博士（薬学）橋本 尚 学位論文題名
ヒト成人および胎児特異的に発現する チトクローム P450 に関する研究
学位論文内容の要旨
1 ．序論
薬 物代 謝 の中 心 的役 割 を担 うチトク ロームP450 のう ちCYP3A 分子 種は、総 P450 発現量の約25 〜 60% を占める主要なP450 である。
当研究室 では既にヒ ト成人また は胎児肝に 常在する CYP3A4 お よぴCYP3A7 の精製およぴcDNA クローニングに成功し、それらが非常に類似した一次構造 を持つにもかかわらず、それぞれ成人およぴ胎児期に特異的に発現しているこ とを明らかにしている。しかし、CYP3A4 およぴCYP3A7 がそれぞれ異なった機 能を有しているのか、またどのような発現調節を受けているのかについて、現 在まで全く明らかにされていない。その最も大きな理由は、ヒト肝試料、特に 胎児のものを入手することが極めて困難なこと、さらにその利用には倫理的な 制約が伴うことからである。
そこで本研究では、胎児型CYP3A7 を安定的に発現する培養細胞を樹立するこ とにより、その毒性学的機能を解明することを目的とした。さらにCYP3A7 お よぴCYP3A4 遺伝子の構造を決定し、両遺伝子の発現調節機構についても考察 した。
2 ． 胎 児 型 P450 (CYP3A7) に よ る 癌 原 性 マ イ コ ト キ シ ン の 代 謝 的活 性 化 ；成人型 P450 (CYP3A4) との比較
P450 還 元 酵素 を 安定 的 に発 現 するCHL 由来細胞 にCYP3A7cDNA を導入し、
これ らを安定的 に発現する 細胞株を樹 立すると共 に、同様な 方法でCYP3A4 cDNA を導入 した細胞株 も樹立し、 胎児型CYP3A7 と成 人型CYP3A4 の癌原性 マ イコトキシンに対する代謝的活性化能を比較検討した。AFBi に対する細胞致死 率を指標として比較検討したところ、それぞれのP450 を高発現する培養細胞株 は、ほぼ 同等な感受性を持ち、その感受性は、CYP3A 活性化剤のoc‑NF や阻害 剤の14 員環マクロライド抗生物質の添加で、同様な上昇または低下を示した。
またAFGi やSTG に対して も両細胞は 同程度の感受性を示した。これらのこと から、癌 原性マイコトキシンに対して、CYP3A7 は CYP3A4 と同等な代謝的活性 化能を持つことカミ明らかとなった。
3 ． ヒ トチ ト クロ ー ムbs 、 bs 還 元酵 素 およ び CYP3A7 を 発現 す る細 胞 株の AFBi に対する感受性
CYP3A7 発現細胞にチトクロームbs およぴbs 還元酵素を順次導入し、より生
体 内 に 近 いCYP3A7発 現 細胞 の 樹 立を 行 った 。 こ れら3種 の 酵素 を 同 時に か つ 安 定 的に 高 発 現す る 細 胞株 は 、AFBiに 対 し て、CYP3A7の み を 発現 する細胞株 よ り も約2倍 の 感 受性 を 示し た 。 した がって、 ヒト肝に 存在する電 子伝達系 を ほ ぼ 再現 し た これ ら の 細胞 株 は、 外 来 性異 物 等に 対 す るCYP3A7による代 謝的 活 性 化 を 検 討 す る モ デ ル 系 と し て さ ら に 有 用 で あ る と 考 え ら れ た 。 4．CYP3A7とN‑ア セ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ に よ る 癌原 性 アミ ン の 代謝 的 活 性化
CYP3A7と 第n相 薬 物 代 謝 酵 素 で あ るNATを 同 時 に 発 現 さ せ る こ と に よ り 、 日 常 生活 で 最も 身 近 な癌 原 性物 質で ある癌原 性アミン が胎児肝 内で代謝的 に活 性 化 さ れ 得 る か ど う か 検 討 し た 。P450還 元 酵 素 と ヒ トNATl (monomorphic NAT)ま た はN´ ｀ 他 （polymo叩hicNAT） を 安 定 的 に 発 現 す るQ也 由 来 細 胞 に CYP3A7発 現 プ ラ ス ミ ド を 導 入 し 、CYP3A7とNAT1、 ま た はNAT2を そ れ ぞ れ 同 時 に発 現 する 細 胞 株を 樹 立し た。 これらの 細胞は、 同程度のAFB1感受性を有 し て おり 、 またNAT活 性も 親 株と 同 程 度を 維 持し て い た。 そ こで 代表的な癌 原 性 ア ミン で あるIQ、MeIQ、MeICは およ び6‐ACに 対 する こ れ らの細 胞の感受 性 を コロ ニー形成法 を用いて 検討した 。その結 果、（：YP3A7とNAT2を同時 に発項 す る 細胞 株 は、 親 株 と比 較 して 約4〜30倍 程 度の 高 感 受性 を 示し た。しかし 、 CYP3A7の み を 発 現 す る 細 胞 株 お よ び の 停3A7とNAT1を 同 時に 発 現す る 細 胞株 は 親 株と 同 程度 の 感 受性 で あっ た。 以上のこ とから、 癌原性ヘ テロサイク リッ ク ア ミ ン は 、 ヒ ト 胎 児 肝 に お い て も 代 謝 的 に 活 性化 さ れ、 そ れ はCYP3Aっと NAT2の 両方 が 関 与し て い るこ と が示 さ れ た。
5．CYP3A7およぴCYP3A4遺伝子の単離と発現調節機構
ヒ ト ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー よ りCYP3A4お よ びCYP3A7遺 伝 子 の 単 離 を 行い 、 その構造をそれぞれ決定した。
両 遺 伝子 は 共に 全 長 約30 kbか ら な り、13個の エク ソンから 構成され る非常 に類似し た構造を していた。 さらに両 遺伝子の スプライ ス部位は すぺてgt ‑ ag 配列 に 従っ て お り、 エ ク ソン 長 も第1お よ ぴ 第13エクソ ンを除い て完全に 一致 して い た。 こ れ らの 結果 より、そ れぞれの遺 伝子は本 来同一で あったも のが進 化の過程で分岐したものであることが推察された。
CYP3A7およ びCYP3A4遺 伝 子の5． ‐ 上流 領 域 の塩 基配列を 解析し比 較したと ころ、+1か ら‑869までの 相同性は91.20/0と 非常に高 かった。 また、両 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に は 多 く のP450分 子 種 に 共 通 し て 存 在 す るBTE (basic transcription element)配列が見られ、この領域に結合する因子がヒト胎児およぴ成 人肝 核 抽出 液 内 に存 在す ることを ゲルシフト アッセイ 法により 確認した 。さら に両 遺 伝子 の5｜ − 上流 に は、 肝 特 異的 転 写 因子HNF‑4およ ぴHNF‑5結合領 域、
CCAAT box (C/EBP結合領域 ）、p53結合 領域などが 共通に存 在してい た。興味深 い こ とに 、‑729〜‑737お よ び‑287〜‑296． の 領域 に はCYP3A7ま たはCYP3A4遺 伝 子 に 特 異 的 な 塩 基 の 挿 入(HFLaSEお よびNFSEと 命名 ） 領 域が 存 在し 、 ゲ ル シフ ト アッ セ イ 法に より 、この領 域に結合す る因子が ヒト胎児 および成 人肝核 抽出液内に存在することも明らかにした。
CYP3A4遺 伝 子 の 転 写 活 性 に 関 与 す る 領 域を 同 定す る た めにCATアッ セ イ を 試 み た 。CYP3A4遺 伝 子 の‑94〜+71ま で の プ ロ モ ー タ ー 領 域 をSV40プロ モ ー タ ー に置 換 した 後 、‑2900より 順 次 欠失 さ せ た欠 失 変異 体 をCAT構 造 遺伝 子 の 上流 に 連結 さ せ た発 現 プ ラス ミ ドを 構 築 し、 こ れら をHepG2細胞に 導入する こ
とによ．りCAT 活性を測定した。その結果、CYP3A4 遺伝子の5 ．‐上流‑445 から
‑245 までに転写活性化因子が、またその上流には転写抑制因子が結合し発現調
節を行っていることが示唆された。
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教 授 鎌 教 授 横 助 教 授 横 助 教 授 澤
滝 哲 也 沢 英 良 井 毅 田 均
学 位 論 文 題 名
ヒト成人および胎児特異的に発現する チ トク ロー ム P450 に関 する 研究
申 請者 は、 ヒト 成人 およぴ胎児の肝臓にそれぞれ特異的に発現するチト ク ロ ー ムP450（P450） 分 子 種 、CYP3A4とCYP3A7の 毒 性 学 的 機 能の 解析 と比 較、 およ ぴ遺伝子発現機構の解明を目的として検討を行い、
多 く の 新 し い 知 見 を 得 た 。 実 験 動 物の 胎 児 に はP450は 存 在 し な い が ヒ ト の 胎 児 に はか なり の量 （成 人肝の 数10％） 存在 する 。し たが って ヒト の胎 児の 体内 での 癌原 物質の代謝的活性機構などを実験動物を用いて研究 し、 予測 する こと はで きない。本研究は特にヒトの胎児における分子毒性 学的 な研 究分 野に おい て高度で先端的な概念を提供するものであり、以下 に 詳 述 す る よ う に 極 め て 優 れ た 研 究 成 果 で あ る と 評 価 さ れ る 。
1)ヒ トCYP3A4お 圭 びCYP3A7 cDNA窒 導 入 し た 培 養 細 胞 系 の 樹 重 量 壷 性 試験 への 応用
P450還 元 酵 素 を 安 定 的 に 発 現 す るCHL由 来 細 胞 にCYP3A4 cDNAを 導 入 し 、 こ れ ら を 安 定 的 に 発 現 す る 細 胞 株 を 樹 立 す る と共 に 、 同様 な方 法で CYP3A7cDNAを 導 入 し た 細 胞 株 も 樹 立 し 、 胎 児 型CYP3A7と 成 人 型 CYP3A4の癌 原性 マイ コト キシ ンに 対す る代 謝的活 性化 能を 比較 検討 した。
」4FBiに対 する細胞致死率を指標として比較検討を行ったところ、それぞれ のP450を高 発現 する 培養 細胞 株は 、ほ ぼ同 等な感 受性 を持 ち、 その 感受性 は 、CYP3A活 性 化 剤 （ ば ー ナ フト フ ラ ボ ン ） や 阻 害 剤 （14員 環 マ ク ロ ラ イ ドの トリ アセチルオレアンドマイシンなど）の添加で、同程度の上昇また は 低下 を示 した 。ま たア フラ トキ シンB・と同様マイコトキシンであるアフ ラ トキ シンGiや ステ リグ マト シス チン に対 しても 両細 胞は 同程 度の 感受性 を 示 し た 。 こ れ ら の こ と か ら 、CYP3A4とCYP3A7は 同等 な 代 謝的 活性 化能
を 持 つ こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た こ の 研 究 によ っ て 、CYP3A7がaー ナ フト フラ ボン 添加 によ りそ の代 謝的 活性 化能 が亢 進され 、ト リア セチ ルオ レア ンド マイ シン など の14員環 マク ロラ イド 系抗 生物質 の添 加で その 機能 が阻 害さ れる こと 、さ らに アフ ラト キシ ンGiやス テリグ マト シス チン も代 謝的 に活 性化 する こと を初 めて 見い だし た。CYP3A7に関 する 研究 は、 本酵 素が ヒト 胎児 に特異的に発現している酵素であることなどの特殊性から世界 的に ほと んど 研究されていない。上述の知見はしたがって極めて貴重な新知 見と 言え る。
22 CYP3A4竺CYP3A7を 登 盟 主 墨 壁 養 塑 麭 挂 仝 堕 主 と2里 二A b5cDNA堕
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チ ト ク ロ ー ムb5はP450分 子 種 に よ っ て 、 ま た 用 い た 基 質 に よ っ てP 450の 活 性 を 増 加 す る こ と が知 られ てい る。 実際 肝ミ クロゾ ーム には チト ク ロ ー ムb5が 存 在 す る こ と か ら 、 培 養 細 胞 にP450を 中 心 と す る 電 子 伝 達 系を 再構 築す るに はチ トク ロー ムb5やチ トク ロー ムb5還 元酵 素cDNAを 導 入 しP450と 共 に 同 時 発 現 す る こ と が 望 ま し い 。 そ こ でCYP3A4と CYP3A7を 発 現 す る 培 養 細 胞 に チ ト ク ロ ー ムb5お よ びb5還 元 酵 素 のcDNA を 順 次 導 入 し 、 よ り 生 体 内 に 近 いCYP3A7発 現 細 胞 の 樹 立を 行っ た。 これ ら3種 の 酵 素 を 同 時 に か つ 安定 的に 高発 現す る細 胞株 は、ア フラ トキ シン Biに対 して 、CYP3A7のみ を発 現す る細 胞株 よりも約2倍の感受性を示した。
したがって、ヒト肝に存在する電子伝達系をほぼ再現したこれらの細胞株は、
外 来 性 異 物 等 に 対 す るCYP3A7に よ る 代 謝 的 活 性 化 を 検 討す るモ デル 系と してさらに有用であると考えられた。
3) CYP3A7を 発 現 す る 培 養 細 胞 株 へ のN‑7生 主 坐 と 霊 三 墨Z三 霊 二 ゼ c【冫NAの 導入
CYP3Aプ と 第II相 薬 物 代 謝酵 素 で あ るNATを 同 時 に 発 現さ せ るこ とに よ り 、日 常生 活で 最も身近な癌原性物質であるへテロサイクリックアミンおよ ぴ アリ ルア ミン （癌原性アミン）が胎児肝内で代謝的に活性化され得るかど う か検 討し た。 癌原性アミンの代謝的活性化はヒト成人肝では（：YPlAが主 に そ の 機 能 を 果 た し て お り 、 ヒト 胎児 肝に はCYPlAは 存在 する が極 めて 微 量 であ ると 考え られるため、これらの物質の胎児に与える影響は少ないであ ろ うと 推測 され てい た。 本研 究に おい て、cI也細胞内にCYP3A丶7とNパr2を 同 時発 現さ せる ことによって、癌原性アミンが代謝的に活性化されることを 明 らか にし た。 本研究の結果は、ヒト成人肝と胎児肝では異なった代謝的活 性 化メ カニ ズム が存在する可能性があることを示唆するものである。ヒト胎 児 肝試 料を 用い た毒性試験を行うことは倫理上難しい問題があるため、今後 は 本研 究で 樹立 した細胞等を利用し、より詳細に胎児毒性を予測することが 可 能に なる こと が期 待で きる 。
4）CYP3AヱおよびCYP3A4の発現調節機構
CYP3A7およ ぴCYP3A4はその塩基配列やアミノ酸配列が似ているが、そ れぞれヒト胎児および成人に特異的に発現している酵素である。この胎児 と成人特異的な発現調節機構の一端を明かにするために、先ずCYP3A7およ ぴCYP3A4遺 伝子を単離し、その構造を比較するとともに、CYP3A4遺伝子 に関 してはその 転写調節に関与するエンハンサ―領域の同定を行った。
CYP3A7およ ぴCYP3A4の 一次 構 造を 比 較 する と 、cDNAの 塩基 配 列 で 95%、．推定アミノ酸配列で88%の相同性を持っている。しかし、両P450の 発現時期の違いから、これらは本来同一の遺伝子であったものか、あるいは 全く異なる遺伝子から同様な機能を持つ蛋白質に進化したものであるかは不 明であった。本研究の結果から、CYP3A7および（ニYP3A4遺伝子は共に約 30 kbにわたり、13個のエクソンから成る遺伝子で、エクソンおよぴイント ロンの長さも非常に類似していることが判明した。さらに既に単離されてい る他の動物種のCYP3A遺伝子と比較しても、その構造は類似していた。し たが って、CYP3A7およぴCYP3A4遺伝子は本来同一の遺伝子から、進化の 過程で分岐したものであることが予測された。
次に、両遺伝子の5t‐上流領域を解析し、CATアッセイ法を用いて、転写 活性化領域の検索を行った。CYP3A7およぴCYP3A4遺伝子の5．‐上流配列 を比較すると、91:． 2%の相同性があり、両P450のcDNA配列の相同性と同 程度であった。また、両遺伝子の5．‐上流領域に見られる既知の転写因子結 合領 域もほとん ど共通して存在していたが、CYP3A7およぴCYP3A4遺伝子 にそ れぞれ特異 的な塩基挿入領域、HFLaSEおよぴNFSE領域が存在するこ とを見いだした。これらは現在まで報告されている転写因子結合領域とは異 なった配列をしていた。そこでこれらの領域に結合する蛋白質因子の存在を 検討したところ、成人および胎児肝核抽出液中に結合因子が存在することを 見いだした。続いて、CYP3A4遺伝子のエンハンサー領域の解析を行ったと ころ、‑445から‑254の領域に転写活性化領域カ蒋在することを見いだした。
この 領域内には 、CAATボックスとNFSE領域が存在するため、これらの領 域に結合する転写因子、または全く未知な因子によって、CYP3A4遺伝子が 発現の調節を受けているであろうことが推測できた。
以上、本研究ではヒト成人および胎児に特異的に存在するチトクロームP 450の分子毒性学的研究を行い、さらにその発現調節機構について世界的 にも先端的な研究を展開し、大きな成果をおさめた。本論文「ヒト成人およ び 胎児特異的 に発現する チトクロー ムP450に関する研究」に含まれる研 究成果は薬学における基礎およぴ応用のいずれにおいても優れており、博士
（薬学め学位を受けるに充分値するものと認めた。
