNを用いたワ クチン療法と展望. 第53回日本アレルギー学会総会. 12. 釣木澤尚実、斉藤博士、冨田君子、東 愛、橋本直方、森田園子、大友 守、森 晶夫、前田裕二、谷口正実、秋山一男. Churg-Strauss 症候群(CSS)に対するgグロブ リン大量療法 (IVIG)ーその有効性と限界に関する検討. アレルギー 52;382, 2003. 13. 釣木澤尚実、斉藤博士、冨田君子、東 愛、粒来崇博、森田園子、谷口正実、森 晶夫、大友 守、前田裕二、秋山一男. Churg-Strauss syndrome(CSS)の病態:治療経
過中におけるCD69+CD4+およびCD25+CD4+T細胞の検討. アレルギー 52;923, 2003.
なし
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