岡山 医学会雑 誌 第118巻 May2006,pp.9-15
平成16年度岡山医学会賞(林 原賞)受 賞論文
テ ロ メ ラ ー ゼ 特 異 的 に増 幅 す るGFP蛋
白 を 用 い た
マ ウス の固形 腫瘍 の胸膜 播種 の可視 化
梅 岡 達 生a,b*,川 嶋 健a,香 川 俊 輔a,寺 石 文 則a,滝 正 樹a,京 哲c
永 井 勝 幸d,浦 田 泰 生d,田 中 紀 章a,藤 原 俊 義a a岡山大 学大 学院 医歯薬 学 総合研 究 科 腫 瘍 制御 学,b松 山市民 病 院 外 科, c金沢 大 学 医 学 部 産 婦 人 科 学 ,dオ ン コ リ ス.バ イ オ フ ァー マ キ ー ワ ー ド:GFP,ア デ ノ ウ イ ル ス,テ ロ メ ラ ー ゼ,増 幅,遺 伝 子 治 療 緒 言 癌 や そ の 転 移 の 診 断 に お い てCT,US,MRI等 さ ま ざ ま な 画 像 診 断 手 段 が 進 歩 して き て お り感 度 が 増 し て き て い る が1,2),そ れ は 解 剖 学 的 や 形 態 学 的 診 断 に と ど ま り,組 織 学 的 診 断 は い ま だ に重 要 な 位 置 を 占 め て い る.ま た,GFPは お わ ん ク ラ ゲ 由 来 の 蛍 光 蛋 白 質 で あ り3-5),近 年GFP遺 伝 子 を マ ー カ ー と して 導 入 細 胞 を 検 出 す る 方 法 が 多 用 さ れ て い る6-10).以 前 hTERT promoter特 異 的 に ア デ ノ ウ イ ル ス が 増 殖 に 必 要 なE1蛋 白 質 を 発 現 す る 制 限 増 殖 型 ベ ク タ ー (OBP-301,"Telomelysin")を 作 成 し た11).ヒ トテ ロ メ ラ ー ゼ 逆 転 写 酵 素(hTERT)は 癌 細 胞 に お い て は85%以 上 に 発 現 して い る が,正 常 細 胞 に お い て は生 殖 細 胞 等 を 除 い て は ほ と ん ど 発 現 し て い な い12,13). GFPを 発 現 す る 非 増 殖 性 ベ ク タ ー(Ad-GFP)と OBP-301を 共 感 染 さ せ る こ と で 癌 細 胞 の み でAd-GFPの 増 殖 が 生 じ,蛍 光 顕 微 鏡 に て 生 き た ま ま 癌 細 胞 を 可 視 化 す る こ と が 可 能 で あ っ た.一 方,同 量 の Ad-GFPとOBP-301の 感 染 で は 正 常 な ヒ ト線 維 芽 細 胞 で は 強 い 蛍 光 は発 現 し な か っ た.さ ら に,ヌ ー ドマ ウ ス 背 部 に移 植 し た ヒ ト非 小 細 胞 肺 癌 にAd-GFPと OBP-301を 局 所 投 与 す る と,高 感 度 蛍 光 感 知 カ メ ラ を用 い てinvivoに お い て も生 き た ま ま腫 瘍 の み を 可 視 化 す る こ と が で き た.同 量 のAd-G。FPとOBP-301を 正 常 部 皮 下 に 投 与 し て も 蛍 光 を 観 察 す る こ とが で き な か っ た.こ の シ ス テ ム を用 い て ヌ ー ドマ ウ ス の ヒ ト非 小 細 胞 肺 癌 の 胸 膜 播 種 モ デ ル で も 胸 腔 内 に Ad-GFPとTRADを 投 与 す る こ と に よ り播 種 巣 の み を 特 異 的 に可 視 化 す る こ と が 可 能 で あ っ た.こ の 方 法 は 非 侵 襲 的 で 簡 便 で あ り,微 小 癌,微 小 転 移 の 早 期 発 見 に有 用 で あ る と思 わ れ る. 材 料 と 方 法 1.細 胞 株 癌 細 胞 株 と し て ヒ ト非 小 細 胞 肺 癌H1299,H358, H226Br,A549,ヒ ト大 腸 癌 細 胞 株SW620,LoVo, DLD-1ま た 正 常 細 胞 と し て ヒ ト正 常 胎 児 肺 線 維 芽 細 胞WI38,ヒ ト肺 線 維 芽 細 胞NHLF,ヒ ト胎 児 膀 帯 内 平 成18年1月 受 理 *〒790-0067松 山 市 大 手 町2丁 目6-5 松 山 市 民 病 院 電 話:089-943-1151FAX:089-933-4877 E-mail:umeoka@matsuyama―shimin-hsp.or ,jp ◆ プ ロ ブ イ ー ル ◆ 梅 岡 達 生 平 成6年 岡山 大 学 医学 部 消化 器 腫 瘍外 科 学 講座(旧 第 一外 科)に 入 局(臨 床研 修 後 平成11年 に 帰局.田 中 紀章 教 授,藤 原 俊 義 先生 御 指 導 の下,研 究 しま した.当 初 は 培養 癌 細 胞 に様 々 な遺 伝 子 導 入 を行 い アポ トー シ ス を お こ さ せ る方 法 を検 索 して い ま した が,蛍 光 を マ ー カー と してい る う ち に,癌 細 胞 を 蛍光 を用 い て特 異 的 に標 識 する 方 向へ と研 究 を変 更 しま した.今 回 マ ウス の 胸膜 播 種 をGFP遺 伝 子 と アデ ノ ウ イル ス ベ ク ター を用 い て癌 細 胞 の み に発 現 さ せる こ とに よ り可視 化 しま した.将 来 的 に は癌 の胸 膜 播 種 や腹 膜 播 種 ある い は リンパ 節転 移 な ど の早 期 発 見 や手 術 中 の診 断の た め の技 術 へ とつ な が れ ば有 意 義 で ある と考 えて い ま す.
皮 細 胞HUVECを 使 用 し た. 2.組 み 換 え ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ー 制 限 増 殖 型 ア デ ノ ウ イ ル スOBP―301は 以 前 わ れ わ れ の 作 成 した も の を用 い た11).GFPcDNAを 含 ん だ ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ーAd-G、FPも 使 用 し た(図1). 3.定 量 リ ア ル タ イ ムPCR解 析 各 癌 細 胞,正 常 細 胞 に お け るhTERTプ ロ モ ー タ ー の 活 性 をmRNAレ ベ ル で リ ア ル タ イ ムPCRに よ っ て 測 定 し,A549の 発 現 を1と し た 相 対 比 で 発 現 レベ ル を 比 較 し た. 4.in vitroに お け る 蛍 光 発 現 SW620,A549,H1299,WI-38,NHLF,HUVEC
にAd-GFPを0.1 MOI単 独 感 染 あ る い はOBP-301 を1 MOI共 感 染 さ せ た.GFPの 発 現 は24時 間 後 蛍 光 顕 微 鏡 を 用 い て 観 察 した. 5.in vivoに お け る 蛍 光 発 現 SW620,A549を そ れ ぞ れ 第5週 メ スBALB/cヌ ー ドマ ウ ス の 背 部 に5×106接 種 し て3週 間 後 腫 瘍 を 形 成 し た 後 にAd-GFPを8×105PFU/50μl単 独 あ る い はAd-GFPを8×105PFU/25μlにOBP-301を8× 図1 OBP-301とAd-GFPの 構 造 図 で あ る.制 限 増 殖 型 ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ーOBP-301はhTERT promoter存 在 下 に て EIAお よ びEIB蛋 白 を 発 現 す る.Ad-OFPはCMV prornoter
に てGFP蛋 白 を発 現 す る. 106PFU/25μl加 え た も の を 腫 瘍 内 投 与 し た.対 照 群 と し て は 同 量 の ウ イ ル ス を 皮 下 に 投 与 し た.GFPの 発 現 は1,2,3,7,14日 に 麻 酔 下 に 観 察 した.ま た,可 視 化 胸 膜 播 種 モ デ ル はA549を5×106/200μ1胸 腔 内 投 与 し,2週 間 後 に4×107PFU/50μ1のAd-OFPと4×107PFU/50μlのOBP-301を 胸 腔 内 投 与 し5日 後 に 観 察 し た. 6.CCDイ メ ー ジ ン グ GFP蛍 光 の イ メ ー ジ ン グ は 浜 松 ホ トニ ク ス 社 の 蛍 光 フ ィ ル タ ー お よ び3-chipcolorCCDカ メ ラ を用 い た.高 解 像 度 画 像 はEPSONPCに てAdobe Photoshop 4.0.1J softwareを 用 い て 作 成 し た. 結 果 1.各 癌 細 胞,正 常 細 胞 に お け るhTERTpromoter の 発 現 テ ロ メ ラ ー ゼ は悪 性疾 患 の マ ー カ ー で あ る14).癌 細 胞 のH1299,A549,H226Br,SW620,LoVo,DLD1 お よ び293細 胞 で はmRNAレ ベ ル でhTERTの 発 現 を 認 め た が,正 常 細 胞 のWI38,NHLFで は 認 め な か っ た(図2). 2.in vitroに お け る ヒ ト癌 細 胞 の 選 択 的 可 視 化 癌 細 胞SW620,H1299,A549,にAd-GFPと OBP-301を 共 感 染 さ せ た 群 で は24時 間 後 よ りGFPの 強 い 発 現 が 見 ら れ,3日 目 ま で は増 強 し て い っ た.癌 細 胞SW620,H1299,A549,にAd-GFPを 単 独 感 染 させ た 群 で はGFPの 発 現 は あ ま り認 め ら れ な か っ た がH1299に の み 弱 い 発 現 を 認 め た.こ れ はH1299の
Relative hTERT mRNA Expression
図2 ヒ ト腫 瘍 細 胞 と正 常 細 胞 のh7ERTmRNAレ ベ ル を リ ア ル タ イ ムPCRを 用 い て相 対 的 に 比 較 し た.A549を1.0と し て い る.
GFP遺 伝 子 の増幅 による腫瘍 の可 視化:梅 岡達生,他9名 ア デ ノ ウ イ ル ス 感 染 に対 す る 高 感 受 性 に よ る も の で あ る.一 方 ヒ ト正 常 細 胞WI-38,NHLF,HUVECで はAd-GFPとOBP-301を 共 感 染 さ せ た 群 で もGFP の 発 現 は ほ と ん ど認 め ら れ な か っ た.こ れ ら の 結 果 は Ad-GFPは 癌 細 胞 内 でOBP-301の 存 在 下 に お い て の み 複 製 で き る こ と を示 し て い る(図3). 3.マ ウ ス にAd-OFPを 皮 下 投 与 し た 場 合 の 投 与 量 と蛍 光 発 現 の 強 さ に つ い て マ ウ ス 皮 下 にAd-GFPを1.3×109お よ び1.3×108 PFU投 与 に お い て は24時 間 以 内 に 高 ∼ 中 程 度 のGFP の 蛍 光 が 観 察 さ れ た.1.3×107お よ び1.3×106PFU 投 与 に お い て は1週 間 経 過 して もGFPの 蛍 光 は観 察 さ れ な か っ た.し た が っ てAd-GFP108PFUが マ ウ ス 正 常 組 織 に お い てGFP発 現 の 認 め ら れ る最 低 投 与 量 と判 明 し た(図4). 4.in vivoに お け る 皮 下 ヒ ト腫 瘍 の 選 択 的 可 視 化 マ ウ ス 皮 下 正 常 部 にAd-GFPを8×105PFU/25μl にOBP-301を8×106PFU/25μl加 え た も の を投 与 し た 群 で は7日 間 観 察 し て もGFPの 蛍 光 発 現 は 観 察 で き な か っ た(図5A).マ ウ ス 皮 下 にSW620を 投 与 し て 形 成 し た 腫 瘍 にAd-GFPを8×105PFU/50μl単 独 腫 瘍 内 投 与 した 群 で もGFPの 発 現 は 観 察 さ れ な か っ た(図5B).マ ウ ス 皮 下 にSW620お よ びA549を 投 与 して 形 成 し た 腫 瘍 にAd-GFPを8×105PFU/25μl にOBP-301を8×106PFU/25μl加 え た も の を 腫 瘍 内 投 与 し た 群 で は24時 間 以 内 に 腫 瘍 に お い て の みGFP 蛍 光 の 発 現 を 観 測 で き た.3日 か ら7日 後 に か け て 強 いGFPの 発 現 を 認 め14日 ま で に は バ ッ ク グ ラ ン ドの 蛍 光 と 同 レベ ル に ま で 減 弱 し た(図6). 5.in vivoに お け る ヒ ト癌 細 胞 の 胸 膜 播 種 の 選 択 的 可 視 化 以 前A549に よ る 胸 膜 播 種 モ デ ル を 作 成 し た15). A549に よ る 胸 膜 播 種 モ デ ル に4×107PFU/50μlの Ad-GFPと4×107PFU/50μlのOBP-301を 胸 腔 内 投 与 し た.胸 骨 正 中 切 開 を 行 い 観 察 した.臓 側 胸 膜, 壁 側 胸 膜,横 隔 膜 面,縦 隔 の 播 種 像 が 蛍 光 と し て 観 察 さ れ た.こ れ は組 織 学 的 に 癌 の 位 置 と 一 致 し た(図7). 考 察 遺 伝 子 に 基 づ い た 治 療 に は さ ま ざ ま な も の が あ る16-19).わ れ わ れ は 以 前 テ ロ メ ラ ー ゼ 陽 性 細 胞 で の み 選 択 的 に 増 殖 で き る ア デ ノ ウ イ ル スOBP-301に つ い て 報 告 し た11).今 回OBP-301にGFPを 発 現 す る replication-deficientア デ ノ ウ イ ル ス を 組 み 合 わ せ て 生 体 で の 癌 の 可 視 化 を 行 っ た.Ad-OFPは 通 常 は細 胞 内 に お い て 増 殖 で き な い がE1蛋 白 存 在 下 で は 増 殖 SW620 WI38 A549 NHLF H1299 HUVEC
図3 ヒ ト培 養 細 胞 で のAd-OFP 0.1 MOIの 単 独 感 染 とAd-OFP 0.1 MOIとOBP-301 1.0 MOIと の 共 感 染 を比 較 し た もの で あ る.感 染 後24時 間 後 蛍 光 顕 微 鏡 を 用 い て 撮 影 し た.(×200)
図4 様 々 な 濃 度 のAd-GFPを 単 独 皮 下 注 し た も の を 体 外 よ り イ メ ー ジ ン グ し た.腫 瘍 の な い ヌ ー ドマ ウ ス の 皮 下 に1.3×106,1.3 ×107,1.3×108,1.3×109PFUのAd-GFPを 注 入24時 間 後CCDカ メ ラ を 用 い て 非 侵 襲 的 に 撮 影 し た. A B 図5 (A)Ad-GFP 8×105PFUとOBP-301 8×106を ヌ ー ドマ ウ ス 皮 下 に注 入 し24時 間 後 撮 影 し た もの で あ る.GFPの 発 現 は観 察 で き な い.(B)SW620(5×106/個 体)を ヌ ー ドマ ウ ス 背 部 皮 下 に 移 植 し3週 後 形 成 し た腫 瘍 内 にAd-GFP 8×105PFUを 単 独 注 入 した.1週 間 観 察 し た がGFPの 発 現 は観 察 さ れ な い.
GFP遺 伝 子 の 増 幅 に よ る 腫 瘍 の 可 視 化:梅 岡 達 生,他9名
図6 SW620(5×106/個 体)お よ びA549(5×106/個 体)を ヌ ー ド マ ウ ス 背 部 皮 下 に 移 植 し,3週 後 形 成 し た 腫 瘍 内 にAd-GFP 8×105PFUとOBP-301 8×106PFUを 注 入 し た あ と の 時 間 経 過 で あ る.1週 間 後 ま で はGFPの 発 現 を 観 察 で き る.
図7 A549/5×106/個 体)を 胸 腔 内 投 与 し て 作 成 し た 胸 膜 播 種 モ デ ル に4×107PFU/50μlのAd-GFPと4×107PFU/50μlの OBP-301を 胸 腔 内 投 与 し た.5日 後 観 察 し た.癌 細 胞 に 一 致 し てGFPの 発 現 を 観 察 で き た.(×100)
で き る.テ ロ メ ラ ー ゼ 陽 性 細 胞 内 でOBP-301の 生 成 す るE1蛋 白 存 在 下 で は 増 殖 す る こ と が で き る.in vitroに お い てAd-GFPは 高 濃 度 で あ れ ば 強 いGFP 発 現 を 認 め る が1MOI以 下 で は 十 分 な 発 現 を 認 め な い.0.1MOIのAd-GFPと1MOIのOBP-301を 感 染 さ せ る こ と に よ り正 常 細 胞 で はGFPの 発 現 を 認 め ず,癌 細 胞 で の みGFPの 発 現 を 認 め た.同 様 にin vivoに お い て は107PFUをsuboptimal doseと し た.
マ ウ ス 皮 下 正 常 部 にAd-GFPを8×105PFU/25μlに OBP-301を8×106PFU/25μl加 え た も の を 投 与 し た 群 で はGFPの 蛍 光 発 現 は 観 察 で き な か っ た.マ ウ ス 皮 下 にSW620お よ びA549を 投 与 し て 形 成 し た 腫 瘍 に Ad-GFPを8×105PFU/25μlにOBP-301を8×106 PFU/25μl加 え た も の を腫 瘍 内 投 与 し た 群 で は24時 間 以 内 に 腫 瘍 に お い て の みGFP蛍 光 の 発 現 を 観 測 で き た.GFPの 発 現 は 不 均 一 で あ っ た が こ れ は ア デ ノ ウ イ ル ス が 腫 瘍 内 で は均 等 に 広 が ら な い こ と に起 因 す る と思 わ れ た.同 様 の 手 法 でA549に よ る マ ウ ス 胸 膜 播 種 の 選 択 的 可 視 化 を 行 っ た.こ れ はOBP-301とAd-GFPの 共 感 染 に よ る 可 視 化 と以 前 わ れ わ れ の 報 告 し た ア デ ノ ウ イ ル ス の 胸 腔 内 投 与 に よ り胸 腔 内 全 体 に ア デ ノ ウ イ ル ス が 取 り込 ま れ る と い う こ と を 組 み 合 わ せ た も の で あ る.胸 膜 播 種 の 治 療 に 新 しい 可 能 性 を生 む も の と思 わ れ る. 結 論 2つ の ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ーOBP-301とAd-GFPを 用 い て,癌 を特 異 的 に,非 侵 襲 的 に 検 出 し, 可 視 化 す る こ とが で き た.そ して ヌ ー ドマ ウ ス に お い て ヒ ト非 小 細 胞 肺 癌 の 胸 膜 播 種 巣 を特 異 的 に 可 視 化 す る こ と に 成 功 し た. 文 献
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