同種 皮膚 移植 にお け る皮膚上 皮細胞 に対 す る免疫 能 の変動
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(2) 1160. 田 Table. 1. LMC of immune. * ACI. skin. immune of. 信 一 郎. obtained. from. allogeneic. skin. grafted. neck. of. rats. and. grafted. on. spleen. cells. were. the. harvested. at. was. were. 100:1. 10-13th. as. percent. 51Cr. で あ っ た.. 脱 血 した ラ ッ ト よ り脾 を 採 取 し,リ. 6.. Buffered. ン酸 緩 衡 生. 細胞. release. 識 皮 膚 細 胞 浮 遊 液(105個/ml)0. 個/ml)0.1mlをU‑bottomed. 工 業)に て 滬 過 し, debrisを. clon,. 浮 遊 液 中 の 赤 血 球 は0.75%NH4Clト. に,. リス 緩衡. て3回 洗 浄 し,最 終. 的 に 培 養 液 に 浮 遊 し た. 5.皮. 既 述 の 如 く4),ラ 単 離 し た.ラ %ト. 識. 時 間 消 化 した.皮. に 浮 遊 し, 37℃ に て 約3. 膚 片 よ りepidermisを. 遊 離 し,. そ の 基 底 膜 層 よ り0.025%DNase‑PBS中 膚 上 皮 細 胞 を遊 出 さ せ た.単. に皮. 離 皮 膚 細 胞 を150μ. メ ッ シ ュ ・フ ィル タ ー に て 滬 過 し, BPSに. て3. 回 洗 浄 し た.. 研 化 学)とplastic. tube(Falcon200,. Falcon. Plastics, U. S.A.)中 に 混 合 し, 37℃ ・5. %CO2の. 条 件 に て2時 間 標 識 し た.標 識 後RPMI. 1640培 養 液 に て3回 た.皮. 5%CO2の. 洗 浄 し 残 存51Crを. 除去 し. 膚 細 胞 の51Cr標 識 量 は30例 以 上 の 実 験 よ. り10,844±4,042cpm/104個(平. 均 値 ±標 準偏 差). microplate(Nun Denmark)に. 条 件 に て12時. 7.. て 混 合 し,. 間 培 養 し た.培. レ ー ト を1400rpm・5分. 間 遠 沈 し,上. tube(744,栄. 研 機 材)に. 清0.1ml. 採 取 して 遊 出. 定 法. 51Cr標. 識 皮 膚 細 胞106個. と同種 皮 膚 移 植 後. 時 期 に 得 ら れ た 免 疫 血 清0.25mlをplastic (Falcon. 200)中. に 混 合 し, 22℃. て 皮 膚 細 胞 を 感 作 し た. て3回. 洗 浄 し105個/mlに. F344脾. し,. RPMI. ,各 tube. ・30分 間 静 置 し 1640培. 調 整 し, 0.1mlを. 養 液 に 正常. 細 胞 浮 遊 液(0.25〜2×107個/ml)0.1ml. 37℃. し た.培. microplate(Nunclon)に. ・5%CO2の. ,上. 間培養. を測 定 し た .. 述 の 方 法 とは 逆 に 攻 撃 細 胞 で あ る正. 常 脾 細 胞(3×107個)を 混 合 し, 22℃. 処 理 後,. て混 合. 条 件 に て4〜10時. 養 後 遊 出51Cr量. 一 方. mlと. 37℃. 養後 プ. ガ ン マ ー ・ カ ウ ン タ ー に て 計 測 し た.. LDA測. とU‑bottomed. 次 に,皮 膚 細 胞(107個/0.3ml)を300μCiの Na251 CrO4(科. Nunc,. し た51Crを. ッ ト尾 よ り皮 膚 上 皮 細 胞 を. ッ ト尾 よ り採 取 した 皮 膚 片 を0.5. リプ シ ン‑PBS中. A/S. をplastic. 膚 上 皮 細 胞 の 分 離 及 び51Cr標. .1mlと. 同 種 移 植 後 各 時 期 に 得 ら れ た 脾 細 胞 浮 遊 液(107. 浮遊 液 を150μ メ ッ シ ュ ・フ ィ ル ター(池 本 理 化 学 除 去 し た.更. .. LMC法 51Cr標. Saline, PBS). 中 に て 脾 を粉 砕 して 脾 細 胞 を単 離 した.脾. 液 処 理 して 破 壊 し, PBSに. day. .. expressed. ℃ ・30分 温 湯 槽 に て 非 働 化 処 理 し て 用 い た.又,. 理 食 塩 液(Phosphate. F344. rats.*. grafts.. ratio. Data. cells. was. skin. ** E/T ***. spleen. 中. RPMI. 試 験 管 内 で 免 疫 血 清0.25 ・30分 間 静 置 し 前 感 作 し た .. 1640に. 攻 撃 細 胞 に 用 い た.. て 洗 浄 し,殺. 細胞 試験 の.
(3) 同種 皮 膚移 植 にお け る皮 膚上 皮 細 胞 に対 す る免疫 能 の変 動 Table. 2. LDA activity allogeneic. * ACI. skin. immune. was sera. of immune. skin grafted. grafted were. on. serum. obtained. 1161. from. rats. *. the. hravested. neck at. of. 40th. F344 day. rats of. and. skin. grafts. ** ***. E/T. ratio. Data. was. were. 100:1.. expressed. Table. as. 3. Kinetic. percent. studies. on allogeneic. * ACI. skin. several ** ***. E/T Data. ratio were. was. grafted. on. times. after. skin. was. the. neck. 51Cr. of LDA activity skin grafts.. of. F344. grafts.. 100:1.. expressed. as. percent. release.. 51Cr. release.. *. rats. and. sera. were. harvested.
(4) 1162. 田 Table. 4. Pretreatment serum. * ACI. skin. were. ** E/T ***. LMC法. ratio. Data. 及 びLDA測. on times. treated was. were. from. grafted. several. cells. 信 一. of effector. obtained. was. harvested. 中. with. 100:1. 郎. normal. spleen. allogeneic. the after the. cells. with immune. skin grafted. neck. of. skin sera. rats. *. F344. rats. grafts. and. F344. used. as. as. percent. 51Cr. release. 51Cr release=. 尚, spontaneous. release release ×100. 攻 撃 細 胞 の 代 わ りに. 培 養 液 を 加 え た 場 合 の 標 的 細 胞 よ り の51Cr遊 量 と し た.. spontaneous. に 対 し 培 養1・6及. releaseはtotal び12時. び30.3±5.1%の. 又,免. 疫 血 清 に よ る 前 感 作 のspontaneous の 影 響 は な か っ た.一. laseは104個. 留 水 と 混 合 し3時 決 定 し た. 約80%の. rele. maximum. re. 値 を 示 し た.又,得. 9)の 方 法 で は5%以 方 法 で は5%以. Marbrook11)の 判 定 さ れ る.. に て蒸 を測定 して. releaseはtotal. labelの. られ た 殺 細 胞 能 の. 報 告 し て い る の と 同 様 に3. 種 の 方 法 で 検 討 す る と,. son10)の. 方,. 間 後 の 遊 出51Cr量. maximum. 測 定 はBurton等8)が. Lee. 値 を 示 し た.. の 標 的 細 胞 をmicroplate中. 10時 上. 間 培 養 の 場 合,. ・Lindahl. 上 及 びSkinner. 方 法 で は10%以. and. spleen. effector. cells.. Wil and. 上 が 陽性 反応 と. 果. 膚 細 胞 に 対 す るLMC活. Steinmuller等 をLMCに. 性:. は6,12)マウス に お い て 皮 膚 細 胞. お け る 標 的 細 胞 に 用 い,細. 胞 性免 疫. 能 の 判 定 に 有 用 な事 実 を 報 告 し て い る.そ ま ず ラ ッ ト皮 膚 細 胞 に 対 す るLMC活 した.ACIよ 行 し,細. 間 後 に そ れ ぞ れ9.4. 18.0±3.9及. aseへ. 出. label. ±1.8,. normal. 結 1.皮. releaseは. were. .. 定 法 に お け る殺 細 胞能. =experimental relaese‑spontaneous / maximum release‑spontaneous. sera. .. expressed. は 以 下 の 如 く算 出 し た. Percent. and. りF344ラ. こ で,. 性 を検 索. ッ トに 同種 皮 膚 移 植 を 施. 胞 性 免 疫 能 の上 昇 し て い る術 後10〜13. 日 目 の 脾 細 胞 を分 離 し攻 撃 細 胞 に 用 い た .表1 の 如 く, ACIに. 感 作 さ れ たF344脾. 皮 膚 細 胞 に 対 し約35%の 方,正. 常F344脾. 細 胞 はACI. 殺 細 胞 能 を示 し た.一. 細 胞 を用 い た 場 合, ACI皮. 膚細. 胞 に 対 し18.1%の. 値 で あ っ た.又,. 胞 に 対 して は,免. 疫 脾 細 胞 と正 常 細 胞 の 間 に 差. は なか っ た.従. っ て,ラ. F344皮 膚 細. ッ トに お い て もマ ウ ス. の 場 合 と同 様 に 皮 膚 細 胞 はin. vitroに お け る 細. 胞 性 免 疫 能 を検 索 す る の に 有 用 と考 え ら れ た . 又,皮. 膚 細 胞 は 正 常 脾 細 胞 に よ っ て もin vit. roで 破 壊 され,約20%の が,こ. 殺 細 胞 能 を示 し て い る. れ は 既 に 報 告 し て い る如 く13),皮 膚 細 胞 に 対 す るspontaneous cell‑mediated cytotoxi.
(5) 同種 皮 膚移 植 に おけ る皮 膚上 皮 細 胞 に対 す る免疫 能 の変 動 against. ACI skin. 図1. against. LDA活. 性 測 定 に お け る 培 養 至 適 時 間:. に 皮 膚 移 植 施 行 し,術 を 用 い,. ACI及. びF344皮. 後10日. 及 び13日. ACIよ. F344. 1163 skin. りF344. 目に採 取 した血 清. 膚 細 胞 に 対 す るLDAを. 測定 し. た. E/T. ratio=100:1. 結 果 はmean±SD. against. of percent. 51Cr. releaseに. て 表 示 した. ACI skin. 図2. against. 免 疫 血 清 希 釈 のLDA活 免 疫 血 清(術 後13日 F344皮 E/T. 性 へ の 影 響:図1に. 目)を 培 養 液 に て 希 釈 し,. 膚 細 胞 に 対 す るLDA活. F344. て用 い た ACI及. び. 性 を 測 定 し た.. ratio=100:1,. 培 養 時 間 は10時 間 結 果 はmean±SD. of percent. 51Cr. releaseに. て 表 示 した.. skin.
(6) 1164. 田. 中. 信 一 郎. cityに よ る もの と考 え られ る . 2.皮. 膚 細 胞 に 対 す るLDA活. LDAに. 考. 性:. 対 す る 皮 膚 細 胞 の 感 受 性 を検 索 す る. 目 的 で, ACIよ. りF344ラ. ッ トへ の 同 種 皮 膚 移 植. 同 種移 植 片 に対 す る拒 絶反 応 の機 構 は 未 だ十 分 に解 明 され て い な い.特. 後40日 を経 過 した宿 主 よ り血 清 を分離 し,血 清 中. Boyse等. の 皮 膚 細 胞 に 対 す るLDA活. 又,近. 2の 如 く,免 donor由. 疫 血 清 中 に は正 常 血 清 に比較 し. 来ACI皮. 膚 細 胞 に 対 して 有 意 に 高 い. (p<0.001)LDAの F344皮. 性 を 測 定 し た .表. 存 在 が 認 め ら れ た.一. 膚 細 胞 に 対 し て は,免. 方,. 疫 血 清 と正 常 血 清. の間 に差 は 認め られ なか っ た. 次 に, LDA活 す る為,同. 種 皮 膚 移 植 後10日 及 び13日 目 の 宿 主 養 時 間 ・Effector to Target. ce. ll ratio(E/T. ratio)・ 血 清 の 希 釈 の 影 響 を検 討. し た.図1の. 如 く,培 養 時 間 を延 長 す る に 従 っ. て 活 性 は 上 昇 し た が,標 eous. releaseを. わ れ た.又,. E/T. 間 が 適 当 と思. ratioを25:1よ. て い く と, 100:1か 衡 に 達 し た.次. 的 細 胞 よ りのspontan. 考 え る と,約10時. ら200:1の. に,免. り増 加 させ 間 で 活 性 は平. 疫 血 清 を培 養 液 に よ り希. 釈 して 活 性 の 変 化 を測 定 す る と,図2の 免 疫 血 清 を希 釈 す る に 従 っ て, LDA活 下 して い た.正. Steinmuller等. 特 異 抗 原 に 対 す るcytotoxic clonesを. 樹 立 し,皮. T. が 皮膚. lymphocyte. 膚特 異抗 原が 拒 絶反 応 に関. 与 し て い る と報 告 して い る. 18,19)著者 ら も ラ ッ トを用 い リン パ 球‑皮 膚 細 胞 混 合 培 養 法 に よ り. し た. 20)従っ て,皮. 膚移 植 の場 合 に は組織 適合. 性 抗 原 に 対 す る反 応 と皮 膚 に 特 異 的 な 反 応 の 両 面 よ り検 索 す る必 要 が あ る.今. 回著 者 は この点. を考 慮 し ラ ッ ト同 種 皮 膚 移 植 に お い て 皮 膚 細 胞 を標 的 細 胞 に 用 い, LMC及 樹 立 を試 み,マ LMC法. 測定法の 6)ラ ッ ト. に お い て も 有 用 で あ り組 織 適 合 性 抗 原. に 対 す るLDAの た,更. びLDAの. ウ ス で の 報 告 の 如 く,. 測 定 も 可 能 で あ る結 果 を示 し. に, LDAと. る と, LDAは. 拒 絶 反 応 と の 関 連 を検 討 す. 移 植 片 拒 絶 時 よ り,や や 遅 れ て. 性 は低. して も持 続 して い た.こ. の 活 性 は 移 植 後40日 以 上 を経 過 れ は,移. 植 後LMC及. び補体 依 存性 抗体 が 比較 的 早期 に減 弱 してゆ く 事 実(投 稿 準 備 中)と 合 わ せ て 考 え る と,二 次 移. り,F344ラ. 中 のLDAの. 性 の 変 動:. ッ トに 同 種 移 植 し,宿 主 血 清. 出 現 ・推 移 並 び に 拒 絶 反 応 との 関. 連 に つ い て 検 索 し た.表3の 11日 目,つ. 如 く,移 植 後10〜. ま り拒 絶 反 応 よ りや や 遅 れ て 宿 主 血. 清 中 にLDAの. 出 現 が 認 め られ た.こ のLDAは,. 以 後 活 性 を 維 持 し,表1に. 示 した 様 に,移. 植後. 植 を施 行 す る場 合,. れ る.一. 方, LDAと. て も,現. 在,同. 存 在が 二 次 移植 片. 皮膚特 異抗 原の 関連 につ い. 種 皮 膚 細 胞 に よ り過 免 疫 して 得. られ たhyperimmune が,こ. serumの. のhyperimmune. 性 状 を検 討 中 だ. serum中. に 自己皮 膚細. 胞 に 対 す る 皮 膚 特 異 的 な 抗 体 の 存 在 が 碓 認 さ れ, 更 に, hyperimmune. 4.免. のpassive. 疫 血 清 に よ る正 常 脾 細 胞 前 処 置 に よる. LDAの. の 拒 絶 に 重 要 な 役 割 を演 じ て い る こ とが 示 唆 さ. 40日 を経 過 して も 活 性 は 減 弱 しな か っ た.. LDA活. and. 出 現 す る が,そ. 常 血 清 を用 い た 場 合 に は 変 化 は. 種 皮 膚 移 植 に お け るLDA活. ACIよ. が 皮 膚 特 異 抗 原 の 存 在 を示 唆 し, 14〜17) 年 で はTyler. 如 く,. な か っ た. 3.同. に 皮 膚 移 植 に お い て は,. 自 己 皮 膚 細 胞 に 反 応 す る リ ンパ 球 の 存 在 を報 告. 性 測 定 に お け る 諸 条 件 を決 定. 血 清 を用 い,培. 察. serumに. enhancementの. よ り同 種 移 植 片 成 立 が碓 認 されて. い る.. 性 測 定:. 正 常 血 清 又は 同種 皮 膚移植 後 各時期 に採取 し. 一方. ,近 年Kiessling. and. た 免 疫 血 清 に よ り前 処 置 し た 正 常 脾 細 胞 を 用 い,. killer systemは. 非 感 作 皮 膚 細 胞,つ. み で な く,生 理 学 的 に 増 殖.分. ま り免 疫 血 清 に よ り処 置 し. Hallerがnatural. 腫 瘍 細 胞 に 対 して 作 用 す るの 化 し て い る細 胞. て い な い 皮 膚 細 胞 に 対 す る殺 細 胞 能 を測 定 す る. に 対 して もhomeostasisを. と,表4の. 示 唆 し て い る.本 報 告 に お い て 著 者 は,皮. LDAが. 如 く,同 出 現 し,そ. 種 移 植 後10〜11日 の 活 性 を 持 続 し た.こ. 目よ り れ は,. 保 つ為 に 作用 す る と 膚細. 胞 が 正 常 脾 細 胞 に よ り破 壊 さ れ る 結 果 を示 し た.. 上 述 の 正 常 脾 細 胞 の 免 疫 血 清 に よ り感 作 し た 皮. こ れ は 既 に 報 告 し て い る如 く, 21)natural. 膚 細 胞 に 対 す る 反 応 と同 様 の 変 動 を示 した.. er systemに. 属 す る 反 応 で あ り,皮. kill. 膚細 胞 に対.
(7) 同種 皮 膚移 植 にお け る皮 膚上 皮 細胞 に対 す る免疫 能 の変 動 す るspontaneous. cell‑mediated. cytotoxicity. に よ る もの で あ る. spontaneous. cell‑mediat. ed cytotoxicityは. 生 後3〜4週. 1165. 結. 令 に 出 現 し,. 語. ラ ッ ト同 種 皮 膚 移 植 に お け る 宿 主 免 疫 血 清 中. 系 特 異 性 を 持 た な い 反 応 で あ り,生 体 内 で は 血. の 特 異 的LDAの. 清 中 の 因 子 に よ り そ の 活 性 を 調 節 さ れ て い る.. 51Crに よ り標 識 してmicrocytotoxicity法. 皮 膚 移 植 とspontaneous. 的 細 胞 に 用 い て 検 索 し た.. cell‑mediated. icityと の 関 与 を検 討 す る と,表1に. cytotox. お い て宿主. F344皮 膚 細 胞 に対 す る 反 応 は 正 常F344脾. 1.皮. 細胞と. 変 動 をdonor由. 来皮 膚細 胞 を. 膚細 胞 は 免疫 脾細 胞 に対 す る標 的細 胞 と. してLMC法. に お い て 使 用 し得 る.. 免 疫 脾 細 胞 の 間 に 差 異 は な か っ た.又,表2に. 2.皮. 示 す 様 に,宿. して 使 用 し得 る.そ. して,そ. 時 間 は10時 間, E/T. ratioは100:1で. 主F344皮. 膚細 胞お正 常 血 清 又は 免. 免 血 清 で 前 処 置 し て も正 常F344脾 spontaneous. cell‑mediated. 細胞による. cytotoxicityは. 影. 3.皮. 響 さ れ なか っ た. 以 上 の 如 く,ラ. の標. 膚 細 胞 は 宿 主 血 清 中LDAの. 標 的細 胞 と. の至 適 条件 は培 養. 膚 細 胞 に 対 す るLDAは. あ っ た.. 同種 移植 皮 膚片. の 拒 絶 時 よ りや や 遅 れ て 宿 主 血 清 中 に 出 現 し, ッ ト皮 膚 細 胞 は 試 験 管 内 で 同. その 活性 は移 植 後40日 を経 過 して も認 め られ た.. 種 及 び 同 系 リン パ 球 を刺 激 しblastformationを. 4.. 惹 起 し,又,. 的 皮 膚 細 胞 又 は 攻 撃 正 常 脾 細 胞 を前 感 作 し て も. natural. killer cellに 対 し て も感. 受 性 を持 つ な ど細 胞 性 免 疫 反 応 で 役 割 を持 っ て い る.更. に,今. 回 示 し た 如 く, LDAに. 測 定 す る 場 合,免. 疫 血 清 に よ り標. 同 様 の 結 果 が 得 られ た.. 対 す液性. 免疫 反 応 の 検 索 が 可 能 で あ り,皮 膚 細 胞 を用 い たLDA測. LDAを. 本研 究 を進 め る に あ た り御 指 導 を賜 りま した岡 山. 定 法 は 二 次 移 植 に お け る移 植 時 期 及. び 移 植 後 の 免 疫 動 態,又hyperimmune. 大学 第1外 科 折 田薫 三 先 生 に心 か ら感謝 致 します. 又,技 術 的 助 力 を賜 りま した岡 山 大 学 第1外 科 研 究. serum. 室 太 田卓 先 生並 び に雨 宮 慎 二 先 生 に 感 謝致 します.. 中 の 皮 膚 特 異 抗 体 の 検 索 な ど に 有 用 で あ り,同. 本論 文 の 要 旨は 第15回 日本 移 植 学 会 に て 発表 した.. 種 皮 膚移植 にお け る免 疫 反応 の解 明 に貢献 す る. また,本 研 究 の一 部 は文 部 省 特 定 研 究 岩崎 班 「腎移. と考 え ら れ る.. 植 の 基礎 的 研 究 」助 成金 に よ っ た.. 文 1. Carpenter,. C. B. and Morris,. Transp. Proc. 10, 509-513,. P. J.:. The detection and measurement. Proc. 10, 661-670,. Posttransplant. immunologic monitoring:. S. and Sakai, A.:. Summation.. Transp.. L.J.:. The production. 5. Lloyd, K.O. and Darnule,. of lymphocyte-dependent. Transplantation 24, 159-161.. antibody. 1977.. Stimulation of allogeneic lymphocytes by skin epidermal cells in the rat.. Transplantation 27, 194-199,. 1979.. T. V.:. of tissue-specific differentiation 6. Steinmuller,. snesitization.. 1978.. R.A., Lindsay, V.J. and Statt,. in response to non Ag-B tissue antigens in inbred rats. 4. Tanaka,. of pretreatment. 1978.. 2. Dossetor, J. B. and Myburgh, J. A.:. 3. Allardyle,. 献. D. and Wunderlich,. Properties. of rabbit antirat epidermal. antigens.. J. Immunol. 112, 311-319,. J. R.:. The use of freshly explanted. the in vitro induction and destruction. of cell-mediated cytotoxicity.. cell sera.. Demonstration. 1974. mouse epidermal. cells for. Cell. Immunol. 24, 146-163,. 1976. 7. Billingham, R. E.:. Free skin grafting. & Silvers, Co., pp. 1-26, 8.. in mammals.. In Transplantation. of Tissue and Cells. Willys. 1961.. Burton, R.C., Fortin, J. L. and Russell, P. S.: T cell responses to alloantigens. I. Studies of in vivo.
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(9) 同種 皮 膚移 植 に おけ る皮膚 上 皮細 胞 に対 す る免疫 能 の変 動. Immune. Response. against. of Allogeneic Detection. Skin. Epidermal. Skin Grafts. in Rats:. of Lymphocyte-Dependent Shinichiro. First Department. 1167. Cells. Antibodies. TANAKA. of Surgery, Okayama University. Medical School, Okayama (Director;. Prof.. 700, Japan. K. Orita). The mechanism of rejection of allogeneic organ grafts is not fully understood. The rejection of grafted skin is complicated as skin epidermal cells express skin specific antigens. Thus skin epidermal cells are suitable target cells for analyzing skin graft rejection in in vitro studies. In this study, 51Cr labeled skin epidermal cells were prepared from rat tail skin by trypsin digestion. The susceptibility of skin epidermal cells to immune spleen cells in a lymphocyte mediated cytotoxicity assay and LDA in an antibody dependent cytotoxi city assay was examined in allogeneic skin grafts in rats. Skin epidermal cells were specifically killed by immune killer lymphocytes or LDA in combination with normal rat spleen cells. The optimal condition for assays were 10 to 12 hours of incubation and a 100:1 to 200:1 effector to target cell ratio. When the kinetics of LDA activity after allogeneic skin graft was examined, LDA appeared in the recipient serum just after the rejection and maintained activity for more than 40days after the skin graft. To analyze the mechanism of graft rejection, it is resonable to use the same target cells as the graft itself in both cellular and humoral immunoassays. In this sense, skin epidermal cells are useful for the study of skin rejection..
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