学位論文題名

博 士 （ 歯 学 ） 中 村 光 一

     学位論文題名

Tannin ーfluoride preparation attenuated prostaglandin     E2 production in dental pulp cells      （ 夕 ン ニ ン ・ フ ッ 化 物 合 材 の 歯 髄 細 胞 に 対 す る      プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン E2 産 生 抑 制 作 用 に つ い て ）

学 位論文内容の要旨

【目的】

歯 髄は う蝕、 咬耗 、歯 冠修 復な ど様 々な 要因 によ り刺 激を 受け、修復象牙質の形成 や、 変性 を生ず る。 窩洞 形成 によ り象 牙細 管が 露出 し、 その 刺激により象牙芽細胞の 変位 や破 壊が引 き起 こさ れ、 急性 炎症 が生 じる こと があ る。 また、象牙質に充填され た修 復材料の成分の溶出による化学的刺激により歯髄炎を生ずることが示されている。

グ ラス アイ オノ マー セメ ント

は歯 髄へ の刺 激性 が比 較的 少を いと され てい る が、 歯髄 細胞に 直接 接触 する と細 胞毒 性を 示し 、歯 髄炎 が誘 発されるという報告もあ る。

  GIC

に タ ン ニ ン ・ フ ッ 化 物 合 材

材 ） が 配 合 さ れ た 製 品 が あ る 。

材 の 添 加 に より 、フ ッ素の 放出 量が 増加 し、 象牙 細管 の閉 鎖の 促進 が引 き起こされ、歯髄保護に 作用すると考えられている。

さ らに タンニ ン酸 は一 酸化 窒素 の産 生抑 制作 用や 、そ れに 伴う抗酸化作用さらには 収斂作用により抗炎症作用を示すことが知られている。

一 方で 、 歯 髄 細 胞 の 炎 症 反 応 に 対 する

材 なら びに タン ニン 酸の 作用 は明 らか に な っ てい な い 。 本 研 究 は

浸 出 液に よ る歯 髄細 胞の プロ スタグ ラン ジン

産 生 に 対 す る

材 の 作 用 に っ い て 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て 行 っ た 。

【材料と方法】

本研究では、ラット歯髄由来RPC ―C2A (RPC) 細胞を用いた。HY 材含有GIC （HY （十））、

HY

材 非含有GIC (HY( 一冫）あるいはタンニン酸を主成分とするY 材含有GIC (Y) のディス ク を

培 地 に 浸 漬 し 、 セ メ ン ト 浸 出 液 を 作 製 し た 。 そ れ ら を用 い てRPC 細 胞を 培 養 し て細 胞 内

量 、 培 養 上 清 中 のPGE2 量 お よ ぴ 細 胞 に 発 現 し た

な らび にタ ン パク質の分析を行った。

―494 ー

【結果と考察】

1

，セメント浸出液による細胞内ATP 量の変化

  GIC

浸出 液 に よる 細 胞障 害 の 有無 に つい て 検 討す る ため に 細胞 内ATP 量の測 定を行 っ た。RPC 細胞 に対して セメント 浸出液を 作用させる と、培養

時間ではHY （十）群な ら ぴにHY （− ）群で対 照群と比 較して有意極細胞増殖促進が認められたが、48 時間では 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。

群 で は

時 間、

時 間 と もに 対 照 群と の

量 の 有 意 差 は認めら れなかっ た。以上 のことから セメント 浸出液の 細胞毒性 はほとん どたい と推測された。

2.

セメント浸出液によるCOX ー2mRNA 発現誘導

セ メ ン ト 浸 出 液 を

細 胞 に 作 用 さ せ る こ と に よ り

−

の 発 現 が 誘 導さ れ、HY く一）において刺激後

時間で対照群と比較して約1 ．6 倍に上昇した。HY （十）では3 時 間後に対照群の約1 ．3 倍に上昇したが、全ての時間でHY くI ）と比較して発現の低下が 認 め ら れ た 。

で も

時 間 後 に

―

発 現 は 対照 群 の約

．

倍 に 上昇 し た が、

い ずれの時 間におい てもその 発現はHY(‑) よ りも低い値 を示した。ヒト歯髄細胞にポン デ ィ ン グ材 を 作用 さ せ たり 、 レ ジンモノ マーをマ ウスマク ロファー ジ様RAW 264.7 細 胞 に 作 用 さ せ る と

−

の 発 現 が 増 強さ れ ると の 報 告が あ る 。本 研 究に よ り

浸 出 液 を 作 用さ せ た 場合 も 同様 に

−2mRNA の発 現 が誘 導 さ れる こ とが 明 ら か に な っ た。 一 方、 セ メ ント 浸 出 液（

（ う ） の作 用 によ り 誘 導される

ー2mRNA の 発現は、HY 材あるいは

材によって低下した。さらに、HY(‑) のセメント浸出液に

（十）

の セ メント浸 出液を混 合し、HY （ 十）の割合 を増加さ せると濃 度依存的 にCOX ←2mRNA 発 現の低下 が認めら れた。ま た、タン ニン酸をHY(‑) の セメント浸出液に添加すること に よ り 、 濃 度 依 存 的 に

―

発 現 が 低 下 し 、

材 に よ る

−

発 現 の 低下にはタンニン酸が関与していることが示唆された。

3.

セメント浸出液によるPGE2 産生量の変化

  GIC

浸出 液 を 歯髄 細 胞に 作 用 させ て

産生 量 に 与え る 影響 を検討 した。

群

で 対 照 群と 比 較し て 培 養液 中 の

量 の 増 加が 認 め られ た 。レ ジンモノ マーであ る

の 刺激 に より

産 生 量が 増 加す る と いう 報 告が あ る が、

浸出 液 の 作用

に よ っ ても 同 様に

の 産 生量 が 増加 す る こと が 明 らか と なっ た。刺激 後12 時間に

お いて培養 液中のPGE2 量 を比較するとHY( ―）群で対照群の約3 倍となり、HY （十）群で

群の約50 ％程度、Y 群では約

％程度に減少した。HY （十）群ではHY （−）群より産

生 量 は 減少 し 、刺 激 後

時 間 、24 時間 で は 有意 差 が 認め ら れた 。以上の 結果から 、

浸 出 液 に よ り 増 加 し た

産 生 量 が

材 およ び

材 の作 用 に より 減 少す る こ と

ー495 −

が明らかとなった。

4.

セ メ ン ト 浸 出 液 に よ る

−

タ ン パ ク 質 発 現 と 細 胞 内 情 報 伝 達 系 へ の 作 用

細 胞 に

浸 出 液 を 作用 させ 、COX ―2 タ ンパ ク質 の発 現や その 上流 の細 胞内 情 報 伝達 系に与 える 影響 につ いて 検討 した 。

浸出 液に より

ー2 タ ンパ ク質 の発現 は刺激後120 分でHY( ―）、HY （十）ともに上昇した。240 分においてHY （ー）では依然発現の 上昇が認められたが、HY （十）では発現が著しく低下していた。GIC 浸出液の刺激により

一

の み なら ず 、 タ ン パ ク 質 の 発 現 の 上 昇 が 認 め ら れ た 。 ま た 、

材 が セ メ ント 浸出液 によ るCOX −

発現 をタ ンパ ク質 レベ ルでも抑制することが示唆された。

COX

−

発 現 に 関 わ る 細 胞 内 情 報 伝 達 系 は 複 雑で 多 数 存 在 し 、

や

、

の 関 与が 示きれ てい る。

だBa のりン酸化はHY(‑) では刺激後120 分でHY （十）の1 ．8 倍に 上 昇し ていた 。刺 激後

分でHY(‑) では刺激前の約3 倍であったが、HY （十）では刺激 前 と同 程度ま で低 下し た。本研究では歯髄細胞に対するセメント浸出液の作用により

に

の り ン 酸 化 が 認 め ら れた が、

材 を添加 する こと によ りそ の発 現が 低下 した 。 タ ンニ ン酸は

だ

のの りン 酸化 を阻 害す るこ とに より

ー に

の 活性 化を 抑制 すると い う 報 告 が あ る こ と か ら 、 本 研 究に お け る

材 の 添 加 に よる

にBa のり ン酸 化の 減 少 に は 、

材 中 の タ ン ニ ン酸 が関 与し ている こと が示 唆さ れた 。ま た、

は

においてわずかたりン酸化が認められたが、IKBa の場合と同様に、HY （十）ではりン酸 化は減少した。さらに、HY （一）ではp38 のりン酸化の経時的な増加が認められ、240 分 では刺激前の約5.1 倍に達した。一方、HY （十）では今回調べた全ての時間においてりン 酸 化の 誘導は ほと んど 見ら れな かっ た。 以上 の結 果か らGIC 浸出 液の 刺激 には 歯髄細 胞 の

な ら び に

キ ナ ー ゼ を 介 す る 伝 達 経 路 も 存 在 し 、

材 が こ れら を 抑 制することが明らかになった。

本研 究にお いて

材 非添 加の

浸出液 を歯 髄細 胞に 作用 させ るこ とに より 、

の 産 生 量 な ら び に そ の 産 生に 関与 する

−

タン パク 質お よび

の発 現の 上昇 、 さ らに はその 上流 に存 在す る細 胞内 情報 伝達 系の 活性化が認められた。また、

材は こ れら を抑制 する こと を確 認し た。 ー方 で、

材 の作用点の詳細に関してはまだ不明 ぬ 点も 多く、 さら に詳 細に 検討 する 必要 があ る。

材は充填材のみでぬく、合着材お よ び覆 髄材と 幅広 く用 いら れて いる が、 その 歯髄 細胞に対する作用や機序はほとんど 明 ら か と な っ て い な い 。 本研 究で は

材の歯 髄細 胞に 対す る抗 炎症 作用 にっ いて そ の 一 端 を 明 ら か に し た 。 今後 、歯 髄細 胞に対 する

材 の作 用の 研究 を進 めて いく こ と は 、 さ ら な る 臨 床 応 用 へ の 可 能 性 を 開 拓 す る も の と 考 え ら れ る 。

【結論】

  GIC

浸 出 液 の 刺 激 に よ る 歯 髄 細 胞 の

産 生 は

材 の添 加に よっ て抑 制さ れる こ

とが明らかになった。   ―496 −

学位論文 審査の要旨

     学位論文題名

Tannin‑fluoride preparation attenuated prostaglandin     E2 production in dental pulp cells

（夕ンニン・フツ化物合材の歯髄細胞に対する プロスタグランジンE2 産生抑制作用について）

歯 髄 は 齲 蝕 、 咬 耗 、 歯冠 修 復 な ど様 々 な 要 因に よ り 刺 激を 受 け 、 修復 象 牙 質 の形 成 や 、 変性 を 生 ず る。

窩 洞 形 成 によ り 象 牙 細管 が 露 出 し、 そ の 刺 激に よ り 象 牙芽 細 胞 の 変位 や破 壊が引 き起こさ れ、急 性炎症 が 生 じ る こ と が あ る 。 グ ラ ス ア イ オ ノ マ ー セ メ ン ト(GIC)は 歯 髄へ の 刺 激 性が 比 較 的 少な ぃ と さ れて い る が 、 歯 髄 細胞 に 直 接 接触 す る と 細胞 毒 性 を 示し 、 歯 髄 炎が 誘 発 さ れる と い う 報告 も あ る 。GICに はタンニ ン ・ フ ッ 化 物 合 材(HY材 ） が 配 合 さ れ た 製 品 が あ る が、HY材 の添 加 に よ り、 フ ッ 素 の放 出 量 が 増加 し 、 象 牙 細 管 の閉 鎖 の 促 進が 引 き 起 こさ れ 、 歯 髄保 護 に 作 用す る と 考 えら れ て い る。 さ ら にY材 の主 成分で あ る タ ン ニ ン酸 は 、 一 酸化 窒 素 の 産生 抑 制 作 用や 、 そ れ に伴 う 抗 酸 化作 用さ らには 収斂作用 により 抗炎症 作 用 を 示 す こ と が 知 ら れて い る 。 一方 で 、 歯 髄細 胞 の 炎 症反 応 に 対 するHY材 なら び に タ ンニ ン 酸 の 作用 は 明 ら か に な っ て い な い。 本 研 究 は、GIC浸 出 液 によ る 歯 髄 細胞 の プ ロ スタ グ ラ ン ジンEz (PGEz)産生 に 対 するHY材の作用にっいて明らかにすることを目的とした。

  本研究では、ラット歯髄由来RPC−C2A (RPC)細胞を用いた。HY材含有GIC (HY（十））、HY材非含有GIC (HY（―））

あ る い はY材 含有GIC (Y)の デ ィ スク をDMEM培 地に 浸漬し 、セメン 卜浸出 液を作 製した 。それ らを用 いてRPC 細 胞 を 培 養し て 細 胞 内ATP量、 培養上 清中の プロス タグラン ジンEz (PGEz)量およ び細胞 に発現 したmRNAな ら ぴにタンパク質の分析を行った。

  GIC浸 出液 に よ る 細胞 障 害 の 有無 に つ い て検 討 す る ため に 細 胞 内ATP量 の 測 定を 行 っ た 。RPC細 胞に対 し て セメン ト浸出 液を作 用させ ると、培養24時間ではHY（十）群ならびにHY（−）群で対照群と比較して有意な細 胞 増 殖 促 進が 認 め ら れた が 、48時 間 で は 有意 差 は 認 めら れ な か った 。Y群 で は24時 間 、48時 間 ともに 対照 群 と のATP量の 有 意 差 は認 め ら れ なか っ た 。 セメ ン ト 浸 出液 をRPC細 胞に 作 用 さ せる こ と に よりCOX12凪NA の 発現が 誘導さ れ、HY（ −）群 において刺激後3時間で刺激前と比較して約1．6倍に上昇した。HY（十）群では3 時 間後に 約1．3倍 に上昇 したが 、全て の時間 でHY（― ）群と 比較して 発現の 低下が認められた。Y群でも3時間 後 にCOX−2mRNA発現は 約1．3倍 に上昇したが、いずれの時間においてもその発現はHY（−）群よりも低下した。

また、HY（−）群のセメント浸出液にHY（十冫群のセメン卜浸出液を混合し、HY（十）群の割合を増加させると濃

‑ 497一

孝 明

人

保 邦

正

若 木

村

八 鈴

田

授 授

授

教 教

教

査 査

査

主 副

副

度依 存的 にcOx―2mRNA発 現の 低 下が 認め られ た。 さ らに 、タ ンニ ン 酸をHY（ 一） 群の セ メン ト浸 出液に添加 す る こ と に よ り 、濃 度依 存 的にcOxー2mRNA発 現 が減 少し た。 次 にGIC浸出 液 によ る歯 髄細 胞 のPGEz産 生量 に 与える影 響を検討した。HY（−）群で 対照群と比較して培養液中 のPGE2量の増加が認められた 。HY（＋）群では HY（ 一冫 群 より 産生 量は 減少 し 、刺 激後12時 間、24時間 では 有意 差 が認 めら れた 。さ ら に、 刺激 後12時間に おいて培養液中のPGEz量を比較するとHY（―）群で対照群の約3倍となり、HY（十）群でHY（l）群の約50％程度、Y 群では約70％程度に減 少した。cOx−2タンパク質の 発現は刺激後120分ではHY（ −）群、HY（十）群ともに上昇し た。240分においてHY（ ―）群では依然発現の上昇 が認められたが、HY（十）群 では発現が著しく低下していた。

GIC浸 出 液 の 刺 激 に よ りcOx−2mRNAだ け で な く 、 タ ン パ ク 質 の 発 現 の上 昇 が認 めら れ、 さ らに 、HY材が セ メ ン ト 浸 出 液 に よ るcOx―2発 現 を タ ン パ ク 質 レ ベ ル で も 抑 制 す る こと が示 唆さ れ た。IにBaの りン 酸化 は HY（−）群では刺激後120分でHY（十）群の1．8倍に上昇していたが、HY（十）群では240分後には刺激前と同程度ま で低 下し た 。本 研究 では 歯髄 細 胞に 対す るセ メン ト 浸出 液の 作用 に よりIにBばの りン 酸 化が 認め られたが、

HY材 を添 加 する こと によ りそ の 発現 が低 下し た。 ま た、ERKはHY（− ）群 においてわずかな りン酸化が認めら れた が、IKBaの 場合 と同 様に 、HY（ 十） 群で はり ン 酸化 は減 少し た 。さ らに、HY（−）群 ではp38のりン酸化 の経 時的 な 増加 が認 めら れ、240分で は 刺激 前の 約5．1倍 に 達し た。 ー方 、HY（十）群では 今回調べた全ての 時 間 に お い て り ン 酸 化 の 誘 導 は ほ と ん ど 見 ら れ な か っ た 。 以 上 の 結果 から 、GIC浸 出液 の 刺激 は歯 髄細 胞 のERKな ら び にp38 MAPキ ナ ー ゼ を 介 す る 伝 達経 路も 存 在し 、HY材が これ ら を抑 制す るこ と が明 らか にな っ た。

  GIC浸 出 液 を 作 用 させ るこ とに よ り、PGE2の産 生量 な らび にPGE2産 生に 関 わる 重要 な酵 素 であ るCOX―2タ ンパ ク質 お よぴmRNAの発 現の 上 昇、 さら には その 上 流に 存在 する 細 胞内 情報 伝達 系の 活 性化 が認 められた。

ま た 、HY材 は こ れ ら を 抑 制 す る こ と を 確 認 した 。一 方 で、HY材 の作 用点 の 詳細 に関 して は まだ 不明 な点 も 多 く 、 さ ら な る 検 討 の 必 要 性 が 示 唆 さ れ た 。本 研究 で はHY材の 歯髄 細胞 に 対す る抗 炎症 作 用に っい てそ の 一端を明らかにした。

  口 頭 試 問 で は 、 本 論 分 の 内 容 と そ れ に 関 連 し た 学 問 分 野 に つ い て 質 疑 応 答 が な さ れ た 。   主な質問事項は、

1．研究を始めるきっか けについて

2．グラスアイオノマーFに入っているHY材の濃度、 また、材料の組成にっいて 3．セメントをDMEMに浸 漬した期間にっいて

4．ATP量にっいて  （ 特に24時間で増加しているこ とに関して）

5．セメン卜浸出液によ るCOX一2誘導にっいて     1）レジンとの違い

    2）COX−1にっいて

6．HY材を含有する覆髄 材について 7．タンニン酸の作用点 について 8．今後の展望にっいて

などであった。

  以 上の 質 問に 対し て、 申請 者 から 適切 かっ 明快 な 回答 が得 られ た 。審 査担 当者 との 質 疑応 答を とおして、

申 請 者 が 本 研 究 な ら び に 関 連 分 野 に 対 す る 理解 が十 分 なさ れて おり 、幅 広 い知 識を 有し て いる こと から 明 らかになり、本研究の さらなる発展、今後の研究が 期待された。

    ー498―

  以上のことから、審査担当者全員が、本研究が学位論文に十分に値し、申請者は博士（歯学）の学位を 授与する十分な学識 ・資質を有しているものと認めた。

―499―