陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー
― OPA 蛍光法によるポリアミン定量一―
川 崎 医 療 短 期 大 学 臨 床 検 査 科 川崎医科大学薬理学教室＊
永 瀬 澄 香 佐 藤 彰 一 ＊渡辺 悟 ＊ 斎 藤 泰 一
（平成
3
年8月2 6日 ）
Determination of Polyamines Using Cation‑exchange High‑Performance Liquid Chromatography with o‑phthalaldehyde Fluorescence Detection
Sumika N A GASE, Shoichi S A TO, Satoru WATANABE* and Taiichi SA ITO *
D
ゅa r t m e n to f M e d i c a l T e c h n o l o g y , K a w a s a k i C o l l e g e o f A l l i e d H e a l t h P r o f e s s i o n s
• D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y , Kawas a k i M e d i c a l S c h o o l K u r a s h i k i , Okayama 7 0 1 ‑ 0 1 , J a p a n
( R e c e i v e d on Aug . 26, 1 9 9 1 )
Key words : H PLC,
ボリ ミアン，P u t r e s c i n e ,Cada v e r i n e , Sperm i d i n e , S p e r min e
概 要
1 3
ポリミアン定罷は，悪性腫瘍の診断，転移の有無，予後の治癒およぴ治療効果の判定に有用であることが知ら れている。そこで我々は組織中ボリアミンの動態に箔目し，定屈を試みた。以前逆相
HPL C ‑ B e n z o y l
誘森体法 の問題点を減少させるための改良を行った。しかし，この方法は前処理が煩雑であるのみならず，感度およぴ粕
度にも問題があったので，今回1湯イオン交換樹脂を用いたH P L C‑OPA
蛍光法の検討を行った。ボリアミンの 各成分( P u t r e s c i n e , C a d a v e r i n e , S p e r m i d i n e , S p e r m i n e )
は，単一移動相で陽イオン交換樹脂カラムにより 分離後，0‑フタルアルデヒド( OP A )
誘迎体に変えて検出するボストカラム蛍光検出法で定磁した。分析時間は移動相のp
H
および流出容蜀等を検討した結果，約45分に短縮でき，各ピーク間の分離能も良好であった。測定 感度は従来行ってきたBe n z o y l
誘森体法に比べ約2 0
倍に向上した。また，各ボリアミンの最小検出批は1 5 pmo l
であった。標準液の直線性と同時再現性，日差再現性およぴ2
回繰り返し再現性の結果はすべて良好であ った。これらの結果はラット組織中のボリアミンの連続多検体測定が簡単に感度良〈行えることを明らかにした。は じ め に
ボリアミンは
1 6 7 8
年Lee u we n h o e r
が 人 の 精 液中に，S p e r m i n e
のりん 酸 塩 の 結 晶 と し て 顕 微 鏡 下 で 発 見 し た の が 最 初 で あ る 。 ポ リ ア ミ ン と は ， 第 一 級 ア ミ ノ 基 を2
つ 以 上 も つ 直 鎖 の 脂 肪 族炭化水素の総称であり，代表的なものにP u t r e s ‑ c i n e ( PUT ) , Cada v e r i n e ( CAD ) , S p e r m i d i n e
( SPD ) , S p e r m i n e ( SPM )
な ど が あ る 。 こ れ ら の ボ リ ア ミ ン は 細 胞 分 裂・
核 酸 生 合 成・
蛋白 生 合 成 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 明 ら か に な っ て き た 。 一 方， 1 9 7 1
年Ru s s e J 1 l 2 )
が 各 種 癌 患 者 に お い て，尿 中 ボ リ ア ミ ン 排 泄 撮 と 癌 増 殖 と の 関 連 性 を 報 告 し て 以 来 ， 悪 性 腫 瘍 の 有 効 な 診 断 方 法 と し て 注 目 さ れ て き た3)4)。 そ の 後 尿 中ポリアミンの増加 は 必 ず し も 癌 に 特異 的 で な1 4
永測澄香•佐藤彰ー・渡辺 悟 ・斎藤泰一いことがわかり，腫瘍マーカーとしての意義は 少なくなっている。
しかし，
P . S . Sunkara
らは1 9 8 2
年にルイス 肺癌を移殖したマウスにボリアミン生合成阻害 剤を投与したところ，腫瘍の増殖抑制とともに 肺への転移を強く抑制することを発見した叱こ の転移の抑制はボリアミンの添加により完全に 消失したために，癌の転移機構にもボリアミン が必須の働きをしていることが判明した。つま り，特定の臓器に作用するボリアミン生合成阻 害 剤 は 特定臓器に発生した癌の増殖と転移を抑 制すると考えられる。斎籐らはフェルラ酸がラ ット前立腺のポリアミン合成を特異的に抑制し たと報告している叫これらの臓器中のボリアミンを定量するには 濾紙電気泳動，薄層クロマトグラフィーおよび ガスクロマトグラフィー等が初期の段階で用い られたが，いずれも感度が低く， 複雑な前処理 を必要とした。以来多くの改良が重ねられ，最 近では高速液体クロマトグラフィー
( HPLC )
が 広く用いられるようになった。我々は
Ver k o e l e n
ら の逆相HPLC
による ポリアミンのB e n z o y l
誘焉体法を改良した8)0この改良点はポリアミンの誘蔚体合成の際に生 成し，
HPLC
測定に障害となる生成物を防ぐことであった。しかし，いまだにこの逆相法は移 動相と検出方法に多くの問題を有している。そ こで前処理時間の短縮と測定精度を上げる目的 で，陽イオン交換樹脂を用いた
HPLC ‑ OPA
蛍 光測定法9)を検討したので報告する。装 置 お よ び 試 薬
1 .
分析装置装置は，システムコントローラ
8 0 2 ‑ S C ,
オー トサンプラ8 5 1 ‑ A S ,
送液ホ゜ンプ8 8 0 ‑ P U ,
カラム オーブン8 6 0 ‑ CO,
蛍光検出器8 2 1 ‑ F P ,
およびイ ンテグレータ8 5 0 ‑ G I
から構成した日本分光高速 液体クロマトグラフを使用した。本実験に用い た流路構成をF i g .1
に示した。カラムは陽イオン交換樹脂である日本分光社 製の
POLY AM I NE PAK ( 0 . 6 c m I D x 3 . 5 c m L ,
充埴剤ースルホン化スチレン ・ジピニルベンゼ ン共重合体）を用い，温度は分 析中7 0
℃に保っ が‑O2 .
試 薬P u t r e s c i n e , Cadaver i n e , Sperm i d i n e , 1 , 6 ‑ D i a m i n o h exa n e , S p e r min e は S i gma ( S t . L o u i s . MO USA )
製のものを用いた。クエン酸 ニナトリウムニ水和物はアミノ酸分析用（半井 テスクK .K ) , OPA
は蛍光分析用 （半井テスH P LC ( J a p a n S p e c t r o s c o p i c C o . , L t d , T o k y o , J a p a n)
B u f f e r p u m p C o l u m n O v e n ( 8 6 0 ‑ C O )
9 9 9 9 9
r e
ーI
m o e r t t s n y o
sc
9 9 9 9
ヽ99
9 9 ,＇
i n t e g r a t o r ( 8 5 0 ‑ G I )
( 8 8 0 ‑ P U 2 ) :
・
‑ ・ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ 1 ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ・ ・ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ・ ・ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ・ ・ ・ ・ ‑ ・ ・ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑
M o b i l e p h a s e ( 8 0 2 ‑ S C ) I H I OP A r e a g e n t
F i g .
1F l o w d i a g r a m o f c a t i o n ‑ e x c h a n g e
HPLC.陽イオン交換
HPLC‑OP A
蛍光法によるポリアミン定量1 5
ク
K .K )
，他は和光純薬K .K
の特級 （生化学 用）を用いた。実 験
移動相と
OP A
試薬の調製は次に示すとおり である。移動相
( Buff e r ): 3 . 0 M
クエン酸ニナトリウ ムニ水和物， 凡0
を加えて1
￡にし，60
％過塩 素酸でpH
を調製した。反応相
( OP A
反応液）：ほう酸24 . 7 g ,水酸化
カリウム2 3 . 0 g , H , O 9 8 0m e , 1 0 % Br i g 3 5
水 溶液6. 0m e ,1 6 % OP A
エタノール溶液lOme ,
最 後に2
‑メルカプトエタノール2. 0
面を加えて調製した。
なお，移動相および反応液はミリポアフィル ター
( por es i z e O . 4 5 μ m )
で濾過後，20
分間 脱気したものをHPLCに用いた
。ラット組織中ボリアミン定量に用いた試料の 調製方法は
T a b l e .1
に示した。最終的に得ら れた水溶液は移動相で2
倍希釈し，ミリボアフ ィルターで濾過後，この溶液10
直をHPLC
に注 入した。結 果 お よ び 考 察
従来用いられた
B e n z o y l
誘導体法はポリアミ ンをB e n z o y l 化するため，水 溶 液相
に2 N
‑N aOH, b e n z o y l c h l o r i d eを
加え，一夜（約1 2
時間）60
℃で加温を要する。生成したben zoy l p o l y amine
はエーテル抽出をする。抽出 後 エ ーテルをdr y
応で除去し，残i査をメタノールに 溶解してHPLCに10μ1
注入する。この方法はT a b l e
1E x t r a c t p r o c e d u r e o f v a r i o u s t i s s u e s a n d o r g a n s o f r a t s .
OP A
蛍光法に比べて前処理が煩雑で非常に時間 を要するため，迅速で高い精度のポリアミン定 量には不向きである。また，従来の
HPLC( OP A)
法による方法は イオン交換モード，逆相分配モードであっても2
種または3
種の移動相を用いるグラジェント 溶離法を使用していた。これはPutre s c i n e , C a d aver i n e , S p e rmidin e , S p e rmin e
の分離を 単一移動相で行うとS p e rmin eが強く保持され
てしまうため，同時分析が難しくなることから 行われてきたものである。しかし，グラジェント溶離法を用いる場合は 一回分離後，分析系を初期の移動相まで完全に 置換し，平衡になるまで待たねばならないなど の時問すなわちエージングが必要となる。また，
移動相の置換が行なわれるため，試料禅入のタ イミングが一定しないことから，保持時間かず れてしまい定墨精度を悪くするなどの問題があ
v a r i o u s o r g a n s o f t h e r a t s
←
h o mo g e n i z a t i o n
(10% T CA 2
me)←
c e n t r i f u g a t i o n
2 5 0 0 r p m 1 5 m m
←
s u p e r n a t a n t s a r e was h e d b y d i e t h y l e t h e r
比0
l a y e r
I
←f i l l t r a t i o n b y o . 4 5 μm m i l l i p o r e f i l t e r 1 0
成o ft h e f i l t r a t e i s c h a r g e d t o t h e HPL C s y s t e m
った。
今回，我々が行った
HPLC‑OP A
蛍光法によ るポリアミン定最は単一組成の移動相で各成分 を良好に分離する方法，結晶析出を回避する法 としてプランジャー洗浄装置をボンプに取付け ること，pH
を調整する方法などの測定条件の検 討と併せて精度 ・再現性試験を行った。1)ポリアミンの検出
ボリアミンは紫外部，可視部領域に吸収がな
〈，自然蛍光もない。従って
HPLC
での検出は， 紫外部測定の場合ダビシル化， ダンシル化， ト シル化などの誘導体， また，蛍光測定の場合は フロレッサミン，OP A
などの誘導体が利用され る。我々は誘導体反応が容易で比較的簡単な自 動化システム（日本分光）で利用できるOP A
法を用いた。検出最適波長を知るため，ポリアミ ン標準液と反応試薬を混和し，蛍光スペクトル を見た。その結果，検出波長は励起波長
3 4 0nm,
蛍光波長45 0nm
が最適であることがわかった。 組 織中のボリアミンはカラム分離後，OP A‑
メ ルカプトエタノール反応試薬と反応させ，生ず る発蛍光体の蛍光量を検出し，クロマトグラム の面租をインテグレータにより計算し定量した。2 )移動相のp H
変化および流量の検討①
p H
の検討移動相における
p H
を5. 2‑ 6 . 2
まで変化させた1 6
永測澄香• 佐藤彰ー ・ 渡辺悟・斎藤泰一
ときの保持時間を
比較検討したところ，移動相pH が高
くなるほど保持時間が延長した ( F i g . 2 )
。しかし，
pH5.0
以下では移動相中に結晶を生じ測定が不可能となった
。以上のことから移動相の 分析に至適な p H は 5.2 5 . 4 であるこ
とが確認できた
。② 移動相流量の検討
移動相の pH を 5.2 とし
，移動相流量を変化 させ たときの保持時 間を検討した ( F i g .3 )
。流量を0 . 8 5me / min より大きくするとポンプに負荷がか かり， I . O r n e / min
以上にすることは機械的に不 可能であったか，流量が大きくなればなるほど ポ
リアミンは小さい保持時間で流出した
。各ポ リアミンのピークは流量が 0.6 5‑ 0 . 85 m e / min の 間で重ならず
，分析精度にも影咽しなかった。しか
し，0 . 8 5m e / min の場合，移動相と OPA
反応液
との混液に混濁を生じた。以上のことから移動相流量は 0 . s om e / min が適当であると考えら れた。
①および②の検討結果は移動相 pH 5 . 2 , 流鼠 o . s om e / min の分析条件が至適であることを示
した。 本条件下の HPLC では Putr esc i n e が 6 分 ， Spermidineが 1 6 分， 1 , 6‑Diaminoh ex an eが3 0 分， Spermine か約 4 1 分で流
出し
，一回約45 分で 分析 が可能となった ( F i g .4 )
。3 )
直 線 性各ポリアミン浪度 2 5 0pmol/ μ R 標準液は 1 0 ,2 0 , 3 0 , 5 0 , 1 0 0 , 2 0 0 , 2 5 0 pmol
／成に段階希釈を行い直線性を調べた
。ベースラインの乱れが生じない程度までインテグレータの感度を上げ，蛍
( m i n ) Spermine
60
1 , 6‑Diaminohexane
(1)
E 40
I
•一‑
S p e r m i d i n e
゜
2UO
!I Ua ta H
Put r e s e i n e
0 "5•0 5.5
Buffer pH
6•O
F i g .
2 Ar e l a t i o n between t h e r e t e n t i o n t i m e o f p o l y a m i n e a n d pH o f m o b i l e p h a s e b u f f e r . ( m i n )
60
゜
4O E
に
゜
2uo nu a1 a1 :1
Spermidine P u t r e s c i n e
0 0.65 0.75
Flow ‑ Volume O , B S ( m l / m i n )
F i g .
3 Ar e l a t i o n between t h e r e t e n t i o n t i m e o f p o l y a m i n e a n d f l o w ‑ v o l u m e ( m Q / m i n ) o f m o b i l e p h a s e b u f f e r .
陽 イ オ ン 交 換
HPLC‑OPA
蛍 光 法 に よ る ボ リ ア ミ ン 定 量1 7
Table 3 Simultaneous r e p r o d u c i b i l i t i e s o f a s t a n ‑ dard mixture and samp
leo f the thymus c a l c u l a t e d from peak area , and o f s e p a r ‑ at
ive t
ime f o r putrescine (P
UT) , sper
mid i n e (S
PD) , 1 , 6‑diaminohexane (DAH) and s p e r ‑ m
ine (SPM).
P o l y a r n 1 n
eP
UT S P D DA H SPM S t a n d a r d x
26 0 1 2 6 4 8 2 6 0 3 2 6 7 8
(n m o l / 1 0
成）SD 0
02590
0326 00 3 5 2 0 0 5 9 7
[n
= 6
)CV%
l0 0 0
I 229 I3 5 0 2 2 2 9 R a t T h y m u s X 0
2042 6 8 4 0
856 (n m o l / 1 0
成）SD 0 0 1 0 3 0 1
3380 0 4 2 8
[
n =
IO]CV%
50 8 2
49 8 7
50 0 1 S e p a r a t i v e X 6
801 6
8043 9 3 t i m e
(m i n
}SD 0 0 1 0 0 0 0 1 9 6 0 0 3 5 1
[
n =
20]CV% 0 4 1 7 0 1 1 7 0 0 8 0
T
a b l e 3 R e p r o d u c i b i l i t y o f d u p l i c a t e determination o f s i x t y samp
les from v a r i o u s t i s s u e s o f r a t s .
n
=6 0 P U T SP D SPM T a t a l PA X 0 0 6 4 3 1 3260 0 8 4 3 0 2 2333 S D X 0 0750 1 9 1 2 4 1 1 0 3 2 3 . 0 6 1 1 Y 0 0 6 5 7 1 3160 0 . 8 1 9 1 2 2007 S D Y 0 0780 l 8968 1 0441 2 9 9 3 4 r 0 9 8 3 0 0 9995 0 9 9 7 7 0 9 9 9 4
IA1 023 0 9 9 1 0 944 0 9 7 7 Y
=AX
xB 1 B
‑0
000 1 0 . 0 0 1 4 0 0 2 3 0 0 0 1 8 0 P o l y a min e c o n t e n t s
(n m o l
/m g
)光強度を拡大し検量線を作成した
( F i g .5)
。そ の 結果，Putr es cin e ,C a da ve rin e , S p e rmidin e , 1 , 6‑Diaminoh ex an e , Spermin e
の5
成分すべて が原点を通る良好な直線性を示した。 最小検 出 濃度はPutr es cin e
が1 p m o
l／成，S permidin e
が3pmol
／叫Spermine
か5 pmol ／
咸程度と 高 感 度 で あ っ た 。 分 析 に 必 要 な 標 準 液 の 最小量 はBen z o y l
誘導体法 で約5 0 nmol
であったが，今回の
OPA
法は約2 . 5n m o
lと約2 0
倍 感 度 か 高 い こ と が判明した。4 )
同時再現性および日差 再 現 性① 同時再現性
同時再現性をオートサンプラを用いて調べた 結果，
2 . 5nmo l / 10
成を標準液 (n = 6
)はC V : 0
.99 % ‑ 2 . 2 3
％となり，ラット胸線検体(n = 10
) はCV:4 .99 % ‑5 . 0 8
％であり，測 定 精 度 は 良 好 なことがわかった。I
a a ， ＇
I＇ ｝
i
＞、i ｀ i i ＂
II
゜ ＇
疇一
c :
a … ・ . . .Putrescine ．
b … … .Spermidine
C•
…
••• 1,6 ‑Diaminohexaned
….. .Spermine
b
゜ 20
Elution Time
Fi
g . 4 Comparison
between the present ( ‑ ‑ ‑ ) and p r e v i o u s (‑) a n a l y s i s f o r determination o f polyamines u s i n g cat
ion
‑exc
hange
HPLC w i t h o
‑pht
ha l a l d e h y d e fluorecence detec‑
t i o n .
( x 1 0 6 )
10卜 •···1,6
, 6 ‑Diaminohexane
□
・ ・ ・ C a d a v e r i
ne a‑ t
•···Spermidine△
‑ ‑ ‑
Putr e s c i
ne 悶 6ト・
・・・ Sper
mine
~
＜
c
4 0 60(min)
4
工e
ad 2
゜ 100 200 (
pmol /
pl)
C o n c e n t r a t i o n
Fi
g . 5 C a l i b r a t i o n curves f o r determination o f p o l y a m i n e s .
次 に 分 離 時 間 の 同 時 再 現 性 を 調 べ た 結 果，
2
.5 nmol / 10
凪 標 準 液 (n = 2 0
)はCV:0
.0 8 %
‑0.15 %
と な り 再現性 が 良 い こ と が わ か っ た (Tabl e . 2
)。② 日差 再 現 性
日差再現性
( n = 6
)はPutre s cin e
でC V : 6 . 0 2 % , C a da ve rin e
でC V : 4
.31 %, S per‑
midin e
で5.19 %, 1 , 6 ‑ Diaminoh e xane
で5 . 10
%, Spermin e
で6.92 %
となった。5 )
2回繰 り 返 し 測 定 の 再 現 性ラッ ト
Contro
l群 （体 重1 8 0 g
前後の7
週 齢1 8
永測澄香・佐藤彰ー・渡辺 悟・斎藤泰一▲SD
系雄ラットを使用）6
匹について，各組織中 ボリアミン( n = 6 0 )における 2
回繰り返し測 定の再現性は，満足すべき結果を示した(Table
3) 。
6 )
ラット組織中のポリアミン分析ラット組織試料禅入はオートサンプラを用い 昼夜間連続測定しても問題を呈しなかった。一 昼夜で約3
0
検体連続測定か可能であった。ボン プ ベソド自動洗浄装置 （日本分光k.k)を導入 することにより，結晶析出を回避することがで き，保守面での問題が解決され連続多検体測定 か十分可能となった。結 論
賜イオン交換樹脂
HPLC ‑OPA
蛍光法を用い てポリアミン定量の検討を行った結果，検出感 度は従来のBe n z o y l
誘禅体法に比べて2 0
倍高く，一回の分析時間は単一組成の移動相で約4
5
分に 短縮することができた。また，検爵線の直線性 および再現性は良好であり， ラット組織中のポリアミン分析に応用できる結果を得た。
これらの検討結果より，今回行った
HPLC‑
OPA
蛍光法は迅速で高感度なポリアミン分析法 であり，制癌剤などの薬物療法の有効性をみる モニターとして今後応用するのに十分有用であ ると考えられる。現在我々は，
5 ‑ F u ,Ar a C
の2
種類の制癌剤 およびフェルラ酸誘消体をラットに投与し，こ れらの薬剤がどのようにボリア ミン代謝に影響 を及ぼすか検討している。謝 辞
稿を終えるに当たり，本研究にご協力いただ いた臨床検査科第1
6
期生，米田有希，吉田清子，黒木あい子，山中牲子および福田寿美の各君に 深く感謝いたします。
文 献
1 ) R u s s e l l , D . H . : I n c r e a s e d po l yam me c o n c e n ‑ t r a t i o n s i n t h e u r i n e o f human c a n c e r p a t i e n t s Nature New B i o l . , 2 3 3 , 1 4 4 ‑1 4 5 , ( 1 9 7 1 ) 2 ) R u s s e l l , D . H . , e t a l . : U r i n a r y p o l y a m i n e s m
c a n c e r p a t i e n t s . Cancer R e s . , 3 1 , 1 5 5 5 ‑1 5 5 8 , ( 1 9 7 1 )
3 ) Abdel‑Monem, M. M. and O h n o , k . Polyamine metabolism I I I : U r i n a r y a c e t y l p o l y a m i n e s i n human c a n c e r . J . Pharm. S c i . , 6 7 , 1 6 7 1 ‑1 6 7 3 , ( 1 9 7 8 )
4)久保田俊一郎，他：腫瘍マーカーとしての尿中 ポリアミンの新しい簡便・迅速測定法．医学のあ ゆみ，
