脳虚血耐性現象におけるリン酸化STAT3 の脳保護機序への関与

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(1)● 新評議員. 脳虚血耐性現象におけるリン酸化 STAT3 の脳保護機序への関与八木貴＊，吉岡秀幸，木内博之. 要旨脳虚血耐性現象は，短時間の非致死的虚血負荷により，引き続く致死的脳虚血に対して強力な脳保護効果を誘導する現象として注目されているが，その分子機構は十分に解明されていない．我々は心筋虚血や癌細胞の細胞死の制御に重要な役割を果たす STAT3 に注目し，ラット一過性前脳虚血モデルを使用して脳虚血耐性現象へのその関与を検討した．虚血後，海馬 CA1 神経細胞においてリン酸化 STAT3（ser727）が誘導され，致死的虚血群では再灌流後早期（1 時間）に一過性に増加するのに対して，非致死的虚血群では再灌流後 8 時間以降に増加し，2 日目でピークを迎えた．阻害薬による STAT3 の活性化抑制は，虚血耐性現象の脳保護効果を減弱した．非致死的脳虚血後に海馬 CA1 神経細胞で誘導されるリン酸化 STAT3（ser727）の発現は，虚血耐性現象の脳保護効果獲得に重要な役割を果たしていることが示唆された．（脳循環代謝 26：233∼237，2015）. キーワード : 脳虚血耐性現象，一過性前脳虚血，STAT3，脳保護. 誘導する．これら STAT family のうち STAT3 は，心. はじめに. 筋虚血や癌細胞の細胞死制御に関わる強力な生存シグナルであることが知られているが，脳虚血の分野で. 非致死的な短時間の脳虚血負荷は，引き続く致死的. も，estradiol, angiotensin II type 1 receptor blocker や. 虚血負荷に対する耐性現象を誘導することが知られて. granulocyte colony-stimulating factor （G-CSF）の神経保護. いる1, 2）．この脳虚血耐性現象には，細胞生存に直接影. 作用における細胞生存シグナルとして重要な役割を果. 響する多数の経路が関わっていると推測されており，. たすことが解明されてきている5~7）．近年，この. 中でも extracellular signal-regulated kinase （ERK）3）や細. STAT3 が海馬培養神経細胞における虚血耐性現象に関. 胞生存シグナルの中心的役割をなす PI3k/Akt 経路の. 与することが示され8），脳虚血耐性現象での役割が注. 重要性が指摘されている．しかしながら，それらの下. 目されている．そこで本稿では，我々のラット一過性. 流シグナルや，制御機構などを含め，この強力な内因. 前脳虚血耐性モデルを用いた検討を中心に，STAT3 の. 性神経保護機構の獲得機序は未だ明らかではない．. 脳虚血および虚血耐性現象における役割を概説する．. 4）. Signal transducer and activators of transcription（STAT）. 脳虚血病態における STAT3 活性化と脳保護効果. family は，STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6 の 7 つで構成され，転写因子として機能し，細胞増殖，分化および生存などの過程を制御する．STAT は，非受容体型チロシンキナーゼである. 中枢神経系における STATs は不活性状態で存在す. janus kinase （JAK）によるリン酸化を受けて活性化さ. るが，外傷や虚血などの傷害時には，反応性に放出さ. れ，細胞質内から核内へ移行し，標的遺伝子の転写を. れる interleukin-6 （IL-6），leukemia inhibitory factor （LIF），ciliary neurotrophic factor（CNTF），G-CSF，. 山梨大学大学院医学工学総合研究部脳神経外科＊〒 409-3898 山梨県中央市下河東 1110 TEL: 055-273-6786 FAX: 055-274-2468. erythropoietin（EPO），insulin-like growth factor-I などの growth factor やサイトカイン，さらには傷害神経組織で産生されるフリーラジカルや，興奮性神経伝達物質 ─ 233 ─.

(2) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. などが JAK を活性化し，これによるリン酸化を受け. 脳虚血耐性現象における STAT3 の関与. て STATs が活性化される．前述の如く，STAT family は，STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6 の 7 つで構成されるが，これらは apoptosis の. 虚血耐性現象における STAT3 の細胞保護機序につ. 制御に重要な機能を有し，STAT1 は apoptosis 促進. いては，心筋の虚血において研究が先行している．非. に，STAT3, STAT5 は apoptosis 抑制に働くことが明ら. 致死的虚血負荷は，JAK1-JAK2 を介して STAT1 およ. かとなっている．このように，多種の STATs の相互. び STAT3 のチロシンリン酸化を誘導する．さらに. 作用により細胞死の制御が行われているが，この中で. protein kinase Cε-Raf1-mitogen-activated protein kinase. も STAT3 は中枢神経傷害後の神経細胞生存に影響す. （MAPK）/extracellular signal-regulated kinase kinase 1/2-. る key effector として注目されている．. p44/42 MAPK 経路を介して STAT3 のセリンのリン酸. 脳虚血病態においては，STAT3 が大脳皮質，線条. 化が誘導され，両者の経路の活性化が虚血耐性現象で. 体，海馬における種々の細胞（神経細胞，アストロサ. 発現する関連遺伝子の完全な転写活性化に必要と考え. イト，マイクログリア，血管内皮細胞）で活性化され. られている14）．一方，最近になって，脳虚血の耐性現. る5, 9, 10）．一般に，STAT3 のリン酸化は，神経細胞で. 象においても，in vitro の研究ながら，oxygen glucose. は傷害後 0.5∼24 時間に，アストロサイト，マイクロ. deprivation （OGD）モデルで，STAT3 のセリンのリン酸. グリアおよび血管内皮細胞では 24 時間以降にみら. 化が神経保護機序に関わることが示された8）．そこで. れる．. 我々は，ラットを用いた一過性前脳虚血モデルにおい. 神経細胞における STAT3 の活性化動態とその意義. て，虚血再灌流後の海馬 CA1 の STAT3 のリン酸化の. については，ラット一過性局所脳虚血モデルでよく検. 動態と虚血耐性現象での役割を検討し，Western blot. 討されており，虚血中心部では虚血早期に発現が増幅. と免疫組織染色の双方において，再灌流後に STAT3. し，再灌流後 3.5 時間でピークとなる．また一方で，. のセリンのリン酸化が誘導されることを示した15）（図. ペナンブラ領域では，再灌流後 24 時間でピークとな. 1, 2）．さらに，そのリン酸化は，3 分間の非致死的虚. り，虚血の程度によってその活性化動態に差があるこ. 血では，虚血再灌流後 8 時間以降に発現が上昇し，48. とも報告されている．これまでの動物モデルを用い. 時間後にピークとなったが，5 分間の致死的虚血では. た多数の研究結果より，神経細胞での活性化 STAT3. 再灌流後 1 時間にピークが来ており，発現動態に差が. は神経保護的に作用していると考えられ，リン酸化. あることも明らかとした．一方，3 分虚血を負荷して. 9）. STAT3 が神経細胞マーカーの MAP-2 や抗アポトーシ. 虚血耐性を獲得した脳では，5 分間虚血後 1 時間で，5. ス蛋白の bcl-2 と共局在することから，その機序とし. 分虚血単独負荷（致死的虚血）群と同様にリン酸化. て，アポトーシスの制御が想定されている5, 6, 9）．. STAT3 の発現が上昇したが，致死的虚血群と比較して. グリアにおけるリン酸化 STAT3 の発現増幅は虚血. 7 日後の晩期まで発現が維持されていた（図 1 B）．非. 再灌流後 24 時間以降数日間に渡って維持されるが，. 致死的虚血負荷後の STAT3 の活性化動態は，虚血耐. このことから，STAT3 が脳虚血後に遅発性に生じる炎. 性が獲得される虚血後 24 時間以降から数日の時間経. 症反応にも関与していることが推測される11, 12）．神経. 過2）と一致していた．さらに preconditioning の直前に. 細胞とグリアは，代謝や栄養供給の点で密接に相互作. STAT3 阻害薬を脳室内へ投与すると，リン酸化. 用しているため，脳虚血時のグリアにおける STAT3. STAT3 の虚血後発現増幅が抑制され，虚血耐性による. 活性化が間接的に神経保護的に作用している可能性も. 脳保護効果の減弱を認めた（図 3）．これらの結果よ. 考えられる．. り，非致死的虚血後に海馬 CA1 神経細胞でみられる. 血管内皮細胞での STAT3 の発現が心筋の虚血性障. リン酸化 STAT3 の発現増幅は，虚血耐性現象の脳保. 害における細胞保護を司っている可能性が示唆されて. 護効果獲得に重要な役割を果たしていることが示唆さ. いるが，脳虚血病態での動態や役割は未だ十分に検討. れた15）．. 13）. されていない．最近，脳微小血管，アストロサイトお. おわりに. よび神経細胞を一つの機能構造体とする neurovascular unit の概念が提唱され，これを標的とした治療戦略の必要性が強調されているが，このように脳虚血病態時. 我々の検討から，一過性前脳虚血後にラットの海馬. の各細胞における STAT3 の活性化とその意義につい. CA1 神経細胞に誘導されるセリンリン酸化 STAT3 が. ての解明は始まったばかりであり，今後の更なる検討. 神経保護的に作用していることが明らかとなった．今. が待たれる．. 後，神経細胞のみならず，グリア細胞や血管内皮細胞 ─ 234 ─.

(3) 脳虚血耐性現象におけるリン酸化 STAT3 の脳保護機序への関与. 図 1．一過性前脳虚血後の海馬 CA1 でのリン酸化 STAT3（ser727）の発現 A：虚血後海馬 CA1 サンプルの western blot 解析代表例．一過性前脳虚血後にリン酸化 STAT3 （ser727）の発現が亢進する． B：定量解析では，虚血の程度によりリン酸化 STAT3（ser727）の発現動態が異なり，5 分の致死的虚血では再灌流後 1 時間でピークとなるのに対し，3 分の非致死的虚血では遅れて発現が亢進し 2 日でピークとなる（＊ P<0.01，＊＊ P<0.05，Sham と比較）．Preconditioning 後の 5 分の致死的虚血では，再灌流後早期にピークとなるが，致死的虚血群と比較し晩期まで発現増幅が維持されている（＃ P<0.05，5 分虚血群と比較）（文献 15 より改変）．. 図㻝㻌. 図 2．非致死的虚血後の海馬 CA1 におけるリン酸化 STAT3（ser727）の局在 A：3 分間の虚血負荷後，海馬 CA1 でリン酸化 STAT3 （ser727）の免疫組織学的反応がみられ，虚血再灌流後 2 日で最も強い．スケールバー 50 μm． B：海馬 CA1 部の二重免疫染色．3 分間の虚血負荷後 2 日目では，リン酸化 STAT3 （ser727）は神経細胞（NeuN 陽性）で発現が亢進し，アストロサイト（GFAP 陽性）では発現がみられない．スケールバー 50 μm （文献 15 より改変）．. 図㻞㻌. を含めた neurovascular unit での検討が必要ではあるも. 文献. のの，STAT3 は脳保護治療の重要なターゲットとして. 1） Kitagawa K, Matsumoto M, Tagaya M, Hata R, Ueda H,. 期待される．. Niinobe M, Handa N, Fukunaga R, Kimura K, Mikoshiba K:‘Ischemic tolerance’phenomenon found in the brain. Brain Res 528: 21–24, 1990 ─ 235 ─.

(4) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. 図 3．STAT3 阻害薬が虚血耐性現象の脳保護効果へ与える影響 A：STAT3 阻害薬の脳室内投与により虚血再灌流後のリン酸化 STAT3 の発現が抑制される． B：Preconditioning 前の STAT3 阻害薬投与により，虚血耐性群と比較して TUNEL 陽性細胞の増加を認める．C：TUNEL 陽性細胞の定量解析では，STAT3 阻害薬の投与は用量依存的に虚血耐性による脳保護効果の減弱を示した（＊ P<0.01，5 分虚血群と比較，＊＊ P<0.05，vehicle と比較）．スケールバー（a）200 μm，（b, c）20 μm．（a, b, d, e, g, h, j, k）TUNEL 染色，（c, f, i, l）cresyl violet 染色（文献 15 より改変）．. 図㻟㻌. 2） Kitagawa K, Matsumoto M, Kuwabara K, Tagaya M, Oht-. receptor after transient focal ischemia in mice brain. Neu-. suki T, Hata R, Ueda H, Handa N, Kimura K, Kamada T:. rosci Res 61: 249–256, 2008. 'Ischemic tolerance' phenomenon detected in various brain. 8） Kim EJ, Raval AP, Perez-Pinzon MA: Preconditioning. regions. Brain Res 561: 203–211, 1991. mediated by sublethal oxygen-glucose deprivation-induced. 3） Shamloo M, Rytter A, Wieloch T: Activation of the extra-. cyclooxygenase-2 expression via the signal transducers. cellular signal-regulated protein kinase cascade in the hip-. and activators of transcription 3 phosphorylation. J Cereb. pocampal CA1 region in a rat model of global cerebral. Blood Flow Metab 28: 1329–1340, 2008. ischemic preconditioning. Neuroscience 93: 81–88, 1999. 9） Suzuki S, Tanaka K, Nogawa S, Dembo T, Kosakai A,. 4） Yano S, Morioka M, Fukunaga K, Kawano T, Hara T, Kai. Fukuuchi Y: Phosphorylation of signal transducer and. Y, Hamada J, Miyamoto E, Ushio Y: Activation of Akt/. activator of transcription-3 (Stat3) after focal cerebral. protein kinase B contributes to induction of ischemic tolerance in the CA1 subﬁeld of gerbil hippocampus. J Cereb. ischemia in rats. Exp Neurol 170: 63–71, 2001 10） Planas AM, Soriano MA, Berruezo M, Justicia C, Estrada. Blood Flow Metab 21: 351–360, 2001. A, Pitarch S, Ferrer I: Induction of Stat3, a signal trans-. 5） Dziennis S, Jia T, Rønnekleiv OK, Hurn PD, Alkayed NJ:. ducer and transcription factor, in reactive microglia fol-. Role of signal transducer and activator of transcription-3. lowing transient focal cerebral ischaemia. Eur J Neurosci. in estradiol-mediated neuroprotection. J Neurosci 27: 7268–7274, 2007. 8: 2612–2618, 1996 11） Suzuki S, Tanaka K, Suzuki N: Ambivalent aspects of. 6） Komine-Kobayashi M, Zhang N, Liu M, Tanaka R, Hara H,. interleukin-6 in cerebral ischemia: inflammatory versus. Osaka A, Mochizuki H, Mizuno Y, Urabe T: Neuroprotec-. neurotrophic aspects. J Cereb Blood Flow Metab 29: 464–. tive effect of recombinant human granulocyte colony-. 479, 2009. stimulating factor in transient focal ischemia of mice. J. 12） Yi JH, Park SW, Kapadia R, Vemuganti R: Role of tran-. Cereb Blood Flow Metab 26: 402–413, 2006. scription factors in mediating post-ischemic cerebral. 7） Miyamoto N, Zhang N, Tanaka R, Liu M, Hattori N, Urabe T: Neuroprotective role of angiotensin II type 2 ─ 236 ─. inﬂammation and brain damage. Neurochem Int 50: 1014– 1027, 2007.

(5) 脳虚血耐性現象におけるリン酸化 STAT3 の脳保護機序への関与. 1 and 3 and induction of cyclooxygenase-2 after ischemic. 13） Solaroglu I, Tsubokawa T, Cahill J, Zhang JH: Anti-apop-. preconditioning. Circulation 112: 1971–1978, 2005. totic effect of granulocyte-colony stimulating factor after focal cerebral ischemia in the rat. Neuroscience 143: 965–. 15） Yagi T, Yoshioka H, Wakai T, Kato T, Horikoshi T, Kinouchi H: Activation of signal transducers and activa-. 974, 2006 14） Xuan YT, Guo Y, Zhu Y, Wang OL, Rokosh G, Messing. tors of transcription 3 in the hippocampal CA1 region in a. RO, Bolli R: Role of the protein kinase C-epsilon-Raf-. rat model of global cerebral ischemic preconditioning.. 1-MEK-1/2-p44/42 MAPK signaling cascade in the acti-. Brain Res 1422: 39–45, 2011. vation of signal transducers and activators of transcription. Abstract Activation of signal transducers and activators of transcription 3 in the hippocampal CA1 region in a rat model of global cerebral ischemic preconditioning Takashi Yagi, Hideyuki Yoshioka, and Hiroyuki Kinouchi Department of Neurosurgery, Interdisciplinary Graduate School of Medicine and Engineering, University of Yamanashi, Yamanashi, Japan The signal transducers and activators of transcription (STAT) were found to be essential for the regulation of apoptosis and cell death initiated by a pro-survival signaling cascade. In focal cerebral ischemia, STAT3 tyrosine 705 phosphorylation has been demonstrated in neurons and activation of STAT3 is correlated with neuronal survival. However, the precise role of STAT3 serine phosphorylation remains unclear. In this study, we examined the phosphorylation status of ser727-STAT3 in the hippocampal CA1 region by using a rat transient global ischemia model. Western blot analysis showed that ser727-STAT3 phosphorylation was induced in hippocampal CA1 neurons after ischemia. Ser727STAT3 phosphorylation transiently increased in the early stage of reperfusion after lethal ischemia, in contrast, it gradually increased in a time-dependent manner and peaked at 2 day after nonlethal ischemia. In the preconditioned brains, it also increased in the early stage of reperfusion, however, decrease of its levels delayed compared to the nonconditioned brains. Furthermore, inhibition of STAT3 phosphorylation abolished preconditioning-induced neuroprotection. Our results suggest that activation of ser727-STAT3 after nonlethal ischemia is closely associated with acquisition of ischemic tolerance. Although further investigation is necessary to clarify the exact role of STAT3 serine phosphorylation in neuroprotection, STAT3 can be an important target for stroke therapy. Key words: ischemic preconditioning, transient global cerebral ischemia, neuroprotection. ─ 237 ─.

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