マウスベリリピン遺伝子の転写調節因子の解析 学位論文内容の要旨

博 士 （ 医 学 ） 水 井    聡

学 位 論 文 題 名

マウスベリリピン遺伝子の転写調節因子の解析 学位論文内容の要旨

  哺 乳 動 物 の 脂 肪 組 織 は ， 脂 肪 細 胞 の 細 胞 質 内 に 存 在 す る 脂 肪 滴 に 過 剰 な エ ネ ル ギ ー を 貯 蔵 す る 役 割 を 有 し て い る 。perilipin（ ベ リ リ ピ ン ） は 細 胞 質 内の 脂 肪 滴周 囲 に 存 在す る り ン 酸 化 蛋 白 で あ り ， 脂 肪 組 織 と ス テ ロ イ ド 産 生 臓 器 に 特 異 的 に 発 現 し ， 脂 肪 滴 の 肥 大 化 に に 関 与 し て い る 。 脂 肪 細 胞 に お い て ， ホ ル モ ン 感 受 性 リ パ ー ゼ(HSL)に よ る 脂 肪 滴 内 の ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル の 加 水 分 解 は ， リ ン 酸 化 ベ リ リ ピ ン が 促 進 的 に 働 き ， 反 対 に 非 リ ン 酸 化 ペ リ リ ピ ン は 脂 肪 分 解 か ら 脂 肪 滴 を 防 御 す る 働 き が あ る 。 肥 満 を 基 礎 と し た 生 活 習 慣 病 の 集 積 は イ ン ス リ ン 抵 抗 性 症 候 群 や メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム と 称 さ れ ， 動 脈 硬 化 症 や 心 血 管 系 疾 患 の 発 症 と 強 い 関 連 性 が 示 唆 さ れ て い る 。 肥 満 患 者 の 脂 肪 組 織 で は ， 形 態 学 的 に 脂 肪 細 胞 の 肥 大 化 が 認 め ら れ ， 肥 大 し た 脂 肪 細 胞 か ら はTNF‑aや 遊 離 脂 肪 酸(FFA)， レ ジ ス チ ン な ど の イ ン ス リ ン 抵 抗 性 惹 起 物 質 が 産 生 さ れ る 。 チ ア ゾ リ ジ ン 誘 導 体 は ， 核 内 受容体 であるperoxisome proliferator‑activated receptor (PPAR)Yの活性化を介して小型脂肪細 胞 の 数 を 増 加 さ せ ， イ ン ス リ ン 抵 抗 性 を 改 善 す る 。PPAR(が 脂 肪 細 胞 の 大 き さ を ど の よ う に 調 節 し て い る か は 不 明 な 点 が 多 い が ， 脂 肪 細 胞 の 大 き さ が イ ン ス リ ン 抵 抗 性 の 病 態 に 重 要と考 えられ る。

  本 研 究 で は ， 肥 満 や イ ン ス リ ン 抵 抗 性 の 病 態 に ， 脂 肪 滴 の 大 き さ の 変 化 が 重 要 で あ る と い う 観 点 に 立 ち ，3T3‑L1細 胞 を 用 い て ， マ ウ ス ベ リ リ ピ ン 遺 伝 子 の 転 写 開 始 点 を 同 定し ， さ ら に 転 写 開 始 点 上 流 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 を 解 析 す る こ と に よ り ， 遺 伝 子 発 現 に 関 与 す る 転写調 節因子 の同定を 行った。

  ヒ ト お よ び ラ ッ ト の ペ リ リ ピ ン 遺 伝 子 翻 訳 開 始 点 近 傍 と 相 同 性 を 有 す るcDNAク ロ ー ン の 検 索 をmouse expressed sequence tag database (dEST)を 用い て 行 い， 検 出 され た ク ロー ン の 配 列 を も と に ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー を 作 成 し た 。 マ ウ ス 脂 肪 組 織 か ら 抽 出 し た polyA゛RNAか らcDNAを 作 成 し ，5 ‑rapid amplification of cDNA ends（5 ‑RACE)法 を 行 い ， 得 ら れ たDNA断 片 に32Pで 標 識 し ，129SV/Jマ ウ ス 由 来 の ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー か ら マ ウ ス ベ リ リ ピ ン 遺 伝 子5 側 上 流 ゲ ノ ムDNAを 単 離 し た 。 っ ぎ に 脂 肪 細 胞 分 化 誘 導 後4日 目 の3T3‑L1細 胞 か らtotal RNAを 抽 出 し ， キ ャ ッ プ 構 造 を 有 す る 完 全 長 のmRNAの み か らcDNAを 増 幅 す る 方 法 で あ るRNA ligase‑mediated rapid amplification of cDNA ends   (RLM‑RACE)法 を 施 行 し ， 得 ら れ たDNA断 片 の 塩 基 配 列 決 定 に よ り11箇 所 の 異 な る 転 写 開 始 点 の 存 在 を 確 認 し た 。5 側の 最 上 流の 転 写 開始 点 を 十1と し たが ， 既 報の 転 写 開 始 点 よ り も7bp上 流 に 位 置 し て い た 。 最 上 流 の 転 写 開 始 点 で あ る こ と を 確 認 す る た め に ， 転 写 開 始 点 十1の 上 流 と 下 流 に セ ン ス プ ラ イ マ ー を 設 定 し ，RT‑PCRを 行 っ た と こ ろ 上 流 の セ ン ス プ ラ イ マ ー で は PCRに よ る 増 幅 が 得 ら れ な か っ た 。 こ の こ と か らRLM‑RACE法 に て 同 定 し た 転 写 開 始 点 が 最 上 流 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 多 数 の 転 写 開 始 点 の 存 在 の 理 由 と

し て は ，転 写 開 始 点 上 流 近 傍 にTATA‑，CAAT‑，GC‑boxな ど の プ ロモ ー タ ー 構 造を 認め ないことが考えられた。

  次 に 得ら れ た5 側上 流ゲ ノムDNA約2．4kbを ルシ フェ ラー ゼ発 現ベ クタ ーで あるpGL3 basic vectorに連結しpGL3‑2．4を作成した。pGL3‑2，4をもとに5 側を順に短縮したpGL3‑2．0， pGL3‑1，8，pくJL3‑1．4，pGL3‑llinclI，pGL3‑亠Sacl，pGL3 ‑PvuIIを作成し，分化誘導後2日目 の3T3‑L1細 胞 に 遺 伝子 導入 し，48時間 培養 後ル シフ ェラ ーゼ アッ セイ を行 った とこ ろ，

pくrL3‑1．8とpGL3‑1．4の間に活性の顕著な差を認めた。この問の欠失した約200bpの領域 に転 写因 子結 合部位が存在する可能性が高いと考え，転写開始点上流―2008bpから‑1802bp を 含 む DNA断 片 を 最 長 に 種 々 の 長 さ のDNA断 片 をSV40プ ロ モ ー タ ー を 含 む pGL3 promoter vectorの上流に連結したルシフェラーゼ発現ベクターpGL3pr‑2008，pGL3pr‑1957， pくrL3pr‑1933，pGL3pr‑1858を作成し，エンハンサー活性を検討した。その結果pGL3pr‑2008 のみ 明ら かな ルシフ ェラ ーゼ 活性 上昇 を認 め，pGL3pr‑2008とpGL3pr‑1957の差である51bp の領域が，エンハンサー領域であることが示された。

  このエンハンサー領域には‑1980bpから‑1968bpにperoxisome proliferator‑activated receptor responsive element (PPRE)コンセンサス配列と高い相同性をもつ配列を認めた。転写調節に PPARyが 関 与 し てい るか どう かを 検討 する ため に，NIH‑3T3細 胞に ピオ グリ タゾ ン存 在下 でmPPARy2発 現 ベ ク タ ー と と も にpGL3‑2．4を 遺 伝 子 導 入 し た と こ ろmPPARy2ベ ク タ ー 容量 依存 性に ルシフ ェラ ーゼ 活性 の上 昇を 認め ，転 写調 節にPPARyが関 与している可能性 が示された。

  PPREと推 測 さ れ る領 域を 標識し た野 生型 プロ ーブ およ び変 異型 プロ ーブ を作 成し ゲル シフ トア ッセ イを行 った 。そ の結 果， 標識 野生型プローブではシフトバンドを検出し，過 剰 な 非 標識 野 生 型 プ ロ ー ブ を 加 え る と そ の バ ン ド は 消 失 し ， 標 識野 生 型 プ ロ ーブ に抗 PPARy抗 体 を 加 え る と ス ー パ ー シ フ トバ ン ド を 検 出 し た 。 ま た ，pGL3pr‑2008のPPRE部 位変 異ベ クタ ーを作成し， NIH‑3 T3細胞に導入したところ，野生型ベクターでは，ピオグ リタ ゾン とmPPARy2発現 ベク ター を同 時に 投与し た場 合は ルシ フェ ラー ゼ活性が上昇し，

3T3‑L1細胞 で は ， 脂肪 分化 後の細 胞に 導入 した 場合 で活 性上 昇を 認め たが ，変 異ベ クタ ー で は いず れ の 場 合も 有意 な活性 上昇 は認 めな かっ た。 これ らの 結果 から ，こ のPPREは PPA． Ryと 結 合 し ， さ ら に 機 能 性 を 有 す る PPREで あ る こ と が 示 さ れ た 。   最後に，3T3‑L1脂肪細胞にピオグリタゾンとともにpGL3‐2．4を遺伝子導入したところ，

pGL3‑2．4のル シフ ェラ ーゼ 活性 はピ オグ リタゾ ン容 量依 存性 に上 昇し ，ピオグリタゾン が 同 定 したPPREを 介 し て3T3‑L1脂 肪 細 胞 に お け る ぺ り り ピ ン 遺 伝子 の 発 現 を 調節 して いることが明らかとなった。

  こ のよ うに 脂肪滴 の増 大に 深く 関与 して いる ベリ リピ ンは ，本 研究 でPPARyの調節を直 接 受 け てい る こ と が明 らか となっ た。 本研 究で は， ゲル シフ トア ッセ イで 同定 したPPRE に別 の核 内受 容体が 結合 する 可能 性も 示唆 されており，ペリリピンの転写調節を標的とす る肥満治療は今後更なる検討が必要と考えられた。

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

マウスベリリピン遺伝子の転写調節因子の解析

脂 肪 組 織 は ， 脂 肪 細 胞 の 細 胞 質 内 に 存 在 す る 脂 肪 滴 に 過 剰 な エ ネ ル ギ ー を 貯 蔵 する 役割 を有 して いる 。ベ リ リピンは細胞質内の脂肪滴周囲に存在する りン酸化蛋白 であ り， 脂肪 滴の 肥大 に関 与 する。また，ホルモン感受性リバーゼによ る脂肪の加水 分解は，リン酸化ペリリピンが促進的に働 き，反対に非リン酸化ペリリピンは脂肪分解 から 脂肪 滴を 防御 する 働き が ある。肥満は，生活習慣病やインスリン抵 抗性症候群と の 強 い 関 連 性 が 示 唆 さ れ て い る 。 肥 満 患 者 の 脂 肪 組 織 では ，形 態学 的に 脂肪 細胞 の肥 大化 が認 めら れ， 肥大 し た脂 肪細 胞か らは イン スリ ン抵 抗性 惹起 物質 が産 生さ れる。このことから脂肪細胞の大きさがイ ンスリン抵抗性の病態に重要と考えられる。

本研 究で は， 肥満 やイ ンス リ ン抵 抗性 の病 態に ，脂 肪滴 の大 きさ の変 化が 重要 であ るとレゝう観点に立ち，3T3‑L1細胞を用い て，マウスベリリピン遺伝子の転写開始点を 同定 し， さら に転 写開 始点 上 流のプ口モーター領域を解析することによ り，遺伝子発 現 に 関 与 す る 転 写 調 節 因 子 の同 定を 行っ た。3T3‑L1脂 肪 細胞 から 総RNAを 抽出 し，

キ ャ ッ プ 構 造 を 有 す る 完 全 長 のmRNAめ み か らcDNAを 増 幅 す る 方 法 で あ る RLM‑RACE法 を 施 行 し ， 得 ら れ たDNA断 片 の 塩 基 配 列 決 定 に よ り11箇 所 の 異 な る 転写 開始 点の 存在 を確 認し た 。また，3種の 選択的スプライシングを認めた。5 側の 最 上 流 の 転 写 開 始 点 を+1と した が， 既報 の転 写開 始点 よ りも7bp上流 に位 置し てい た。 転写 開始 点+1の上 流と 下 流に セン スプ ライ マー を設 定し ，RT‑PCRを行 った とこ ろ上 流の セン スプ ライ マー で はPCRに よる 増幅 が得 られ なかった。この ことから本研 究で 同定 した 転写 開始 点が 最 上流 であ るこ とが 確認 され た。 また ，転 写開 始点 上流 近 傍 にTAI、A． ，CAAr‐ ，GC‐boxな ど の プ 口 モ ー タ ー 構 造 を 認 め な か っ た 。 次 に 転 写 開 始 点 上 流 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 約2．4kbをpGL3basicvectorに 連 結 し て pGL3｜2．4を作成し，さらにそれをもとに 種々の長さのプ口モーター領域を結合したル シフ ウラ ーゼ 発現 ベク ター を 作成 した 。3T3‐Ll細 胞に 遺伝子導入しル シフェラーゼ アッ セイ を行 った とこ ろ， 転 写開始点上流約2．0kbから約1．8kbの間に 活性の顕著な 差 を 認 め た 。 こ の 間 の 短 縮 し た 約200bpの 領 域 をSV40プ 口 モ ー タ ー を 合 むpGL3 promotervectorの 上流 に連 結 した ルシ フウ ラー ゼ発 現ベ クタ ーを 作成 し同 様に 活性 値を 測定 した とこ ろ， ‐2008bpと‐1957bpの間に転写因子結合領域が存 在することが 示 唆 さ れ た 。 こ の 領 域 内 に 転写 因子PPARYの結 合す る配 列で あるPPREと高 しゝ 相同 性を もつ 配列 を認 めた 。PPARYを 発現 して いな いNIH‐3T3細胞にピオグ リタゾン存在 下でPPARY発現 ベク ター とと もにpGL3‐2．4を 遺伝 子導 入 した とこ ろPPARY発現 ベク

夫 雄

博

隆 輝

正

池 橋

香

小 石

浅

授 授

授

教 教

教

査 査

査

主 副

副

夕ー容量依存性にルシフェラーゼ活性の上昇を認め，転写調節にPPARyが関与して いる可能性が示された。PPREと推測される領域を標識した野生型プ口ーブおよび変 異型プ口ーブを作成しゲルシフトアッセイを行ったところ，標識野生型プ口ーブではシ フトバンドを検出し，過剰な非標識野生型プ口ーブを加えるとそのバンドは消失し，抗 PPARy抗体を加えるとスーバーシフトバンドを検出した。また，PPRE部位変異ベクタ ーを作成し，ピオグリタゾンとPIARy発現ベクターを投与したNIH‑3T3細胞と3T3‑L1 脂肪細胞に導入したが，活性の上昇を認めなかった。これらの結果から，本研究で 同定し たPPREはPPARyと結 合する機能性PPREであることが証明された。最後に，

3T3‑L1脂肪細胞にピオグリタゾンとともにpGL3‑2.4を遺伝子導入したところ，活性は ピオグリタゾン容量依存性に上昇した。以上より，PPAR‑(は同定したPPREを介して 3T3‑L1脂肪細胞においてべりりピン遺伝子の発現を直接調節していることが明らかと なった。質疑応答では，副査石橋教授から，転写開始点が既報の結果と異なる理由 について，ベリリピン蛋白の脂肪滴へ移動のメカニズムと受容体の存在について，脂 肪細胞の大きさとべりりピン量との関係について，他のPPARも転写調節に関与する かについての質問があった。次いで副査浅香教授から，PPARyの抑制と脂肪細胞の 大きさについて，ベリリピン遺伝子制御の臨床応用について，ベリリピンの活性と動脈 硬化・糖尿病との関係についての質問があった。次いで主査小池教授から，PPAR family以外の転写因子の関与の可能性について，ピオグリタゾンをvivoに投与した 場合のべりりピンの発現について，研究成果を踏まえて今後の臨床応用への展望に ついての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は概ね適切に回答した。

  この論文は，脂肪細胞の分化に関与する因子PPARyの新たなターゲット遺伝子に ペリリピンが加わることを初めて明らかにした点で高く評価され，本論文の成果から今 後の肥満の病態解明と新しい治療開発が期待される。

  審査委員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単 位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判 定した。