昭 和62年4月20日 449
B群
溶 血 レ ン サ 球 菌(Streptococcus
agalactiae)の
Chloramphenicol耐
性 機 構
レンサ球菌感染症研究会(会 長:中 島邦夫)
新潟県衛生公害研究所
寺
尾
通
徳
岡
尾
勇
一
新潟大学歯学部 口腔細菌学教室
桶
谷
修
三
(昭和61年9月5日 受付)
(昭和61年9月17日 受理)
Key words:
Streptococcus agalactiae, Group B Streptococci, Chloramphenicol resistance
Chloramphenicol acetyltransferase
要 旨
臨 床 由 来B群 溶 血 レ ン サ 球 菌(Streptococcus agalactiae)100株 に つ い て 血 清 型 別 及 び 薬 剤 感 受 性 試 験 を 行 っ た.そ の うちChloramphenicol(CP)耐 性 株 をBTO21,BTO22及 びBTO23と し,CP耐 性 と Chloramphenicol acetyltransferase(CAT)産 生 能 を 他 のB群 溶 連 菌 に 接 合 伝 達 で 転 移 させ る こ と が で き た.よ っ てBTO株 の 耐 性 はplasmidに よ って 支 配 され るCAT産 生 に 帰 せ ら れ る も の と考 え られ た. 接 合 伝 達 性Rplasmid(pBTO22)をrecipientに 伝 達 し,そ の 分 子 量 を 求 め た と こ ろ原 株 と同 一 の 大 き さ(19∼20×106)のplasmidDNAが 検 出 さ れ た. CP不 活 化 産 物 の 分 析 の 結 果,CPの ア セ チ ル 化 産 物 で あ る1-acetoxy CP, 3-acetoxy CP及 び1, 3-diacetoxy CPを 証 明 し,本 酵 素 は,CATで あ る こ と が 確 認 され た.
は じめ に
薬 剤 耐 性 菌 が 薬 剤 不 活 化 酵 素 産 生 に よ り耐 性 化
す る こ とは 周 知 の こ と で あ り,chloramphenicol
(CP)で
は そ の 酵 素 はchloramphenicol
acetyl-transferase (CAT)で
あ る こ とが 明 らか に され て
い る1).私達 は す で に い くつ か の菌 種 でCAT産
生
がCP耐
性 因 子 と密 接 に相 関 し て い る こ と を 指
摘2)3)して きた.
B群 溶 血 レ ンサ 球 菌(B群
溶 連 菌)は
近 年 新 生
児4)の髄 膜 炎 の起 因 菌 と し て 分 離 され 注 目 され て
お り,各 種 臨 床 材 料 か らの 分 離 例 も増 加 の 傾 向 に
あ る こ とか ら,薬 剤 感 受 性 の 動 態 に つ い て も関 心
が もた れ て い る.
当 研 究 所 で1980年 ∼1983年 の3年 間 に分 離 同 定
し た 患 者 由 来Streptococcus agalactiae 100株 に つ い て 凝 集 反 応 に よ る 血 清 型 別 と薬 剤 感 受 性 に つ い て 検 討 しCP耐 性 株 を 分 離 し た の で,そ の 耐 性 機 序 に つ い て 報 告 す る. 材 料 と方 法 1.供 試 菌 株 及 び 血 清 型 別 新 潟 県 衛 生 公 害 研 究 所 で1980年 ∼1983年 の3年 間 にStzeptococcus agalactiaeと 同 定 さ れ た 臨 床 由 来 株100株 に つ い て,B群 型 別 用 血 清(デ ン カ 生 研)と の ス ラ イ ド凝 集 反 応 を 行 い,菌 型 の 表 示 は, 横 尾 ら5)が 提 案 し て い る 記 載 方 法 に よ っ た. 2.薬 剤 感 受 性 供 試 菌 株100株 に 対 す る 各 種 薬 剤 の 最 小 発 育 阻 止 濃 度(MIC)測 定 は,日 本 化 学 療 法 学 会 の 再 改 定 法6)に 準 じ てAminobenzyl penicillin (AB-PC), CP, Tetracycline (TC), Erythromycin 別 刷 請求 先:(〒950-21)新 潟 市 曽和314の1(EM),Kanamycin(KM)及 びStreptomycin (SM)の6薬 剤 に つ い て 実 施 し た.
3.CP不 活 化 産 物 の 同 定 及 び,CAT活 性 の 測 定
被 検 菌 をBrain Heart Infusion broth(BHI-broth)で16時 間 培 養 後,2×108cell/m1に 調 整 し た 培 養 液2mlにCP100μg∼200μg/ml含 有BHI-brothを 同 量 加 え37℃3時 間 恒 温 槽 で 静 置 培 養 し た.反 応 終 了 後100℃5分 熱 処 理 を 行 っ て 酵 素 作 用 を 止 め,そ の 遠 心 上 清 に 残 存 す るCP力 価 をBacil-lus subtilis ATCC6633を 検 定 菌 と す る 薄 層 カ ッ
プ 法 で 測 定 し不 活 化 を 判 定 し た .
不 活 化 の 認 め ら れ た も の に つ い て は 培 養 濾 液 か ら不 活 化 産 物 を 酢 酸 エ チ ル で 抽 出 し,シ リカ ゲ ル 薄 層 プ レ ー ト(Silica Gel 60 Sheet, Merk)に ス ポ ッ ト し,chloroform: methanol=95:5の 溶 媒 で 展 開 し た.対 照 と し て 化 学 的 に 合 成7)し たl-acetoxy CP,3-acetoxyCP及 び1,3diacetoxyCPを 使 用
し た.
4.耐 性 除 去 実 験
CP耐 性 被 検 菌 をethidium bromide及 びacri-Havine処 理 を 行 い レ プ リ カ 法 で 感 受 性 株 の 出 現
を 検 し た. 5.耐 性 の 伝 達
CP,TC耐 性 株 が 伝 達 性R因 子 を 保 有 し て い る か ど うか 伝 達 試 験 を 行 っ た .供 試 し たdonor及 び recipientの 性 状 はTable1に 示 し た .な おrecipi-entのRifampicin(RFP)及 びFusidic acid(FA)
の 耐 性 は 私 達 が 付 与 し た も の で あ る. donor及 びrecipientはL-brothで16時 間 前 培 養 し,同brothで50倍 に 希 釈 後 更 に3時 間 振 愚 培 養 を 行 っ て10mlのL-brothにdonor 0.1ml,reci-pient 0.5mlあ て 接 種 し,30℃90分matingを 行 っ た.直 ち に そ の0.1mlを,薬 剤 を 添 加 し た5%馬 血 液 加BHI寒 天 培 地 に 塗 沫 した.あ る い は,培 養 液 5mlを ミ リポ ア フ ィ ル タ ー(0.45μm,φ23mm)で 集 菌 し血 液 寒 天 平 板 上 で30℃3時 間 保 温 後,フ ィ ル タ ー を1mlの 生 理 食 塩 水 で 懸 濁 し そ の0.1m1を 選 択 平 板 に 塗 沫 し た. 伝 達 頻 度 は,30℃48時 間 培 養 後,donorあ た り耐 性 を 獲 得 し たtransconjugantの 比 で 表 わ し た.得 ら れ たtransconjugantはrecipientで あ る こ と を 血 清 型 別 で 確 認 し た.な お 選 択 平 板 の 薬 剤 濃 度 は CP,TC及 びRFPそ れ ぞ れ10μg/mlで あ る. 6.PlasmidDNAの 分 離 と 分 子 量
donor及 びtransconjugantか ら のPlasmidの 調 製 はKadoら8)の 方 法 に 準 じ て 行 い,phenol-chloroform処 理,ethanol沈 殿 を3回 繰 返 し精 製 し た.plasmidDNAの 分 子 量 は,bacteriophage λDNAHindIII分 解 物(日 本 ジ ー ン)を 標 準 物 質 と し て0.7%ア ガ ロ ー ス(Seakem ME)電 気 泳 動 で 測 定 し た. 結 果 1.B群 溶 連 菌 の 菌 型 S.agahlctiaeと 同 定 さ れ た 菌 株100株 の 由 来 別 内 訳 は,泌 尿 器 由 来 が60%,咽 頭 由 来30%及 び 髄 膜 炎 由 来 が10%で あ っ た.供 試 菌 の う ち1a型 及 び 易 熱 性 抗 原 を 付 髄 し て い る1a型 タ イ プ が58株 を 占 め,次 い でIII型 及 びIII型 タ イ プ が17株 で あ っ た(Table2).
Table 1 Properties of Bacterial strains used
CP: Chloramphenicol TC: Tetracycline RFP: Rifampicin FA: Fusidic acid EM: Erythromycin
昭 和62年4月20日 451
Table 2 Serotypes
of clinical group
B
Stre-ptococci isolates (100)
2.薬 剤 感 受 性 Table3に 示 す よ う に 全 株 がAB-PCに 感 受 性, KM,SMに は 耐 性 で あ り,TCに 対 し て は 耐 性 傾 向 を 示 し た.EMに 対 し て は,MICの 範 囲 は, <0.78μg/ml∼>100μg/ml,MIC50は く0.78 μg/ml,MIC90は50μg/mlと 感 受 性 及 び 耐 性 の 明 ら か な2峰 性 を 示 し た.CPのMIC25μg/mlを 示 す 菌 株11株 が 得 ら れ,い ず れ の 菌 株 もCPを 不 活 化 し た(Table3). こ れ ら の 耐 性 株 がCATを 産 生 し て い る 可 能 性 が あ る こ と は,こ の 耐 性 がPlasmidに よ る こ と を 示 唆 す る の でMIC100μg/mlで か つTC耐 性 を 併 せ も つ 株 を3菌 株 選 び,CATの 証 明,接 合 伝 達 に よ るR因 子 の 転 移 及 びplasmidの 保 有 に つ い て 検 討 し た. 3.CP耐 性 の 伝 達 頻 度 Table3に 示 す よ う にCP及 びTC耐 性 株3 株,BTO21,BTO22及 びBTO23をdonorと し た.い ず れ の 株 も 抗 原Rを 保 有 し て い た.recipi-entと し てCP・TCに は 感 受 性 の 株,BMU71, BMU72,BMU73及 びBMU74の4株 を 選 び RFP及 びFAの 耐 性 を 付 与 し た.recipient4株Table 3 Susceptibility patterns of clinical group B Streptococci isolates to antimicrobial agents
Table 4 Transfer of chloramphenicol and tetracycline resistance determinants
Fig. 1 Thin-layer chromatogram of the inactivated products of chloramphenicol and the authentic samples.
The solvent system was chloroform: methanol= 95: 5.
Thin-layer
chromatogram
は す べ て 抗 原IIIを 保 有 し て い た . BTO22株 のCP・TC耐 性 因 子 のBMU73株 へ の 伝 達 頻 度 は10-6レ ベ ル で 低 率 で あ っ た も の の, そ の 他 の 株 へ は10-4と 高 頻 度 で 伝 達 さ れ た.CP及 びTCの 伝 達 頻 度 が 同 程 度 で あ る こ と か らCP・ TCの 耐 性 が 連 関 し て い る 可 能 性 が あ る の でCP で 選 択 し た 株 のCP・TC耐 性,TCで 選 択 し た 株 のCP・TC耐 性 を 調 べ た .そ の 結 果,ど ち ら で 選 択 し て もtransconjugantは 両 者 の 耐 性 を 併 せ も っ て い た.こ の こ と か らCP・TC耐 性 因 子 は1 つ の 耐 性 因 子 上 に あ る こ と が 推 定 さ れ た(Table 4).BTO21株 及 びBTO23株 のCP,TC耐 性 因 子 の 伝 達 頻 度 はBTO22株 の そ れ と比 べ て 低 率 で あ っ た.BTO23株 のCP,TC耐 性 は 連 関 し て い な い も の と 推 定 さ れ る. 4.耐 性 の 脱 落 BTO株3株 をethidiumbromide(MICO .78 μg/ml)及 びacrifiavine(MIC3.125μg/ml)で 処 理 し 感 性 株 の 出 現 を 検 し た が,CP耐 性 の 脱 落 は い ず れ も0.5%と 低 率 で あ っ た . 5.CP不 活 化 産 物 の 同 定 CPの ア セ チ ル 化 を 証 明 す る こ と に よ りCP不 活 化 酵 素 がCATで あ る こ と が 確 認 さ れ る の で CP不 活 化 産 物 の 同 定 を 行 っ た . Fig.1に 示 す よ うに,BTO株 及 び 耐 性 を 獲 得 し たtransconjugant株 に は,CPの 不 活 化 産 物 で ある1-acetoxy CP,3-acetoxyCP及 び1,3-diace-toxyCPの ス ポ ッ トが 検 出 さ れ た がrecipient株 はCPの ス ポ ッ トの み が 検 出 さ れ た .こ の こ と か ら,CP耐 性 はCAT産 生 に よ る も の で あ り,そ の ア セ チ ル 化 機 構 は 各 種 のCAT産 生 菌 で 明 ら か に さ れ た 経 路 を と る も の と 思 わ れ る, 6.CP耐 性transconjugantのCAT活 性 transconjugantを 無 作 為 に 選 びMICを 測 定 し た.CPのMICは6.25μg/mlか ら50μg/mlと donorBTO22株 と 同 程 度 の 耐 性 度 を 得 ,TC耐 性 も<0.78μg/mlか ら25μg/ml∼50μg/mlと 著 し く上 昇 し て い た(Table5).更 にCATの 活 性 を
昭 和62年4月20日 453
Table 5 Susceptibility
of transconjugants
to
chloramphenicol
and tetracycline
Table 6 Levels of enzyme
(CAT)
activity
in
donor, recipient and transconjugants
CAT: Chloramphenicol acetyltransferase
測 定 し た と こ ろ,原 株 に 無 いCAT活 性 が 出 現 し donorの も つ 酸 素 活 性 と 同 レベ ル ま で 上 昇 し て い た(Table6). 7.BTO22株 のplasmidDNAの 分 子 量 CP・TCの 伝 達 頻 度 が 高 いBTO22株 に つ い て plasmidDNAの 証 明 と分 子 量 測 定 を 行 っ た. Fig.2に 示 す よ う に,BTO22,BMU71/22 (BTO22×BMU71),BMU72/22(BTO22× BMU72)及 びBMU74/22(BTO22×BMU74) に つ い て,ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 を 行 っ た と こ ろ, 同 一 のplasmidDNAバ ン ドが 検 出 さ れ そ の 分 子 量 は19∼20×106で あ った.BTO22株 保 有 のplas-mid(CPr,TCr)をpBTO22と し た.
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of plasmid DNA from CP resistant transconjugants.
Bacteriophage ƒÉ DNA digested with Hind III as a molecular weight standard, with numbers shown •~106 (M dal). 考 察 Miyamura9)がR因 子 保 有CP耐 性 菌 の 培 養 液 にCP不 活 化 作 用 を 認 め 報 告 し て 以 来,Suzukilo) とShawら11)はCP不 活 化 作 用 はCATの 産 生 に よ る も の で あ る こ と を 報 告 し た.私 達 も す で に レ ン サ 球 菌 属2)のStreptococcuspyogenes,S
pneumoniae及 びS.faecalisに つ い てCATの 証 明 を 行 い ア セ チ ル 作 機 構 の 経 路 を 明 ら か に し て き た. S.agalactiaeのCP耐 性 機 構 に 関 し て は,す で に 接 合 伝 達 性plasmid12)∼14)に よ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る がCAT産 生 の 有 無 に つ い て は 不 明 で あ っ た.本 実 験 で 供 試 し たBTO22株 は, 19∼20×106の 分 子 量 を も つpBTO22を 保 有 し CATを 産 生 し た.BTO21株 及 びBTO23株 に つ い て はplasmidを 検 索 し な か っ た が,CATの 産 生,伝 達 実 験 等 か らBTO22株 同 様plasmidが 関
与 し て い る も の と 思 わ れ る.今 の と こ ろ,EMに つ い て 実 験 し て い な い が,pBTO22は,少 な く と も CP・TC耐 性 を コ ー ド し て い る も の と 思 わ れ る. レ ン サ 球 菌 属 の 接 合 性Plasmidは,伝 達 頻 度 か ら 大 き く2つ に 大 別 さ れ,伝 達 頻 度 の 極 め て 高 い (10-1∼10-3)グ ル ー プ と10-6以 下 の 低 い グ ル ー プ に 分 け ら れ て い る.こ れ に は 接 合 に 関 与 す る 性 フ ェ ロ モ ン15)の存 在 が 考 え ら れ て い る.今 回 の 接 合 実 験 で もdonorとrecipientの 組 合 せ で 著 し く 凝 集 を 起 す 場 合 が あ っ た.B群 溶 連 菌 で もS. faecahs同 様 に 接 合 に 関 与 す る 性 フ ェ ロ モ ン が 存 在 し,接 合 伝 達 で の い わ ゆ る 相 性 が あ る も の と 思 わ れ る.相 性 の 良 いrecipientを 探 索 す る こ と は, 今 後,溶 連 菌 のplasmidの 疫 学 を 研 究 し て い く上 で 有 意 義 で あ る と 思 わ れ る. 今 後 ま す ま す 伝 達 性 薬 剤 耐 性plasmid保 有B 群 溶 連 菌 の 増 加 が 予 想 さ れ,本 菌 に よ る 感 染 症 と 化 学 療 法 に 留 意 す る 必 要 が あ る も の と思 わ れ る. 文 献
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昭 和62年4月20日 455
Mechanism of Chloramphenicol Resistance in Group B Streptococci (Streptococcus agalactiae)
Michinori TERAO & Yuuichi OKAO
Niigata Prefectural Research Laboratory for Health and Environment Shuzo OKETANI
Department of Oral Microbiology School of Dentistry, Niigata University
One hundred group B Streptococci (Streptococcus agalactiae) isolated from clinical specimens investiaged for serotyping and drug susceptibility. Of these, 3 donor strains designated BTO 21, BTO 22 and BTO 23, transferred chloramphenicol (CP) resistance marker and chloramphenicol acetyl-transferase (CAT) producing activity by conjugation into group B Streptococci recipient strains. The CP resistance appeared to be due to the presence of CAT mediated by a plasmid.
The molecular weight of a streptococcal conjugative R plasmaid, designanted pBTO 22, was investigated after transfer into recipient strains and was found to be similar to that the wild-type group B Streptococcus host (19-20•~106).
The products of chloramphenicol acetylation obtained by inactivation were identified as 1-acetoxy, 3-acetoxy and 1,3-diacetoxy derivatives, respectively, by thin-layer chromatography.
