Pseudomonas putidaにおける過酸化物除去酵素の発現とその制御機構の解析 利用統計を見る

現とその制御機構の解析

著者

菱沼 宗太

学位授与大学

東洋大学

取得学位

博士

学位の分野

生命科学

報告番号

甲第203号

学位授与年月日

2008-03-25

URL

http://id.nii.ac.jp/1060/00005537/

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ハe"伽剛o"伽p加伽における過酸化物除去酵素の発現とその制御機構の解析

指導教員：清水範夫副指導教員：河合良夫副指導教員：福森文康 学籍番号4910050004氏名菱沼宗太 ［緒言］ 偏性好気性菌であるハe"伽卿o"as〃"伽は生命活動に分子状酸素が必須であるが、分子 状酸素に起因する活性酸素は細胞内分子の無秩序な酸化や老化促進作用を持つため、スー パーオキシドジスムターゼ、ペルオキシレドキシン(Prx)、カタラーゼなどが主に活性酸素 除去酵素として機能している。PrxであるAhpCは過酸化物の還元酵素であり、過酸化水素 やアルキル過酸化物に対して著しくKin値が低いため､大腸菌で報告されているように内因 性の過酸化水素に対応する主要な除去機構であると考えられる。しかし、酸化されたAhpC は再活性化のためにPrx還元酵素(AhpF)とNADHが必要であるため、大量の過酸化物の分 解には適していない。一方、好気性菌に広く分布するカタラーゼはこのような化合物を必 要とせず、高濃度の過酸化物の防御に特に重要であると考えられる。生物は環境の変化に 対応するために多くの適応機構を備えているが、それらの発現の制御様式は多様であり、 微生物においても多くの遺伝子発現調節因子の存在が明らかとなっている｡Prxおよびいく つかのカタラーゼの発現に発現調節因子OxyRが関与することが報告されている｡OxyRは 過酸化物により分子内ジスルフイド結合を形成することによって活性化し、標的遺伝子の 発現を促進する。一般に細菌のPrx遺伝子の発現はOxyRの制御を受けるが、いくつかの 生物種においてカタラーゼの発現がOxyRに依存していることが報告されている｡例えば、 大腸菌(勘c〃e"c"αco//)やRaeγ"g加“αのAhpC'ijgOxyRにより制御されるが、E.co〃の2 種のカタラーゼ(HP-I、Ⅲ-II)ではHP-Iをコードする肋jGの発現が、Ra〃"g加”αでは3種 のカタラーゼのうちの1種のみがOxyR依存性であることが分かっている。一方、プラス ミドに起因する芳香族化合物の分解能や、薬剤排出系に起因する高い有機溶媒耐性などの 環境微生物として優れた特徴をもつRp加伽では、Rp加血mt-2株において産生される2 種のカタラーゼ(KatA、KatB)のうち、KatBの発現がos(RpoS)依存性である事が知られ て い た も の の 、 こ れ ま で 過 酸 化 物 分 解 酵 素 の 発 現 機 構 の 解 析 は ほ と ん ど な さ れ て い な か っ た。 これまでの研究により、Rp加血KT2442株(KT株)由来のトルエン耐性菌であるRp加伽

KT2442TOL(TOL)株において、"yRの特定の変異(oXyRI)によりOxyR中のPhelo6がIleに

変化することで大腸菌と同様にAhpCの高レベルの蓄積が起こることが示され、加えて TOL株でoXyRへ復帰変異によりAhpCの高発現はみられなくなることから､Rp加伽にお いてα伽Cの発現にOxyRが深く関与すると結論づけられていた。本研究において、KT株 のoXyRを雌yRIに置き換えたKT-oxyR1株を用いてOxyRの機能解析を行った結果、R P加伽の主要な2種のカタラーゼの遺伝子が特定され､AhpCと共にそれらの発現において OxyRが転写レベルで関与することを明らかにした。さらに、過酸化物分解酵素遺伝子の発 現にかかわる因子の特定を目的として実験を行い、RNAポリメラーゼのび因子による直接 的および間接的な制御が存在することで､OxyRが制御する過酸化物分解酵素の特異性な発 現が引き起こされることを明らかにしたので報告する。

［結果・考察］ 1(AWRI変異によるカタラーゼ活性の上昇 相同組換えによりR〃"ぬKT2442株(KT株)にo〃〃変異を導入し、KT.oxyR1株を作出 した。両株をLB培地で培養し、対数期から定常期にかけてカタラーゼ活性の浪ll定を行っ たところ、o麺y〃変異株は野生株と比べていずれの培養時期においても10倍以上高いカタ ラーゼ活性を示した（図l-A)。このサンプルを用いてカタラーゼーペルオキシダーゼニ重 染色法による解析を行ったところ、擾P加血は定常期に主にKatAとKatBの2種のカタラ ーゼを生産し、KatAはカタラーゼ活性のみを、KatBはぺルオキシダーゼ活性を併せても つカタラーゼであることが判明した（図1-B)｡oXym変異の導入に伴い、KILoxyRl株の方 が K T 株 に 比 べ カ タ ラ ー ゼ 活 性 を 示 す ク リ ア バ ン ド 、 あ る い は ぺ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 を 示 す濃紺のバンドが強く確認された。これらのことから、Rp加伽においてOxyRが2種の カタラーゼの発現を制御することが示された。o.ryRI変異の導入により、KatAおよびKatB の生産量が著しく増加することが示唆されたため､KTLoxyRl株から2種のカタラーゼの精 製を行った。精製されたKatA、KatBのアミノ酸配列をも上に疫p""伽KT2440株の染色体 DNA配列と比較し、KatA、KatBをコードする遺伝子伽触、肋rB)を特定した。 KT2442KT2442-0xyRI L M S T O / N L N S T O / W (一・

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応 … 伽 沿 仙 ） 図1-Aカタラーゼ活性の経時変化。 ● は 野 生 株 、 ○ は 変 異 株 の カ タ ラ ー ゼ 活 性 を 示 している。 図1-B活性染色図。 各サンプル10"gタンパクを泳動。LOG は対数期、STは定常期を、O/Nは一夜培養 サ ン プ ル を 示 し て い る 2α伽C、加捌、加烟の転写開始点の特定およびOxyR結合性の確認 OxyRは被調節遺伝子のプロモーター上流領域へ結合し､転写制御を行う事が知られてい るため、肋ﾙ4、肋IBの転写開始点の特定をプライマーエクステンション法により行うとと もに、過酸化物による誘導の有無を調べた。また、OxyRにより制御されることが判明して いる､PⅨ遺伝子(α肋C)についても同時に実験を行った｡対数期においてKT株ではα肋C、 肋“、肋iBいずれの遺伝子においても転写レベルは低く、α肋cおよび加必では過酸化物 によりその発現が誘導された｡KTLoxyRl株では￨司じ場所からの転写が構成的におきていた。 一方、KT株、KTLoxyRI株共に加旧の発現は定常期初期から始まり、過酸化物による顕著 な誘導は見られなかった。また、加以、加姻の転写開始点は1ヶ所であったが、α加cの転 写開始点はPlとP2の2ヶ所存在し、過酸化物による処理時間の増加に伴い、P2からの転 写の割合が増加していた。このことから、加以、加旧とα伽cは異なった制御系により制御 されていると考えられた。転写開始点をもとに、データベースのR〃"伽KT2440株全塩基

配列と比較し、その周辺領域の配列を調べたところ、如必、加旧、α/IPCいずれの遺伝子に おいても、転写開始点から35ベース上流の塩基と隣接する形でOxyRが特異的に結合する 配列と相同性の高い配列が存在していた。また、ルα捌は(f)の、ルarBについてはOSの認識 配列と相同性の高い配列が存在した。一方、α伽(ﾌにおいては、既存のび因子の認識配列と 相同性の高い配列は確認されなかった。これらの結果を受けて、3種の過酸化物除去酵素 遺伝子のプロモーター領域へのOxyRの結合性を確認するためにゲルシフトアッセイを行 った。加触、伽rB、α伽Cのプロモーター領域を含むDNA断片において、OxyRの添加によ りいずれも移動度が減少し、OxyRが結合している事が強く示唆された。 3過酸化物分解酵素遺伝子の転写量の定量化 これまでに述べた結果から、Rp""血においては少なくとも3種の過酸化物分解酵素遺 伝子の発現にOxyRが関与することが結論付けられた。これら遺伝子の転写量の、培養に 伴う変化と、転写量に及ぼす”,ﾉ〃変異の影響を調べるために、リアルタイムPCRによる 各遺伝子のmRNAの定量化を行った（表1)｡KT株では、α"C、肋ﾙ4およびk"Bの発現 量は対数期には低く、定常期初期には転写量はほぼ同様に30∼60倍増加していた。これに 対し、KTLoxyR1株では、対数期においてもα肋(プ、加刷の発現量が著しく高く、定常期初 期にかけての発現量の変化はそれほど顕著ではなかった。一方、肋/BはKT株と同様に対 数期では転写量が低く、定常期初期ではKT株よりも増加の割合が高かった｡oXyR/変異は、 α"C，加測、伽IBすべての転写量を著しく増加させるが、対数期の伽出の転写量がほとん ど増加しないのは､kα鰯の発現に関与するRNAポリメラーゼのo因子であるRpoSが定常 期初期以降発現することに起因していると考えられ、OxyRの活性化だけでは肋旧の転写 が起こらないことが示された。以上のことから、OxyRは彊p加伽における主要な3種の 過酸化物分解酵素遺伝子すべての発現を転写レベルで制御することが明らかとなった。一 方、標的遺伝子の発現はOxyRの活性化だけでは促進されず、他の調節因子による発現時 期などの制御が併せて行われることが示された。 oxVR oxy OXVR1 17,82±C 25.72±C 12−49士C １１６ 士士士 ６５０ ９９１ ３６３ ]4IIノ 4RI2C 表1過酸化物分解酵素遺伝子の培養時期での発現量の変化と｡〃〃変異の影響 サイクル数は基準蛍光強度に達したサイクル数であり、サイクル数が少ないほどmRNA量が多いこ とを示している。サイクル数は3回実験を行った平均値を示した。 4過酸化物分解酵素の免疫学的検出による定量化 原核生物の細胞タンパク量を規定する要因は、主に遺伝子の転写量であることが知ら れているが、没〃"血の3種の主要な過酸化物分解酵素の発現における転写時以外の制御 について検討するために、Western法を用いてAhpC、KatA、KatB各タンパクの細胞内存

在量の測定を行った（図2)｡AhpCについては、KT株に比べてKTLoxyRl株で細胞内濃度

が著しく上昇しており、両株ともに対数増殖期よりも定常期の方が、濃度が高い傾向にあ

った。KatAについては、KTLoxyRl株では対数期からその存在が確認されたが、KT株では 定常期初期からその存在が確認された。またKTLoxyRl株の方が高濃度ではあったが、両 菌株間でAhpCほどの差は見られなかった。KatBはKT株、KTLoxyR1株ともに対数期後期 からその存在量が増加していた。また、各増殖段階においてKTLoxyRI株における存在量 のほうが高くなっていた。先に述べたように、KT株においてはα伽C、如触の転写量は対 数期に比べて定常期初期以降に急激に上昇したが、同株においてAhpCの濃度変化が予想 より低いこと、また定常期初期のKatAの濃度がKTLoxyRl株と大きく異なることなど、転 写量の測定結果と矛盾があり、転写後調節機構の存在を示すものと考えられた。 ① AhpC KatA KatB KT株 ② ③ ④ 輔識;職§ 亨 蝿 ; : ‘ 蕊 錘 ： 帯 一 KT-oxyR1株

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!':“”"峰‘鵬”｛“郷鉱嚥,撫内黙魏鐵職蜘＃ 副 嫌 ｡ ､ ｰ " 鯖 図2Westem法による過酸化物分解酵素の検出 ①はA600nm値が1(対数期）のサンプルで、②は①から2時間後（対数期後期)、③は4時間後（定常 期初期)、④は6時間後（定常期）のサンプルである。KT株のAhpCは0IODunit(10Dの培養液lml から得た菌体をlODmitとした)、KTLoxyRl株のAhpCは0.0250Dunit、KatA、KatBについては、KT 株が0.20Dmit、KT-oxyRIについては0.10Dunitを泳動した。 5KatBの細胞内濃度調節機構の解析 RpoS 巾。S KatB KT-oxyR1ArpoS (pahpC-IpoS) L O G S T O / N や榊葡:::錦宴緯漣；≦零"謡…r割。 ｢両詞15.2311.89 士1.馴士1．28士2．64 一 : ‘ − KT-oxyR1ArY)oS (pKT231) L O G S T O / N KT-oxyR1 (pKT231) L O G S T O / N 学 ,可 ・ さ 了 ． 。 矛 勺 勾 ・ . ， ． ｡ − ， ‐ ‘ 。 。 ‐ f ’ ． O ろ ‐ 季 『 、 ， 29.8330.1329.94[Z､TE120.4119.77 士1．59士2．64±2．78士0．33r2.38zigO．89 泳 動 量 0．10， katB H百両114.5515.8723.2421.0321.65 士0．93zizO.28izO．71gtO．35±0．20=tl．26 直 一 一 一 忽 一 、 0 ． 1 0 ， 臣ﾖｱ蚕114.9519.11 ±1．85士0．83士2．39 AhpC 10.209．6713.62

ahpC _{±1．58Etl.81zigO.90 /O.35*1.25±0．63ztO.78sigl．65zig2.16}10.838.8512．1910．1811．8013．11

0．0250， 図3RpoSの対数期からの生産とKatBの発現 KTLoxyR1AmoS(pahpC-moS):jpoSを欠損させたoUﾉRノ変異株にRpoS生産プラスミドを導入した株、 KTLoxyR1AmoS(pKT231)::"oS欠損させたo"Rﾉ変異株にpKT231(ベクター）を導入した株、 KIx.oxyR1(pKT231):WRI変異株にpKT231を導入した株。 RpoS、KatBおよびAhpC:各タンパクの免疫学的発色。泳動した菌体量(A600xml)を右端に示した。 "oS、AMBおよびα加C:各遺伝子の転写量。基準蛍光強度に達したサイクル数で示す。 LOGはA600nm値が1(対数期)、STはその6時間後（定常期中期)、O/Nは一夜培養。

K誠Bの発現には､RNAボリメラーゼのo因子であり定常期において産生されるRpoSが 必須である。KatBの発現におけるRpoSとOxyRの役割、および両者の関係性を明らかに するとともに、その発現に関与する他の因子の有無の検証を行うために、QXyRI変異株の "oSを欠損させた株にRpoS生産プラスミドを導入してKatBの発現を調べた｡叩oSをα"C のプロモーター(pα加C)の下流に挿入することで、o〃〃変異株で同遺伝子の強い構成的 な転写が対数増殖期から起きることが予想され､結果として対数期において叩oSの転写量 が著しく増加し、対数期から多量のRpoSを生産することに成功した（図3)。一方､肋/Bの 転写量については、対数期におけるRpoSの存在により叩oSと同様に著しい増加が認めら れた。対数増殖期におけるKa旧量は定常期に比べてやや低く、RpoS量との間に厳密な相 関はなかった｡対数増殖期のKatBもカタラーゼ活性をもつことから､対数期においてRpoS により転写される他の遺伝子産物の影響については現時点では検討していないが、OxyR の活性化とRpoSの存在がKa旧の発現における十分条件であることが示唆された。 6 プ ロ テ オ ー ム 解 析 KT株およびKT-oxyRl株を用いて二次元電気泳動による解析を行うことで､AhpC､KatA およびKatB量がoXyRノ変異により増加する事を確認するとともに、それら以外にoX)ﾉRノ 変異によって存在量の変化するタンパクがあるか否かを調べた。また両株の"oS欠損株に ついても同様に二次元電気泳動を行うことで､RI)oSの欠損により影響を受ける因子につい ても探索を行った（図4)。定常期後期の菌体を用いた場合、QXyR/変異の導入によって明 らかに細胞内濃度が上昇したタンパクは4種類あり、MALDI-TOF質量分析装置を用いた 解析の結果、KatA、KatB、AhpC、AhpF、およびチオレドキシン還元酵素であるTrxBで ある事が明らかになった。また、叩oSが欠損することによってKatBの存在量が著しく減 少することが確認された。さらにKT株においては、加oSの欠損によるKatA量の減少が認 められたが、これについてはKTLoxyRl株では確認されなかった。一方、o麺)ﾉRj変異条件下 で叩oSを欠損した場合に、PⅨ還元酵素であるAhpF存在量の著しい増加が確認された。 KT株ではAhpFの濃度が低いため、叩oS欠損株と明確な差は見出せなかった。 Ｓ ’○ つ︽ｐ “山 川洲 ○ ２ 判剛電 叩川口︾． 卜ＯＬ一二一．。 ︲●憐心鍋冬

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Ａ 図4QXyRI変異およびゆoSの欠損によるKatA、KatBおよびAhpFの存在量の変化 KT2442、KT2442A1poS、KT-oxyRlおよびKT-oxyRIAmoS株におけるKatA、KatBおよびAhpFス ポット周辺の拡大図。

α"Fはα伽cの下流に隣接して存在しており、オペロンを形成する両遺伝子間に存在す るステムループ構造によってαノlpFの発現が制限されていると考えられている。α"cと α加戸の発現量とその比率は、KILoxyR1株とそのゆoS欠損株で有意な差異はなく、叩oSが 欠損することによってAhpCとAhpFの過剰な蓄積が起こったことは、伽IBの転写レベル が減少することによる相補的な発現上昇を意味するものと考えられるが、この調節機構の 詳細は現在のところ明らかではない。 ［総括］ 本研究により、Rp加伽のOxyRはα幼C、加触および如虚のプロモーター上流領域に 存在する結合領域に結合することにより、各遺伝子の発現を転写レベルで調節することが 明らかとなった。OxyRは没〃"伽において3種の主要な過酸化物分解酵素遺伝子すべて の発現において中心的な役割を担っており、このような制御機構は他の菌種で見出されて いない。また、これまで没p加血のQXyR欠損株は得られていないが、このことは本株にお ける酸化的ストレス応答における役割の重要性と矛盾しない。しかし、過酸化物分解酵素 の発現は単にOxyRのみに依存するわけでなく、OxyR以外の調節因子の関与により特異的 にその発現が制御されることが明らかとなった。肋rBについてはRpoSの必要性が確認さ れたものの、α"Cと加触の調節機構に関するOxyR以外の因子についての詳細は、いまの ところ明らかではない。また、TⅨBの発現がOxyRにより制御を受けることが新たに明ら かとなり、卿Bについても転写開始点の特定によって、α伽c、加創および〃虚と類似性の 高いOxyR結合領域が存在することが明らかとなった。しかしながら、転写量および過酸 化物による誘導性において、これら3種の過酸化物分解酵素遺伝子とは異なる制御を受け ることが示されており、揖p加伽における酸化的ストレス応答に関与する遺伝子の発現制 御機構の多様性が明らかとなった。