ミツバチ花粉の抗酸化作用　―他のミツバチ生産物との比較―

ミツバチ科学25(3):113-118 HoneybeeScience(2004)

ミツバチ花粉の抗酸化作用

一他のミツバチ生産物 との比較一

池野 久美子 ･柿本 佳名子 ･中村 正 ･

池野 武行 ･篠原 力雄

ミツバチ生産物 として知 られるハチミツ,ロ ーヤルゼ リー,プロポリスおよび花粉は,それ ぞれ様々な機能を有 し(Burdock,1998;Molan, 2002,Stangaciu,2002;SimuthandBilikova,

2004),古 くか ら利用されている.ハチミツ, ローヤルゼリー,プロポ リスについては比較的 よく研究されているが,花粉に関する報告はそ れほど多 くない. ミツバチが集めた花粉 (ミツバチ花粉)は, タンパク質,特に遊離アミノ酸を豊富に含み, 炭水化物,脂質をはじめ,ビタミン,ミネラル も多く含まれる (遡後 ら,1986;Camposeta

l

リ

1996).栄養成分が豊富に含まれることから家 畜や実験動物の生育に及ぼす影響が検討され 体重増加や成長促進が報告されている(石黒 ら, 1964).また,健康食品 として,栄養補給,負 欲増進,疲労回復に利用されている.花粉を摂 食 した際の機能については,ミツバチ花粉の利 用 としてまとめ られている (Donadieu,1983; 松香,1991).そのうち,前立腺炎や前立腺肥 大に対する効果は,い くつかの詳細な報告がな されている (Yasumotoetall,1995;Camposet alリ1996,浅川 ら,2001,Shoskes,2002).莱 験的に性ホルモン誘発非細菌性の前立腺炎モデ ルを用いて,花粉エキスの炎症性サイ トカイン に対する作用が検討された.その結果,炎症性 サイ トカイン,特にインターロイキンー6およ び腫癌壊死因子 (TNF-α)の増加が抑制され, 抗炎症作用を示す一つの作用機序 と推定 してい る (浅川 ら,2001).抗菌作用や抗酸化作用が あるとい う報告 もある (Camposet.a1.,1996: Dudoveta1.,1994). ミツバチ花粉には微量成分 として,フラボ ノイ ド頬やフェノール化合物が含 まれている (Camposeta1.,1996:SerraBonvehi,2001). ミツバチ生産物の中でも,プロポ リスにはフラ ボノイ ド頬をは じめ多 くのポ リフェノール等 が含 まれ (Greenawayeta1.,1990;Tazawaet a1,,1998;Bankovaeta1.,2000,熊滞ら,2001: Popovaeta1.,2003),強力な抗酸化作用を有す る(Schellereta1.,1990;Yamauchieta1.,1992: Matsushigeeta1.,1995,1996:Banskotaeta

1

.

.

2000:Morenoeta1.,2000;熊揮ら,2001).ま た,ローヤルゼ リーにも抗酸化作用があ り (桑 原 ら,1996),ローヤルゼ リーの抗ス トレス 作用 との関わ りが示唆 されている (鷲塚 ら, 1996;池田ら,1996).さらに,ハチミツの抗 酸化作用についても報告 されている (Gheldof eta1.,2002). そこで今回,著者 らは,ミツバチ花粉の作用 の一つ として抗酸化作用について検討 し,他の ミツバチ生産物,ハチ ミツ.ローヤルゼ リー, プロポリスと比較 した.これまでこうしたミツ バチ生産物の抗酸化活性は,それぞれ測定方法 や試料により異な り,統一的に理解 しにくい現 状であったので,花粉の抗酸化作用を測定 した 方法と全 く同 じように調製 し,同じ測定方法を 用いて検討 した. 材料および方法 試料の調製 ミツバチ花粉は産地や地域の異なる5検体 (1.スペイン産,2.台湾産,3.中国産①,4.中 国産②,5中国産③)を100g秤取 し,80% エタノールで 3回抽出 し (15mLずつ,各 lo 分),それぞれ遠心分離 した上清を合わせて

114 50.0mLに定容 し言式料 とした. プロポ リスは産地の異なる3検体 (1.ブラジ ル産 (ミナス -ジェライス州),2.中国産,3. ニ ュージーラ ン ド産)を 1,00g用いて,花粉 と同様に調製 し試料 とした. ローヤルゼ リーは中国のそれぞれ異なった地 域 で採取 した 3検体 (中国産①∼(ラ)を 5.00

g

秤取 し,上記材料 と同様 に調製 した. ハチ ミツは中国産 で,蜜 源の異 な る3検体 (1.ソバ,2.アカシア,3.レンゲ)を 5.00g秤 取 し,同様に調製 した. 抗酸化作用の測定法 抗酸化作用の測定は,DPPH (1十 di phenyト2-picrylhydrazyl)ラジカル補足活性を吸光光度法 で評価 した (篠原 ら,2000).すなわち,各試 料溶液 2.5mLに,0.5mmol/LDPPHエタノー ル溶液 05mLを加 え,室温 に 30分 間放置 し た後,520nm の吸光度を測定 した.対照 とし て,言式料 の代 わ りに溶媒 のみ (80%エ タノー ル)を添加 し,対照の吸光度か ら試料の吸光度 を減 じて,対照の吸光度 に対す る割合 を求め, DPPHラジカル補足活性 とした. グラフか ら 50%の DPPH ラジカル捕捉活性 を示す濃度 (EC50)を算 出 した.標準 として, カフェ酸を用いて同様の評価を した. 過酸化脂質生成抑制効果の測定は, リノ レン 醍 (5mg/mL)を 0.2mL採取 し,上記方法で 調製 した各試料 の希釈液 に加 えて撹拝 し, ろ 紙 に全量を塗沫 した.70℃で 90分加熱 し,坐 成 した過酸化脂質 を

F

e

3

十

一

T

B

A

法 によ り測定 し た.すなわち,ろ紙を細切 し,エ タノール 5.0 mLで抽 出 した.その抽 出液 に精製水 を加 え, 1… ol/L塩化第二鉄30mLおよび

T

B

A(

チオ バル ビツール酸)試薬

1

.

0

mLを添加混合 した 後, 100℃で 90分加熱 した.冷封後,∩-ブタ ノール 4.0mLを加 えて振盗抽 出 し,遠心分離 した上層を採取 し,励起波長 515nm,蛍光波 長 553nm で蛍光強度 を測 定 した.標 準 と し て,テ トラエ トキシプロパ ン (5nmol/mL)を 用 い,生 じたマ ロンジアル デ ヒ ド量 で表 した

(ShinoharaeLa1.,1991).

0 0 0

0

0 5 4 3

2

1 ( % ) 単 瀬 叫 揮 Ar E f

{･t卜

H

d d 凸 0 1 2 3 *71# (pg/mL) 図 1 カフェ酸のDPPHラジカル捕捉活性 フラボノイ ド量の測定 80%エ タノー ル 4.3mLに試 料 の希 釈 液 を 0.5mL加 え, 1mol/L酢酸 カ リウム 0.1mLお よび 10%硝酸アル ミニウム 01mLを加えてよ く撹拝 し,室温 に 40分放 置後,415nm で吸 光度 を測定 した.標準 としてケルセチ ン 0.05 mg/mLを用いて同様 に操作 し算出 した. 結果および考察 抗酸化作用を表す方法 として,DPPHラジカ ル補足活性を測定 した.標準 としてカフェ酸を 用 いた結果 を図 1に表 した.直線性 を示す グ 表1DPPHラジカル捕捉活性 DPPHラジカル捕捉活性 (EC50) 花粉 1 スペイン産 2台湾産 3中国産(ら 4中国産(参 5中国産③ プロポリス 1 ブラジル産 2中国産 3ニュージーランド産 ローヤルゼリー 1 中国産(ら 2中国産(参 3中国産③ ハチ ミツ 1 中国産ソバ蜜 2中国産アカシア蜜 3 中国産レンゲ蜜 0.708±0.063 0691±0.036 0.207±0.002 1.602

±

0.067 1042±0028 0.032±0006 0.034

±

0.008 0.018

±

0.003 78.4±3.38 79.1±2.57 66.2±3.96 14.7±5.46 3160± 139.1 140.6

±

33.5 (単位はmg/mL ∩-3)

0 0 0 8 6 4 ( %

)

封 鯉 叫 轄 4 ( Q E

{･

小 H d d Q 1 10 100 1000 10000 100000帽/mL 図2 ミツバチ生産物のDPPHラジカル捕捉活性 ラフより求めたEC50は 331帽/mLであった･ 花粉および他の ミツバチ生産物のDPPHラ ジカル捕捉活性を測定 した.EC50を求め,表 1に示 した.花粉はかな り強い活性を示 し,他 のミツバチ生産物 と比較すると,プロポリスよ りは低かったが,ローヤルゼ リーよ り 100倍 ほど高い活性を示 した.ミツバチ生産物の中で は,プロポリスが一番高い活性を有 し,花粉が 続いた.ハチミツでは,アカシアや レンゲ蜜は, ほとんど活性を示さなかったが,ソバ蜜はロー ヤルゼ リーよりも強い活性を示 した. 花粉のDPPHラジカル捕捉活性が他の ミツ バチ生産物に比べ どの程度かをわか りやす くす るため,DPPHラジカル捕捉活性を図示 した (図 2).プロポ リスは産地間で大きな差は認め ら れなかったが,ニュージーラン ド産が最も活性 が高かった.花粉ではスペイン産 と台湾産は同 じくらいであったが,中国産(∋は一番活性が高 く,逆に中国産②および③は活性が低かった. プロポリスは花粉の10倍以上活性が高かった. 花粉に比べ,ソバ蜜は 10倍以上低 く,ローヤ ルゼ リーはさらに 10倍近 く低かった.図示す ることによ り, ミツバチ生産物問のDPPHラ ジカル捕捉活性のオーダーの違いが明らかにな った. 抗酸化作用のもう一つの効果 として,過酸化 脂質生成抑制効果を検討 し,その結果を表

2

に 示 した.花粉は比較的高い過酸化脂質生成抑制 効果を示 し,産地間の差はそれほど明らかでは なかったが,中国産①が一番高かった.プロポ リスの添加では,過酸化脂質生成量が最も少な く,非常に高い過酸化脂質生成抑制効果を示 し た.ブラジル産,中国産,ニュージーラン ド産 のいずれの産地のプロポ リスも高かった.用量 を変えて調べた結果 (図 3),ニュージーラン ド産がやや高い効果を示 した.花粉やプロポリ スには過酸化脂質生成抑制効果があることが判 明 し,DPPHラジカル捕捉活性 と一致 していた. ローヤルゼ リーおよびハチミツではそれほどの 効果は得 られなかった.DPPHラジカル捕捉活 性については,他のハチ ミツに比べ,ソバ蜜が 高い活性を示 したが (図 2),過酸化脂質生成

116 表2 過酸化脂質生成抑制効果 被検体 添加量 過酸化脂質生成量 生成抑制率 nmol/mL % 対照 花粉 1 スペイン産 2 台湾産 3 中国産(丑 4 中国産(参 5 中国産(診 プロポリス 1 ブラジル産 2 中国産 3 ニュージーランド産 ローヤルゼリー 1 中国産① 2 中国産(参 3 中国産③ ハチミツ 1 中国産ソバ蜜 2 中国産アカシア蜜 3 中国産レンゲ蜜 100日g 100pg lOO帽 100帽 100ト唱 74.97 7 7 7 1 6 0 9 0 8 5 0 9 1 3 3 3 2 2 3 3 9 2 0 0 4 8 0 9 9 2 9 0 L 4 5 5 6 7 5 5 10ト唱 2･78 9629 10Pg 7･86 89152 10Llg 4･95 93･40 500Hg 5482 2688 500Llg 6016 19･75 500ト唱 5869 2172 500pg 59･99 19･98 500pg 65･12 13･14 500u2 60.56 1922 抑制効果についてはいずれのハチミツもその効 果は低 く,蜜源による差はほ とん ど見 られなか った.ソバ蜜はレンゲ蜜 と余 り変わらなかった (表 2). プロポ リスには,フェノール酸類や フラボ ノイ ド類な ど多 くのポ リフェノールが含 まれ, 強 い抗酸化作用を有す ることか ら,それぞれ の フラボノイ ド量を測定 した (表3).花粉の フ ラ ボ ノイ ド量 は 0.5- 3.5mg/冒 (0. 05-0.35%)であったが,プロポ リスはどの産地の もので も 25mg/g原塊 (2.5%)以上 を示 し, 花粉の約 10倍以上であった.ローヤルゼ リー やハチミツでは測定できなかった. 今 回,抗 酸化作 用 を測定 す る方法 と して,

DP

P

H

ラジカル捕捉活性 と過酸化脂質生成抑制 効果について検討 したが

,DP

P

H

ラジカル捕捉 活性が強いプロポ リスおよび花粉に過酸化脂質 生成抑制効果が見 られ フラボノイ ド量も測定 された.すなわち,プロポ リスには強力な抗酸 化作用があ り,花粉にも強い抗酸化作用が認め られた.また,フラボノイ ド量 とも関連がある ように思われた. SerraBonvehietal.(2001)は,スペイン産の ミツバチ花粉 (11検体) に含まれるポ リフェ ノール化合物やフラボノイ ド類を調べ,比色定 量法 による総 フラボノイ ド量 は 0.51±0.16% であ り,また,グラジェン ト逆相

HP

L

C

によ り 15個の化合物を分離 し,その うち 13個を同 定 した.主にルチン (29.00±798mg%),ケル セチ ン (6.60

±

1.96mg%), ミリセチ ン (3.34

±

3.76mg%),ケンフェロール,桂皮酸

,p

-

クマ 0 0 0 0 8 6 4 2 (% ) 浄 蚕 豆 唱 胡 鮮 碧 q r 潜 禦

0

2 4 6 8 10 プロポリス (pg) 図3 プロポリスの過酸化脂質生成抑制

表3 フラボノイド量 被検体 フラボノイド塁 花粉 1スペイン産 2台湾産 3中国産(ラ 4中国産(∋ 5中国産(参 3.13± 0.04 058

±

002 2.47

±

007 353

±

0.14 0.58± 0.01 プロポリス 1ブラジル産 32.3

±

1.05 2中国産 30.9

±

2.55 3ニュージーランド産 27.6

±

1.06 (単位 はmg/g,∩-3) ル酸などを含むと報告 した.特にルチンが非常 に多 く含まれていた.これ らのフラボノイ ドは プロポ リス中にも含 まれる成分で, こうした 成分が主に抗酸化作用を示すものと思われる. 今回測定 したスペイ ン産の花粉中のフラボノ イ ド量は0.313±0.004%で,SerraBonvehiet al.(2001)の値 と比較的よく似ていた. ハチミツ中には花由来の花粉が含まれ,ソバ 蜜にはルチ ンが多 く含 まれている,ハチ ミツ の中で,ソバ蜜にDPPHラジカル捕捉活性が 認め られたのはそのため と思われる.Gheldof etal.(2002)ち,い くつかの蜜源か ら得たハチ ミツの抗酸化作用 とフェノール総量が相関関 係にあること,また,色の暗いハチミツ,たと えばソバ蜜には高い抗酸化作用があることを 報告 してお り,今回のデータとよく合致する. Camposetal.(2003)によると, ミツバチ 花粉のフ リーラジカル消去活性は,花粉に含 まれるフラボノイ ド頬やフェノール酸誘導体 に影響されるが,それだけによるものでない. また,花粉のフリーラジカル消去活性は,高 いラジカル消去活性を有する花粉 (ユーカリ) では,新鮮な花粉ほど活性が高 く,その後経年 的に減少 し, 3年以上経過すると50%まで活 性が減少すると報告 している.今回実施 した花 粉は,スペイン産がワイル ドフラワー,台湾産 はお茶,中国産(丑はナタネ,と花の種類が異な っていた,中国産①は活性が高 く,スペイン産, 台湾産 も比較的高い活性を示 したが,中国産 (参および(参は活性が低かった.使用 した花粉 の花粉採取後の時間的経過は明 らかでないが, 今後,経年的な変化についても検討を要すると 思われる.花粉の種類,採取時期,保存期間と 抗酸化作用の関係についてさらに検討する必要 がある. ミツバチ生産物の中で,プロポリスが一番高 いフリーラジカル消去活性を示 したが,プロポ リスの抗酸化作用については報告も多 く,熊滞 ら (2001)は産地別プロポ リスの総ポ リフェ ノール含量 とDPPHラジカル捕捉活性を調べ, おおむね相関があると報告 している.抗酸化作 用を示す成分 としてポ リフェノールだけでな く,Matsushigeetal.(1996)は,ブラジル産プ ロポリスから分離 したジカフェオイルキニン酸 誘導体が,強力なフリーラジカル消去活性を示 したと報告 している｡ 花粉をはじめ､プロポ リスやローヤルゼ リー などに抗酸化作用を示す報告があるが,それぞ れ異なった方法でなされている.今回,花粉の 抗酸化作用がどの程度なのかを調べたが,かな り高い抗酸化作用を示 し,全 く同じ方法で他の ミツバチ生産物,プロポ リス,ローヤルゼ リー, ハチ ミツについて も同様にDPPHラジカル捕 捉活性および過酸化脂質生成抑制効果を検討 し た.その結果,一番強力な抗酸化作用を示 した のはプロポリスで,花粉がそれに続いて強い活 性を有 し,ローヤルゼリーやハチミツの抗酸化 作用はそれほど強 くなかった.ハチミツの中で は,ソバ蜜がやや強いDPPHラジカル消去活 性を有 した. (〒500-8471岐阜 市 加 納 富 士 町1-2日本養蜂株式 会社 (池野久,柿木,中村),〒 491-0938一宮市日 光町 6-宮女子短期大学生活文化学科 (池野武), 〒 468-8503名古屋市天 白区八事 山150名城大学薬 学部臨床化学教室 (篠原)) 引用文献 浅川清司 ･商連信代 ･佐藤 茂 ･本間雅人 ･波方庄平 ･ 石井誠 ･安本亮二 ･西阪誠泰 ･桝田周佳 ･岸本武利. 2001泌尿 紀要47:459-465

Bankova

,

V

,S L DeCastroandM C.Marcucci 2000Apidologie313-15

Banskota,A H"Y･Tezuka,LK.Adnyana.K Midori -kawa,K Matsushige,D Message.A･A･G･Huertas andS Kadota 2000.J-Ethnopharmacol.72. 239-246

118

Burdock,C.A.1998.FoodChem.Toxico136･ 347-363.

Campos.M.C.,A.CunhaandK R.Markham.1996

IN BeeProducts(MizrahiandLenskyeds) PlenumPress.NewYorkpp.93-100.

Campos,M G･.R･F･Webby.K.氏 Markham,K,A. MitcheHandA PCunha･2003JAgricFood Chem 51(3)･742-745

Donadleu.Y.1983.INPolleninnaturaltherapeutics (MaloineS.A.ed.).LaFacultedeMedicine.Paris. Dudov,IA andN.FStarodub.1994.Ukr.B10khim.

Zh.66(6).94-96

越 後 多義 志 ･八 並一 恵 1986ミツバ チ科 学7(3): 97-100

Gheldof.N andN JEngeseth 2002･JAgrlCFood Chem 50(10)3050-3055 Greenaway

.

W

,T ScaysbrookandFR Whatley 1990.BeeWorld71(3):107-118. 池EEl勇五 ･豊壌 昌隆 ･古市浩康 ･福 田陽一 ･桑 原優. 1996ミツバチ科学17(3):103-110 石黒伊三雄 ･内藤純子 ･野口蕗子 ･青木 尚恵,1964 岐阜薬大紀要 13:31-34 桑原優 ･堀裕子 ･米田智幸 ･池田勇五.1996薬理 と 治療24(7):1463-1467 熊滞茂則･中山勉.2001ミツバチ科学22(廿 1-8 松香光 夫 1991.ミツバチ科学12(1)34-38 Matsushlge.Kr.LT･Kusumoto.Y Yamamoto.S

KadotaandT.Namba.1995∫.Trad.Med.12(汁

45-53.

Matsushlge.K,PBasnet.S･KadotaandT･Namba･ 1996J.TradMed 13(3)217-228.

Molan,P.C.2002ミツバチ科学23(4)153-160 Moreno,M.I.N..M Llsla.ARSampietroandM A･

Vattuone.2000.JEthnopharmaco171:109-1141 Popova,M.V Bankova,D.Butovska.V.Petkov,B.

Damyanova,A･GSabatini,CLMarcazzanandS･ Bogdanov.2003.ミツバチ科学24(2)61-66 ScheHer,S,TWHczok,S.lmielski.W Kro).JCabrys

andJ.Shani.1990.tnt.I.RadiatBio157(3) 46ト465.

SerraBonvehi.J.M STorrentoandE.C.Lorente

2001.∫.Agric.FoodChem 49･1848-1853

篠原和毅 ･鈴木建夫 ･上野川修 一.2000食品機能 研究法.光軌 東京.pp.218-220

Shinohara.R･.K･Tokunaga･,YOhta,T･UrataandI Ishiguro･1991Jpn･JClin･Chem 20:)8-23 Shoskes.D･A･2002･Urology6035-37･

SimuthJandKBilikova2004ミツバチ科学25(2)･

53-62.

Stangaciu,S.2002ミツバチ科学23(3)･97-104 Tazawa.S,T.Warashina,T.NoroandT.Mlyase,

1998.Chem.Pharm.Bull.46(9):1477-1479 Yamauchi.R,K.Kato,S.Oida.J.KanaedaandY.

Ueno.1992.Biosci.Biotech.Biochem.56(8): 132ト1322. Yasumoto.R･,H Kawanishi-T･TsuJino,M Tsujlta,N NishlSaka.AHoriiandT.KishlmOtO 1995Clini -cal.Therapeut17(i)182-87. 鷺塚 昌隆 ･古市浩康 ･泉順吉 ･吉長幸嗣 ･EEl中芳明 ･ 池EEl勇瓦 1996薬理と治療24(7)1469-1473.

KuMIKOIKENO日,KANAKOKAKIMOTOl).TADASHINAKA -MURA)).TAKEYUKIIKENO2).RIK10SHINOHARA3)Antioxi -dativeactivityofhoneybeepollen･Comparisonwith otherbeeproducts･HoneybeeScjence(2004)25(3) 113-118 1)JapanBeekeepingCo･,Ltd.112Kanof u-jicho.Cifu.50018471.2)DepartrnentofNutritional Science,IchinomiyaWomen●sJuniorCollege･6Nik -kocho,Ichinomlya,49ト0938,3)DepartmentoFClini -calChemistry,FacultyoFPharmacy,MeijoUniversityl

150Yagotoyama,Tenpaku,Nagoya.468-8503 Japan.

Antioxidativeactivitiesofhoneybeepollenwere assayedbyDPPHfreeradicalscavengingactivity andtheinhibitoryeffectontheFormationoflipid peroxidesHoneybeepoHenhadstrongantioxidative activity.TheseactivitiesoFotherbeeproductswel-e

alsoassayedlnthesamemethodPropollSWasOne ofthebestscavengerofDPPHFreeradicalamong beeproductsRoyaIJellyandhoneyhadallttle inhibitoryactivityorDPPHFreeradical,respec -tlVelyAntioxidativeactivityoFbuckwheathoneyis thehighestintheexaminedhoneys