本村一郎

Toxoplasma gondiiの生物学的研究

第1報 Toxoplasma gondiiの各種理化学的条件に対する 抵抗性に関する実験

本村一郎

Biological Studies on Toxoplasma gondii

I. Examination on the Resistance of Toxoplasma gondii to Physico‑Chemical Conditions

Ichiro MOTOMURA

Abstract

Not a few unknown problems are still left undissolved about the biological characters, life cycle and infection route of Toxoplasma gondii, although numbers of papers relating to the parasites have been published. It is really important to devote attention to the study on the survival ability of T. gondii under various physico‑chemical circumstances for the purpose of clarifying the infection route of this parasites.

Jacobs et al. (1960) reported that the cyst of Beverley strain survived as long as 68 days

at 4℃ but lost viability by heating to 50℃ for 30 minutes or 56℃ for 15 minutes. They

stated that freezing or desiccation rendered the cysts non‑infective. Similar results were reported by Fukazawa et al. (1964).

In this experiment, both of RH and Beverley strains of T. gondii were tested on their resistance to osmotic pressure, pH, temperature, desiccation and UV irradiation. Mice used for the inoculation test were of dd weighing 18 to 20g. RH proliferative forms were col‑

lected from the infected mice by aspirating the intraperitoneal exsudates with syringes.

The pooled exudate was centrifuged at 100 G for 5 minutes to remove the gross particles

熱帯医学 第9巻 第4号:201‑225頁, 1967年12月       201

長崎大学熱帯医学研究所疫学部(二f立▲任:中林敏夫教授) (昭和42年11月22日受付)

Department of Epidemiology, Institute for Tropical Medicine, Nagasaki University

(Director : Prof. Toshio NAKABAYAS日Ⅰ)

長崎大学熱帯医学研究所業績 第514号

and the supernatant was recentrifuged at 1500 G for 15 minutes to precipitate the par‑

asites which were subsequently resuspended in saline. The infected mouse brain emulsions were used as the cyst material. Both materials, the saline suspension of RH proliferative forms and the brain emulsion containing the Beverley cysts, were applied to an examination on the survival of T. gondii under some physico‑chemical conditions.

The presence of live Toxoplasma in the materials was examined by the intraperitoneal inoculation into healthy mice. When proliferative forms or cysts were detected in the peritoneal exudate or the brain of inoculated mice, it was concluded that the parasites inoculated had been still alive in the materials. Hemagglutination test was performed for inquiring whether the infection with the parasites inoculated was in progress.

Results obtained were concluded as follows:

1) The proliferative form could survive only within 1 minutes in distilled water. The cyst could survive for 9 days when it was suspended in distilled water together with mouse brain tissue. While, the cysts which were accumulated from the infected mouse brains were destroyed by incubating in distilled water for 16 hours.

2) Both the proliferative form and the cyst could survive for 15 hours in 6% NaCl solution but could not for 15 hours in 15% NaCl solution.

3) At pH 1.2, the proliferative form lost infectivity within 1 hour but the cyst kept it for 22 hours.

4) Both forms lost their viability by heating to 56℃ for 10 minutes. The Beverley cyst survived for 67 days at 2℃ in the refrigerating room of a slaughterhouse but the RH

proliferative form did for 11 days. Cysts in the mouse brains and proliferative forms in

the mouse livers were destroyed by freezing in a deep freezer of ‑14℃ for 3 hours.

5) Both forms lost their infectivity to mice by desiccation within 48 hours or by irradiation of UV rays for 5 minutes.

202       本  村  一  郎

は  じ  め  に Toxoplasma gondiiは1908年北アフリカにおいて

‑Nicolleと Manceaux によっててヤマアラシの一種

･Ctenoaactylus gondiから検出された病原性原虫で,以 来多くの研究者によって木原虫の自然界における感染 例が報告されてきた.現在,人やその他の哺乳類45種,

―鳥類70種及び5種の冷血動物に及ぶ広汎な感染スペク トルの広さから云っても極めて重要な人畜共通伝染病

｣の病原体である,

人トキソプラズマ症については,母体内感染の結果, 早,流産あるいは死産を原因したり,乳幼児期におい て,敗血症,肺炎,脳炎などの急性症のはか,脳水腫, 小頭症,運動機能あるいは精神発育障害などの慢件感

―染症を惹起することが知られている.また,成人にお いては,大部分が不顕性感染に終止するといわれてい 立6が,少数頻度に,網膜脈絡膜炎, I)ンパ節炎などの

病状を呈することが認められている.

このように公衆衛生上甚だ注目すべき疾病であるに も拘わらず,本原虫の生活史及び感染経路については, 先天性感染を除いて不明の点が多いのが現状である.

このためもあって,本症の予防や治療に関する対策に は,今後究明されるべき点がきわめて多い.かかる現 況にあっては,本原虫に関する基礎的研究は緊急を要 しかつ重要な知見を提出するものであると云えよう.

感染経路を解明するためには,原虫自身の性質とく に自然界における抵抗性と原虫の宿主に対する侵入門 戸に就いて十分な知識をもたなければならない.しか しながら,木原虫の抵抗性に関する研究は少く,不明 確な問題が多く残されている.

今般,著者は人のトキソプラズマ症の究明,とくに,

その自然感染経路探究の一環として, in vitroにおけ

Toxoplasma gcndiiの生物学的研究,第1報      205 る各種理化学的条件に対する本原虫の抵抗性について

検討を加えた･理化学的条件は日常実験室内で容易に 作製できるものについて実験を試みたが,紙面の都合 上第1報と第2報に区分して報告することにする･

本報においては,トキソプラズマ原虫が温度,疹透圧,

pHの変化'乾燥及び紫外線の照射等の影響に対して どの程度の抵抗性を保有しているかを調査した● また, 実験に使用した原虫は代表的な2株であるRH株と Beverley株を選び,南棟の抵抗性の差異を比較検討

した.

実験材料と実験方法

1｡供託原虫

実験に使用した Toxoplasma gondiiし以下Tpと略 す°は安定した感染力と整‑な成績を期待できるもの として広く使用されているRH強毒株(増殖型°及び Beverley弱毒株(Cyst型)の2株を選び,いずれも 大阪市立大学医学部医動物学教室より分与をうけたも ので,当研究室ではマウスへの継代接種により維持し てきた株である.

2.供託動物

実験に用いた動物は体重 '20｣の市販dd系マウ ス(熊本市内の業者より購入したもので, ddノKと呼称 している)である.供試マウスは実験室内感染を防止 するため,Tp感染マウスと隔離して,清潔な環境の飼 育室において1週間以上飼育して環境に馴致させた後, 実験に使用した.マウスはすべて固形飼料(日本クレ ア. CAー1 )と少量の水を与えて飼育し,飼育の温度 は年中  ‑26cCを保持して飼育条件を均一にした.

3･接種に用いた原虫浮浪液 A･ RH株(増殖型°

接種材料として用いたRn林Tp浮源液は次の様 にして作製した.

マウス5匹の腹腔内にRH株Tp (以下R上Ⅰと略す) を約10D万個体接種する･ RH感染マウスは通常4〜

5日を経過して死亡するが,死亡前の瀕死期にあるマ ウスの腹腔内に生理的食塩水を1cc注入して,これを 誘い水としてできるだけ多くの腹水を採取する.採取 した腹腔洗減液は100G (800rpm; 5分間遠心沈澱して, 腹腔内浸出細胞と組織の粗塊を除去し,さらに上清液 を1.500G (3,000rpm° 1D分間遠沈してTpを沈澱せ しめ'この沈漆にIQccの生理的食塩水を加えて均等な 浮源液とした.この原虫浮)軒干液にはペニシリンGカ リウム武田100U/cc及びストレプトマイシンジヒド ロ硫酸塩(明治) 10mmg/ccを添加して細菌の混合感 染によって惹起される実験成績の不整一による危険を 防止した.沸離原虫数は血球計算盤を用いて算定した.

B. Beverley株(Cyst型)

Beverley株Cyst浮清液の作製は次の如くである‑

あらかじめ, Beverley株Cyst (以下Bev. Cystと 略す) 2D個を1匹のマウスの腹腔に接種する･同様に

して接種した合計川匹のマウスは, 4‑5週間経過後 屠殺して,マウスの脳を無菌的に接取し,乳鉢内で磨 砕する･これに生理的食塩水をIQcc加えて,ピペット で充分に吸引圧出を繰返して均等なCyst懸濁液とし た･この懸濁液を2枚重ねの滅菌ガーゼで渡過して粗 塊を除去し, 65CGC 2,000 rpm) 10分間遠心沈澱する○

上清液を除き,沈漆に生理的食塩水5ccを注加してよ く混合し,その0･02ccをスライドガラス上に滴下し, 18×18 mmのカバーガラスを被覆して10×20倍率の 顕微鏡下で全視野のCyst数を算定した･同様の操作 を2回行ない,その平均値をCyst数とした.接種材 料中に細菌の汚染による実験成績の混乱を防止するた

めに,Bev.Cyst浮沸液には, RH浮済液と同様に,同 じ濃度のペニシ…･}ンとストレプトマイシンを添加した.■

接種材料の注射方法はすべて腹腔内注射に統一し, 注射液量も‑定にした.

4.原虫の生死判別方法

ある一定の理化学的条件に曝露された原虫の生死の 判別は,その被検材料を他の新しいマウスに接種して,‑

マウスが盛染するか否かおよびマウスからTpを検出 し得るか否かを換討して間接的に原虫の生死を推定す る方法を採用した｡

A･ RH株

RH株を用いた抵抗性検査においては,その被検 RH原虫浮ヽ腸液を接種したマウスが死亡または瀕死状 態にある時,直ちに開腹して腹水を調べ,多数のTp｡

を確認しTpによる感染死と認められた場合,感染成 立と判断した.

RH接種マウスが約50日を経過しても死亡しなかっ た賜･合,このマウスは脳背髄離断法によって屠殺し, 直ちに腹水及び脳を鏡検してTp存在の有無を調査し

た･また,同時にマウスの心血を採血用.給紙(東洋嘘

紙製)を用いて所定量を採血し,乾燥後,花木.信藤

の法に準拠してTp感作血球凝集反応(以下HAと崎

204       本 村 一 郎

す)を実施して,マウス血液中の抗体価を検定した.

HAの検査に用いたTp感作血球は化学及び血清療 法研究所作製のもので市販されている.

HA抗体価の検定基準は64倍以下を陰性(‑X 256倍 長陽性(+;, 1024倍を強陽性(+十)と定めた.

原虫の存在を認めず,抗体厭の上昇も見られない マウスは感染不成立と判断し,その接種材料中に含ま れていたRHは死滅していたものと推定される.

B･ Beverley抹

Bev･ Cystを使間した抵抗性検査においては,そ のCys十浮済液を接種したマウスは, 1ケ月後に脳背

髄離断法により屠殺して,マウスの腹水及び脳を調べ Cystの存在を認めたもの,または腹水中に多数の

Tpを認めたものを感染成立と判断した.

Bev･ Cystを多数(50個以上°接種したマウスは, 時により, 14日前後を経過して死亡することがある･

一この場合,死亡マウスの腹水中には多数のTp原虫 (増殖型)が認めなれることが多い.また,屠殺時,

マウスの心血を採血用折紙にとりIIA検査を実施し て抗体価を検定した.

Bev. Cys十 接種マウスの脳の検索は,採取した脳 の大脳皮質の小切片を2枚のスライドガラ▲スの間に挟 み,上下から強く圧迫して薄層を作り, 20×1o倍率の 弱拡大で鏡検し Cyst 存在の有無を検査した･この ような操作を繰返して,大脳の10個所から採取した 小切片についてCystの存在を綿密に調べ,全く認め ないものはCystなしと判断した.この方法によれば マウス月ヽ点'内Cystの検出は,ギムザ染色の必要もなく, 迅速かっ比較白勺正確に実施できた. Rn 及び Bev.

Cyst接種マウスのうち.マウスから原虫を検出でき ず,かつ, HA試験も陰性のものは感染不成立とした が, Tpの検出ができなくとも, HA試顔の結果,明 らかに高い抗体価が証明された場合には, Tp感染成 立と判断した.

実験方法の詳細は実験成績の各項目ごとに記載する こととする.

実  験  成  績

‑I.予備実験.供託するウマス(dd泉)のTpに対 する感受牲についての穐討

実験に使用するdd系マウスは,全くTpを保有せ ず,本原虫に対して均一な感受性を有するものでなけ ればならない.そこで,供試マウスのTpに対する 感受性を予備実験として検査した.

1.正常dd糸マウスからのTp検出

多数のマウスの中から体重6‑8g (生後9日), 15 '17g (生後2ケ月)及び25‑28g (生後ワケ月)の マウスを5匹ずつ選び,マウスを屠殺した後,生別勺 食塩水を用いた腹腰洗胎液と脳についてTp存在の有 無を検査した･また,同時に,マウス血液はHA試験

によって抗体価を検定した.

この結果,表1に示すようにdd系マウスの腹腰洗 瀬液中にはTpは全く認められず,脳内にもTpの cystと思われるものは認められなかった. HA試験 の結果,正常マウスのTp抗体価は陰性であった･こ れに反して,対照に用いたBev.Cystを1匹当り2じ個 接種した5匹のマウスは,脳内に多数のCystが認め られ,そのHA抗体価は5匹中2匹を検査した成績 では共に1024倍(強陽性)を示し,明らかに陽性であ った.また, RH原虫60万個体接種マウスにおいて は,注射後4〜5日を経て死亡したが,その腹水中に 無数のTpが認められた. Tp接種後5日目のマウス

のHA抗体価は5匹中2匹を検査した結果,いずれ も陰性であつた.

2. dd系マウスに対するRH株の最小感染数につい ての検討

この実験はマウスを感染せしめるに必要なRfI株 の最小虫体数を知る目的で行なった.

RH株原虫は生理的食塩水を用いて極めて高度に稀 釈し,滅菌したスライドガラス上に白金耳をもって5 個所に滴下して,そのまま弱拡大(2o×10倍率)で全 視野を鏡検し, 1滴内に存在する原虫数を算定した.

原虫数の多少によって適宜に稀釈した･所要の虫体数 が得られた場合,あらかじめ少量の生理食塩水を含ん だ注射器を用いて吸引した･吸引後のスラィドガラフ.

は再び鏡検して注射器内にTpが移行したことを確認 し,ペニシリンとストレプトマイシンを添加した生理 的食塩水をもって全量をl.3ccとして,マウスの腹 腔内に注射した.得られた成果は表2に示した.

RH株を1‑10個体接種したマウスはいずれも5匹 中2匹が感染死したが1匹は不感染のまま生残った.

しかしながらRH株を20個体以上接種したマウスは 5匹すべて感染死亡した･

3. ddマウスに対ずるBeverley株の最小感染数に ついての検討

RHの場合と同様に, Beverley株の最小感染数に

Toxoplasma gondiiの生物学的研究,第1報      205 表1.  トキソプラマズ原虫の検出と感作血球凝集反応による正常ddマウスにお

けるトキソプラズマ自然感染の検査

Table 1. Examination of normal dd mice for the spontaneous infection with Toxoplasma gondii by means of parasite isolation and hemagglu†ination test

No. of mice tested

5

°

s

bdぎgrてeight )Age

9 days 15･17      2 months 25･28      7 months

No. of mice detected T. gondii Prolif. form Cyst HA test***

0 o 0

o o 0

Controls

Control(l )鞍

20･25      5 months Control(2)**

20‑25      5 month?

>

^

¥

o

0

5    十十 1十

Notes;

Controls : Results of Tp detection and HA test on the mice inoculated with the parasites.

韻 Control (1) : Examination was done 5 days after inoculation with 10 × 105 prolif‑

erative forms

** Control (2) : Examination was done 37 days after inoculation with 120 cysts.

〓乎HA antibody titer was indicated by the signs as follows

> 1 : 64, negative reaction (‑) 1 … 64' doubtful positive (±) 1 : 256, positive reaction (+)

1 : 1024, positive reaction (廿)

表2.   腹腔内接程によりddマウスを感染させる必要なRH増殖型の最小数

Table 2. The minimum numterしf RH proliferative forms necessary to infect dd mice by intraperitoneal inoculation

No. of organisms

inoculated

No. of mice inoculated

≡/

Fate of mice inoculated

Detection of T. gondii prolif･ form Cyst

HA

1

.>

ヽ…

1o

20

30

40

1 7 3

1

?

3

1 }

3

1 J :)

1 2

.)

1 5

3

1 2 3

Notes :  砕 D ..

モ谷鞍 s … 鞍手モE.  .

D鞍(9)

D (9;

s鞘(2 S (29) D CH) D (10) D (S^

D (10) S (29) D (13) D (10) S (29) D (10) D (10) D(n;

D (9) D (10) D (9) D (10) D(ll) D(9)

串〓

9)

³

十 十 + 十

1十 +

+ 十 十 + + 1十 十 十

‑ト

Death of mice

Survival of mice

Numbers in parentheses give the survival days of mice

206      本  村  一  郎

表3･ 腹腔内接種によりddマウスを感染させるに必要なBeverley シストの最小数

Table 3. The minimum number of Beverley cysts necessary to infect dd mice by mtrapentoneal inoculation

No. of cysts inoculated

No. of mice inoculated

Fate of mice inoculated

Detection of T. gondii Prolif. form Cyst

1

3

5

10

20

6o

loo

1 7 3

1 7 J

1 7 3

1 7 .‑)

1 2 3

1 7

.>

1 2 :)

S (30J) S (30) S (303 S (30) S (30) S (30) S (30) s (3o;

D (30) S (30) S (30) S (30) S (30) D (19;

D (20) S (30) S (SCO D (26) D (21) S (30)

D CM; ^十

+ 十 ::

+ 十 十 十 .十 十 + 十 + 十 十 + 十 十 + 十 十

ついて検査した成績が,表5である･

この実験に用いたBev. Cystは感染 後約1ケ月を経過したマウスの脳乳剤 を生理的食塩水をもって極めて高度に 稀釈し,滅菌スライドガラス上に滴下 して,そまのま弱拡大で鏡検し, Cyst 数を算定したものである.接種材料作 製の方法は前項2のRH の場合と同 様であるが, Cystは大,小を除外して ほぼ中等大のものを接種材料とした.

実験の結果, Bev. Cystを1個接種し たマウスにおいても5匹すべて感染し, いずれも脳内に多数のCystが検出さ れた･

4. RH株を腹腔内に接種したマウス の死亡までの日数と虫体数との関係

RH株原虫接種マウスの死亡までの 日数と接種原虫数との関係を調べる目 的でこの実験を行なった･

実験に使用したマウスは体重20〜

25gのもので,注射方法は腹腔内注射である.接種材 料はRtIの原虫浮済液を生理的食塩水により10倍段

No･ of Parasites Inoculated

Lt

lO I‑      一      *

1o

6

1o

5

1o

4

1o

lO

2

1o

.■｡

≡.…

=………/……コ

=

…

=

Time to Deathv 1  2   3   4   5   6   7   8   9  10  in Day

図1. RH増殖型を腹腔内に接種したddマウスの死亡日数と 原虫数との相関関係･ 1接種群のマウスは10匹から成り, 図表は各群における平均値と95%信頼限界を示す･

Fig 1. Correlation between the number of Toxoplasma gondii and the time to death of mice incoulated, when RH proliferative forms were inoculated intra‑

peritoneallyto dd mice･ Ten mice consisted a group and 95% confidence limits were plotted for allmean

values.

階稀釈して作製したものである.

縦軸には接種虫体数を,横軸にマウスの死亡日数を

To.wplasma gondiiの｣/士物学的研究,第1報       207 とり,各群の接種マウス10匹総数70匹のマウスについ

て調べた結果,図1に示す如き成績が得られた.各群 マウスの死亡日数の平均値と5 %の水準における信轍 限界は統計学的に処理して算出したものである.

この図からもわかるように,接種原虫数が小さくな るにつれて,マウスの死亡までの目数はバラツキが大 きくなっている.この図は,また,接種材料中のRH l虫体数をマウスの死亡目数から推定することや'さら には, RH株のマウス継代間隔の調整にも役立つもの

と考えられる.

Ⅶ･各種の理化学的条件に対するTpの抵抗性につ いての検討

Tpの理化学的条件に対する抵抗性について検討す るため以下の実験を行なった.

1.蒸留水中におけるTpの生存期間

疹透圧の低い水中において, Tp原虫はどの程度の 聴抗力を保有しているかを知るために,感染マウスか ら採取したRH及びBev･ Cystを1.50QGIO分間遠 心沈澱し,上清を捨て,代りに滅菌蒸留水5ccずつを 加えてよく混和し' 5ぐCの冷蔵庫内におき,所定の 時間毎に取出してO.Sccをマウスの腹腔内に接種した.

接種原虫数はRH株が12×1D5個体, Bev. Cystが 560個である･その成績は表4及び表5に示した.

RHは蒸留水中において,わずか1分間でマウス に対する感染性を消失し原虫は死滅した.水と接触し

たRHは体が丸く膨満していることが顕微鏡下で観 察された･対照は生食水中に5D分間の接触においても マウスに対する感染性を維持していた.

これに対して Bev･ Cystは脳乳剤のまま蒸留水 と接触した場合9日目においてもCystは生残してい た.しかるに, Sucrose濃度勾配法を利用して脳乳剤 からCystを集積する方法(未発表Daね)により集 めたCystを蒸留水中に浮済させた場合, 1時間以内 にすでに原虫の感染能力に傷害が認められ, 16時間後 には完全に感染能力を失っていた･対照の生理的食塩 水中においた脳乳剤Cystは14日を経過しても,なお, 原虫の生存が確認された.

2.各種濃度の食壇水中におけるTpの生存期間 鯵透圧の低い水中においてRH株は極めて短時間 に死滅し, Bev. Cystは脳組織乳剤中に懸濁した状態 にある場合には,比較的長期間生存していることを観 察したがヽ,逆に高い湊透圧を有する食塩水中における Tpの抵抗性を検討するためにこの実験を行なった.

各種の濃度のNaCl溶液を作製し,前項目1と同 様に原虫を浮沸せしめ, 5｡Cの冷蔵庫内に所定時間 維持した後,マウスに接種した･その結果,表6及び 表7に示すような成績が得られた.接種原虫数はRH 株12×105個体, Bev.Cystが280個であった.

すなわち, RHは  NaCl水中において15時間, Bev･ Cystは % NaCl水中ーで15時間生存したが,

響a…le 4.慧sアfa三5｡…C3f思三宝琵乙｡r三l寸f｡繁a新/a‑i三三①f慧+氏,ト4t｡ storage in distilled

water at 5°C

Storage time (minutes)

1

°

Iー…

30

Control ln saline

30

[ 1 l l

】】

,

1弓 /

‑

No. of mice inoculated

Fate of mice inocul ated

Detection of T.gondii prolif･ form Cyst

1 1

3

1 2 3

1

^

〜■,

J

1 7

3

1 2 3

s s s S S s s s s s s S

D D I)

(30) (.30;

(30) (30) (3CO (30) (30) (30) (30) (30) (30) (3o;

(4) (5) (4)

HA

十

十

ト

208       本  村 一 郎

表5.   蒸留水(5°C)中におけるBeverleyシストの抵抗性

Taもle 5.  Infectivity of the Beverley cyst after storage in distilled water at 5cC

cyst in sus‑

pending fluid

Storage

hour

甲o. of mice Fateofmice

inoculated inocul ated

Detection of T prolif. form Cyst

HA

Cyst with mice brain tissue in (iistilled water

10 mm

16 hrs

1 day

2 day

3 day

9 day

1 7 3

1 7 3

1 2 3

1 } 3

1 7 3

1

^

3

S (30) S (30) D(ll) S (30) S (30) s (3o;

S (30) S (30) S (30) S (301 S (30J S (｡30) S (30) S (30) S (30;

S (303 S (30) S (30)

十

十 +

十 十 十 + 十 十 十 十

‑r + + 十

Isolated cyst in distilled water

Cyst with mice brain tissue in saline

l

10 mm

30 mm

1 hour

16 hrs･

1 day

1 day

3 day

9 day

14 day

1 2 3

1 7

3

1 7

､) 〜つ

1 7 3

1 7

3

1

?

3

1 7

3

1 7 . )

1 2 3

S (30) S (30) S (30) S (30)

s (二3o)

S (･30) S (30) S (30) S (303 S (30) S (303 S (30) S (30) s cso;

S (30}

D(11°

D (13) D (10) D(12) D(ll) D (21) D C16) D (20) D (23) D(13) D (13) s (30;

+ 十

‑ト 十 十

+

十 +

十

+ 十 十

sa

+ 十

十

Toxoplasma gondiiの生物学的研究,第1報      209 表6.   RH増殖型の生存に及ぼすNaCl濃度の効果

Table 6. Effect of NaCl solutions at various concentrations on viability of the RH proliferative form

% NaCl

o･5

1

.1

6

15

2o

Time of exp osure

No. of mice inoculated

Fate of mice inocul ated

Detection of T, gondii Prohf. form cyst

HA

3o mln･

1 7 3

1 2 tl

1 7 o

1 2 3

1 2

, )

1 7 3

D (7) I)し八) D r6;

D (7) D (7) D し6) D (8ノ D (7) D (8)･

D (9)

D UO

D (ll) D (8) S (30) D (ll) S (30) S (30) s し30)

0.85

3o

lull潮

1 2 3

o 5

1

3

6

15

m mrs

1 7

3

1 2 J

1 7 .1

1 2 3

1 7

,1

十 +

十 十 十 十 + 十 十 + 十 + 十 十

十卜

十

D し6) D (6) D (6)

十 十 +

+ 十 + 1ト 十 十 十 + +

+ 十

D (6°

D(7;

Dし7) D (9) D (7) D (9;

D (10) D clO) D (113

】

Control

o･85 ¹⁵

hrs.

1 7

,1

D (6) D (7) D C6) Note ; Examinations were made at ScC.

十 十 +

21D       本 村 一 郎 T草E7.

able7.Be Eff三erle'

ct｡悪道入｡1トs三｡繁tデ…しts及a宇ヽ)ァarョIaClj

｡usc繁ェ繁｡ョt末<iJ ra繁｡ns｡nviability｡fthe Beverleycyst

% NaCl

Time of exposure (hours)

No of mice inoculated

Fate of mice inoculated

Detection of 7. gondii Prohf form Cyst

o.5

1

3

6

15

2o

Control physiological

salme(o. 8S%3

15

15

8

;1

,

‑ 8 ,

1 7

>}

1

? 3

1 7 3

1 7 J

1 7 3

1 7

3

1 2 3

Note ; Examinations were made at 5⊃C.

D 〔11)

Dし16) D し12)

D (9) D vn)

Dし11)

D an

D (̲10) D (17) S (30) D し14) S (30) S (30) s し30) s (so;

S (30) s (so;

S し3o) S (30) D (.143 D (13;

/ド

mm

1‑

1/I.

+

.‑｣

[ ]

】 1 ,

] ,

/

｣

】

l /

】

､

‑

】

l

I

HA

両株共15%‑20%の高濃度のNaCl水中では'RH の場合20%NaCl水中に50分間'Bev. Cystの場合は 15‑20% NaCl水中に15時間以内に死滅した･

この成績から比較的高い濃度の塩類溶液中では, RHよりBev. Cys†が強い抵抗性を持つものと判断

された｡

3.各種のpHに対するTpの抵抗性

生理的食塩水をINのHCl及びINのNaOHに よりpH l･2‑12.0の各液を作り,これに原虫を加 えて5 cCの冷蔵庫内におき,所定の時間毎に取出し てマウスに接種した.接種原虫数はRH株20×106個 体, Bev. Cyst 120個である.その成績は表8及び表 9に示す如く, pH l･2においたRHは5時間以後原 虫に傷害がみられ,マウスに対する感染力は著しく低 下し, 22時間後には完全に感染能力を消失した.

これに対して, Bev｡ CystはpH 1.2においても強 い抵抗性がみとめられ, 22時間後も感染能力を保持し ていた.また'pH 1.2以外の各種pHに対しては, 南棟とも,かなりの抵抗性を保有していることが認め られた.

この成績から極めて強い酸度,例えば胃液など,の

液中において, RHよりBev. Cystが強く抵抗して 生存できることが判明した｡

4.各種温度に対するTpの抵抗性

Tp原虫が種々の温度に対してどの程度の抵抗性を 有するものであるかを知るために,以下の実験を行な

った｡

CD 40｡c〜9｡°cの加温に対するTpの抵抗性 接種原虫数はRH増殖型が24×105個体'Bev.Cyst が480個ーである.‑苫pはそれぞ垂線に入れ'40｡C

〜90｡cの各種温度に調整した温浴槽に浸して, 5 分 または1D分間加温し, Tpの加温に対する抵抗性を検 討したが,その成績は表10及び表11に示した｡

RfI増殖型は56°c IO分間, Bev. Cystは50｡cIO分間 加温に対して原虫の生存が認められたが,それ以上の 高い温度に対しては原虫はすべて5分以内に死滅した･

(2) 3丁｡c以下の低温に対するTpの抵抗性 RH感染マウスの肝と Beverley感染マウスの脳 を無菌的に採取して試験管に入れ,ペニシリン400U/

cc,ストレプトマイシンIQmmg/ccを添加した生理

的食塩水を注加してこの液中に浸し, 57〇c, 25｡C及

び10｡Cの各温度に調節した貯卵器内に保存して,毎

Toxoblasmaどondiiのj王j=物J二 誉的研賓l第1朝2:]

表8.  0.巳5%食塩水中におけるRH増ヴュ5塑7一生存に及は)ヽす水ノlj:壬イ.a)ノ法度CpH';の効架 Table 8. Effect of various pHs of saline solution on viahiliy of the.Rrf

proli erative form

pH

1･2

Time of exposure

しhourノ

No. of mice inoculated

1

J

ヽ…

1.3

3.0

5.0

(Control) 7･2

9･0

12.0

71

Note ;

1 2 3

1 2 3

1

^ 3

き

i

1

Fate of mice inoculated

5

Detect!°n of 7". sond.i

Prolif form

D (8)

D し8) D c.?;

S (30;

D (9}

S (30) D (10)

｢

†

1

^ ヽ…

1 2 3

1 2 3

1 2 3

1 7 3

1 2 3

S (30ノ S (30ノ S (30) D (9) Dし9ノ D (7ノ D (5ノ D .;5i D (ち) D (5) D し5)

D (5) D (5) Dし5) n v5^

D (5;

D し6)

D <.o;

[

1

】

i /

i

/

葦

】

十 丁 十

I

+

I

十

｢

mm 1｢

mm

ら】

1

[ / /

l

≡ ー

ii

二

Examin魂ions were made追tJぎ｡cHまnd the range o̲〜 pHs test‑

ed was 1.2 to 12.0.

HA

日取出して乳鉢内で磨砕し,その乳剤をマウスに接種 して接種材料中のTp生存の有無を観察した｡その 成績は表12及び表15に示した.

RH感染マウスの肝の中に含まれる増殖型は57cCで は2日, 25cCで5日, 10cCでは8日間生存してい た Beverley感染マウスの脳内Cystは57℃で2日, 25℃では5日, 10｡Cでは26日間生存していた.被検 材料接種マウスからTpを検出できず,しかも高いTp 抗体価が認められた事例を考慮すれば, Bev.Cystの 場合57℃で5日, 25｡Cで5日間生存していたものと 推測される.

(3) 2 ｡c前後の低温に対するTpの抵抗性

RH感染マウスの肝及びBeverley 感染マウスの 脳を無菌的に採取し,試験管に入れて密封し,市内の

某屠畜場の食肉冷却室( 2.25｡c〜‑1.15｡C°内に保 蔵し,逐日または2〜5日間隔で取出して乳剤を作り,

マウスに接種してマウス臓器内の原虫の生存を調査し た.この実験成績の詳細は, Nakabayashi et al. i^1 967)によって既に報告したので,今回は要約した成 績を表14及び表15に示した.

この表に見られるように, RH株では最大11日, Bev｡ Cyst の場合,最大67日間原虫のマウスに対す

る感染性は維持されていた･

(4)凍結温度C‑14‑C)[二対するTpの抵抗性 RH株感染マウスの肝及び Beverley 感染マウス の脳をそれぞれ試験管に入れて,ディープフ))‑ザー (‑14｡c)内に貯蔵し,一定時間後に取出して,乳剤 を作り,マウス腹腔内に接種し,原虫の生死を観察し た.その結果,表16及び表17に示す如く,両株共, 1 時間生存していたが,それを超過する時間貯蔵したマ

ウス臓器内の原虫はすべて死滅していた.

s.乾塩に対するTpの生存能力

212       本 村 一 郎

T禾ab干し｡･豊h8…5cOづ繁f追vア…r悪i〇usわヲH…Be

｡f言erley;

alinesヽ三.三t1卜o三悪n繹……a光皇宮yアkoデtイhアンB繁v繁rl三pH)<

ycysや効果 pH

Time of exposure

(hour)

No. of mice inoculated

1.2

3.0

5.o

(Control) 7.2

9｡o

12･0

Note ;

1 2 3

1 2 3

1 2 3 1 2 3

1 2 3

1 2 3

Fate oi mice inoculated

Detection of T,gondii Prolif･ form

S (30) S (30) S (30;

S (30) D (14°

S (30) D (ll) Dし12) D (iij D (12) D 01;

D (12;

S (30.) s (｡3o) S (30) S (30) D (12) S (30)

1

;!i/

+

+ 十 + 十 + +

+

Examinations were made at 5‑C and the range of pHs tested was l･2 to 12･o.

十 十 + 十

ト

+ + 十 + 十

表10.  RH増殖型の加熱に対する抵抗性

Table 10. Resistance of the RH proliferative form to heating

Tempe rature

CcQ

40

50

56

6o

7o

90

Time of exposure

minutes 1o

lo

lo

No. of mice incoulated

Fate of mice Detection of T.

mo cul atefi

P∫olif. form Cyst

HA

°

°

5

1 2 3

1 2 3

1 2 3

1 2 .1

1 7 3

1 2 3

.

1

/

] //

,

//

D (5) D C5) D (53 D (8) S (25) D (8) S (25) S (25°

D C8;

S (25) S (25) S (25) S (25) S (25;

s (2声) S (25) S (25) S (25;

十 + 十 十 +

+

Contro

1o｡C

minutes

1 2 3

D (4) D (4) D C4)

十 + 十

Toxoplasmagondiiの生物学的研究,第1報      215 表11･   Beverleyシストの加熱に対する抵抗性

Table ll. Resistance of the Beverley cyst to heating

Temperature (｡C)

Time of exposure

No. of mice inoculated

Fate of mice inoculated

4o

50

56

60

7o

9o

minutes lo

lo

lo

°

°

5

1 2 3

1 7 3

1 7 3 1 2 4

1 9 3

1 7 3

Detection of T,･ gondii prolif,form】 cyst

s し3o) S (303 S (30)

D (12)

s (30;

S (30) S (30) S (30) s (ュo) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30)

1 1 1 3

】し

T

十 十 +

+ 十 十

HA

Control 1o｡C

1o minutes

1 2 J

S (30) S (30) S (30)

乾燥状態におけるTpの生存能力を知ることは,原 虫が宿主の体内を離れて,新しい宿主の各寄生部位に 運ばれる問の乾燥状態に対する生存能力を理解する上 に役立ち,また,木原虫に対する殺滅効果を知る手掛

りとなると考え,この実験を行なった.

実験方法は,巾1.Ocm,長さ,.Ocmの長方形に切 断した滅菌ガーゼを2枚重ねてシャーレの蓋を被ぶせ ず,この布上にRH株50×105個体, Bev.Cyst 240 個をそれぞれ含む原虫浮済液0. 05ccを滴下し,あらか じめ,底部に乾燥剤(塩化カルシウム)を入れたデシケ 一夕ーの内部におき, 10｡Cの貯卵器内に入れて,〜

定時間毎に取出して, 1. Occの生理的食塩水中に再浮 沸させた後, 5匹のマウスにO.Sccずつ腹腔内接種 して原虫の生死を検査した.対照実験としては,乾燥 剤を入れずにデシケークー内に保持した場合のTp原 虫の生存能力につい検討した.マウスへの接種原虫数 は上記原虫数の約鳩を, 1匹当り接種したことになる その成績は表18及び表19に示した.

すなわち, RH増殖型はデシケークー内においた場 合24時間生存したが, 48時間後には死滅した,一方, Iおv･ Cyst脳乳剤はデシケーター内において15時間生 存し'24時間以後Cystは死滅していた･しかるに対

照実験のように'乾燥剤を入れていないデシケーター 内においたRH及びBev. Cystは共に72時間後もマウ

スに対する感染力を保有していた.

しかしながら,この実験において注意すべき点は, 被検液を滴下して湿潤状態にあるガーゼが乾燥するま でに5〜4時間を要することから,この間は湿潤また は半乾燥の状態にあったと考えられ,厳密な意味での 乾燥状態とは云えない.したがって,この実験では, 原虫をデシケ一夕ー内に入れた直後からの時間で表現 することとした.

この成績から, Tp原虫は乾燥によって1日以内に 死滅することが明らかとなった.

6.紫外線の照射をうけたTpの生存能力

紫外線の殺菌的効果はTpに対してどの程度の効力 を発揮するものであるかを知るために, RH増殖型 20×105/0.Ice, Bev. cyst 80/0.Iceの濃度を有する 原虫浮溝液を作り,シャーレの中に深さ2mm程度に 浅く分注して,蓋を開いたままの状態で殺菌灯(東芝 製, 15W用ランプ)の直下30cmの距離におき,栄 外線を照射して所定の時間毎に取出して,マウスに接

種し, Tpの生存能力を検査した.

その結果,表20及び表21に見られるように,南棟共,

214       本  村  一  郎

表12.   RHl感染マウスの肝を各種低温に保持したときのRH増殖型の抵抗性 Table 12‑  Resistance of the RH prolferative form in the infected

mouse livers to ､arious low temperatures

】

Temperature (｡C)

Storage period

(day;

No of mice inoculated

Fate of mice inoculated

Detection of T･gondii宇LL

Prolif･ form Cyst

HA

Control o

1 2

.>

D (5) D (5) D (4)

+ ::

十

37｡C

1

7

3

4

/:

1

2

°

1 2 3

1 2 3

1 2 3

D (5) D (5) D (9) S (25) S (25) D (10) S (25) S (25) S (25) S (25) s し25) S (25)

十 十

･ト

+

±

Control ₀

1 2 3

D (5) D (5J) D (53

+ + 十

25｡C

2

3

4

7

1 2 J

1 2 3

1 2 3

1 2 3

D (ll) D (9) D oo;

S (30) D (10) D (10) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30)

十 十 +

十 +

Control 0

1 2 3

D (4) D (43 D (4)

+ + +

2

4

1o｡C

6

8

1o

12

1 2 3

1 2 o

1 2 J

1 2 3

1 2 3

1 2 3

D (6) D (6) D (5;

D (7) D (7) D (7) D (8) D (8) D (9) D (12) D (12) D (ll) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30)

十 十 + 十 + 十 + + 十 十 + 十

Toxoplasma gondiiの生物学的研究,罪1報       215 表13･   Beverley株感染マウスの肝を各種低温に保持したときのシスト

し)肌 th;

Table 13. Resistance of the I]everley cyst in the infected mouse brains to various low temperatures

Temperature (｡C)

Storage period

(day)

No of mice

inoculated

Detection of T.gondii prolif･ form Cyst

HA

Control 0

1 2 ,1

S (30) S (30) S (30)

十 十 十

[

]

37｡C

7

3

5

1 7

3

1 2 3

1 7

^

D (14) S (30) S (30) S (30) S (30J S (30) S (30) S (30) S (30)

十

十

8什

汁

Control 0

1 2 3

D (12) D (12) D (12)

十 + 十

25‑C

7

.>

4

^

7

1 7 3

1 2 3

1 2 3

1 7 3

1 7 :)

D (7) D (7) D r?) D (13) D (ll) D (14) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30°

S (30) S (30) S (30)

十 十 + 十 十 十

3

/

/

…

… 廿

control

】

o

1 7 3

10｡C

10

2o

26

32

40

1

^

3

1 2 3

1 7 3

1 2 3

1 7 3

S (30) S (30) S (30)

+ + 十

/

ら

､

] .

弓

1

S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) D (15) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30)

+

十 十 十 十 + 十 十 十

216      本  村  一  郎

表14･   RH感染マウスの肝を屠場冷蔵室内に貯蔵したときのRH増殖型の感染 性に及ぼす貯蔵効果

Table 14. Effect of storage in the refrigerating room of a slaughterhouse upon mfectivity of the RH prolit‑rative form in the infected mouse livers

Storage period (day)

No. of mice inocul ated

Fate of mice Detection of T.

inoculated

Pro出 form Cyst Control

o

/I 2

, >

D (3) D (4) D (4)

十 ート +

5

7

9

ll

13

15

1i 2 3

1 7 3

‑1 2 3

1 2 3

…1

べ2

I)

II

2 3

D (6) D (6) D (6) D (7) D (7) D (6) D (6) D (8) D (7) D (10°

D (ll) D (ll) S (43) S (43°

S (43) S (43°

S (43) S (43)

+ 十 十 1ト 十 十

H一

十 + + 十 十

紫外線の5分間照射には生残したが, 5分以上の照射  殺滅に極めて有効的であることを知った.

によつて死滅した.この成績から,紫外線願射はTpの

Toxoplasma gondtiの/上物学的研究,第l報      217 表IS.   Beverley感染マウスの脳を,ー%場冷蔵室に貯蔵したときのヽンストの感染性に及ばす

Kl…'i;二ゝニ:VI⊥

Table 15. Effect of storage in the refrigerating room of a slaughterhouse upon infectivity of the Beverley cyst in the in ected mouse brains

Storage period (day)

Control

o

No. of mice inoculated

l )

.>

Fate of mice inoculated

S (43) s し43ノ D し12ノ

Detection of jr.gondii Prolif form

j

7

15

21

28

35

42

49

56

63

67

7o

75

80

1 7

.)

1 7 3

1 7 .1

1

? 3

1 2 3

1 7 3

1 2 3

1 7 3

1 2 3

1 2 3

1 2 3

1 2 3

1 2 ,1

l

】 / ,

i 1

!/

/

1

/

D し14ノ D し12ノ

D vo,

s ､3Uノ

s し3ウノ s し39ノ s し3ウノ s し31ノ s し31ノ s し31ノ D し12ノ S (30) U し12ノ s し39) S し39) s し39) s し33) 33 s し33ノ S v36) ゝ し001 S (36ノ S (33ノ s し33ノ s し33ノ S (30) s し3oノ S (30;

イ日i

十 十 十

■…

十

｢

】

l

Cyst + +

+ + 十 十

+ 千 十 十 十 十 十 十 十 十 サ 十

▼ ･ /

十 十 十

/TL

十 十

218       本 村 一 郎

表16.  RH感染マウスの肝をディープフリーザー(‑14°C)内に貯蔵したときの RH増殖型の生存力

Table 16. Viability of the RH proliferative form in the infected mouse livers after storage at ‑14｡C in a deep‑freezer

No. of mice inoculated

Time of storage

Control 0 mm

Fate of mice inoculated with liver emulsion

Detection of T. gondii prolif. form Cyst

HA

1 2 3

D (5) D (s;

D (5)

T +

†

15 mm

30 mm

1 hour

3 hours

la hours

24 hours

表1丁･

Table 17.

1 7

,1

1 7

.>

1 7

3

1 7

3

1 7

,1

1 7

3

D (8) D (8) D (8) D (9) r> (9;

D し9) D (10) D GO;

D (10) S (24) S (24) S (243 S (24) S (24) S (24;

S (24) S (24) S (24)

｢･

†

｢

l

T

!

ii

,

丁 T

十

,

11｢

ii

Beverley感染マウスの脳をデイブプフー)‑ザー(‑14｡C)内に貯蔵したときの Iae^erleyシストの生存力

Viability of the lieverley cyst in the infected mouse brains after storage at ‑14cC in a deep‑freezer

No. of mice inoculated

1 7

.5

Time of storage

Control 0 mm

Fate of mice inoculated with brain emulsion

Detection of T. gondii prolif. form Cyst

HA

S (22) S (24)

D (10)

ii T

15 mm.

30 mm

1 hour

3 hours

ID hours

24 hours

1 7 3

1 7 .i

1 7 3

1 2 3

1 7 3

1 7 3

S (22) S (22) S (22) S (22) S (22) S (22)

S (20) S (20) S (20)

十 + + T

ー

ii

.

ii

+

Toxoplasma gondiiの生物学的研究,第1報       219 表18.   乾燥に対するRH増殖型の抵抗性

Table 18. Resistance of the RH proliferative form to desiccation

Desiccation

No. of mice inoculated

Fate of mice inoculated

Control

0

1 1

3

D (4) D (4) D (4)

Detection of T.gondii prolif･form】 cyst

HA

十 十 十

1

】】

3

6

By desiccant

9

15

24

48

96

144

1 2 3

1 7 :)

1 7 3

1 7 :)

1 2 3

1 2 3

1 2 3

1 2 :)

D (6) D (5) D cs;

D (6) D (6) D C5) D (7) D (8) D (7) D (7) D (7) D (7) D (7) D (7°

D f7) S (30) S (30°

S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30) S (30)

十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 + + 十 十 十

/‥

i

】ー

1

1 / /

]

/

6

(Control) Without

desiccant

9

15

24

48

77

1 2 3

1 9 :)

1 2 3

1 7 :)

1 9 3

1

>

3

D (6) D (6;

D (6) D (6) D (6)

D し6)

D (7) D (7) D C8) D (7) D (7) D (7) D (7) D し5) D (.5;

D (6) D (5) D (7)

十 十 十 + + + 十 + 十 十 十 十 十 十

iii

十 + 十

220       本 村 一 郎

表19･  乾燥に対するBeverleyシストの抵抗性

Table 19, Resistance of the Beverley cyst to desiccation

period (hour)

Control

o

No. of mice inoculated

1 7

.}

Fate os mice

inoculated

HA

Desiccation Detection of T. gondii

王By

desiccant

prolif. form Cyst D (12)

D Ou

D し11)

+ 十 +

J

6

9

15

24

48

96

144

1 2 3

1 7

o

1 7

J>

1

? J

1 9

3

1 7

3

1

‑>

.1

1 7

3

(Control)

Without

desiccant

6

9

15

24

48

72

1 7 .5

1 7 3

1 2 3

1 2

.)

1 2 3

1 7

>>

D (8) D C8J) D (8) D (12) D cn;

D (12;

S (30) S C30J) S (30J) S C30) S (.30ノ S (30) S (30) S C30J) S (30J) S (30) S (30) S (30;

S (30) S (30ノ S (10) S (30) s (so;

S (30)

F

十 + 十 十 十 十

十 + 十

+ +

.

1什

D (12) D (12;

D (13) D (12) D 〔1o) D (15) D (13) S (30) S (30) D (14) D CH) D as;

D (17) S (30) D (21) D (20) D (23) S (30)

十 十 十 十 + + 十

十 +A

/  .

･81･1

十 十

十 十 + 十 十 十 +