幼生研究のための小テクニック集(1) : サンプル観察についてのFAQ

幼生研究のための小テクニック集

(1)

サンプル観察についての

F A Q

小 西 光

一

日々の研究活動の中で必要不可欠であるのに意 外に情報が得にくいものがある. その代表が日常 的に研究者が行っている小さなテクニックあるい はヒント，俗に 『小ワザ』 とか 『裏ワザ』 と呼ば れるものではないだろうか? 論文を読んだり，あ るいは講演を聞いたりして，いざ自分が同じこと をや ってみようという場合に， 実際の話，同じ機 器を使うにしてもそのちょ っとした使い方などは 論文の字面からは分からない場合が多い. これら の小テクニックはその研究室の伝統 ・性格とか 個々の研究者によって創意工夫される個別性が高 いものなので，あえて教科書や論文に記述される ことはまれである . このような小 テクニックは研 究活動の潤滑油的な働きをし ているだけでなく， 見えない土台として ，想像す る以上に研究本体を 支えているのではないだろうか? また ，学会の発表以外の懇談の場において ，そ の結果は具体的には何を使い，どうや って得たの か? との質問をしたり逆に受けることも多々あ る. 学会では発表会場以外の「休憩室」や「談話 室」やらが大切な情報交換の場になるのもこの様 なことが一因と想像される. そのような場で乱雑 に書 きとめたメモが，整理された論文ファイル よ りも役立つことは良く経験するが，これらを使い やすくまとめたパンフレ ッ トがあれば助かるのに と感じたことはないだろうか? そこで，エピ ・カニ類幼生に関する研究活動に おいて質問が多く，かつ活字にされる機会の少な い事柄について ， 日頃使 っている 小テクニ ック情 報を提供することを考 えた. その手始めとして， 今回はサンプルを 固定し観察する過程で実際に遭 遇するいくつかの事項について良くある質問集

Kooichi K ONISHI: Miscalleneous techniques for stu dies on decapod larvae (1) F A Qs on observation of larval specimens (F A Q) のかたちで紹介したい.

1.

固定について

0 1

固定液は何が良いか 7

A 1 :

3 - 5 %

の中性ホルマリンが実用的. 種々の固定法が知られているが， 一般的には

3

- 5 %

の中性化 したホルマリンによる固定と保存 が最も 実用的と思われる.

50%

程度のエチレング リコールも良いが，光学顕微鏡での観察以外には ほとんど使えず，万一組織切片等が必要にな って も流用しにくいのが難点である. またホルマリン は薬品として入手しやすくかっ安価であ る. ただ し，そのままではギ酸を含んでいて酸性が強い の で，中性化のために炭酸カ ルシウム， 炭酸マグネ シウムまたはホウ砂を入 れて振とうし， 一晩静置 した後の上澄みを原液として用い る. 問題点はホルマリン液中に長期間サンプルを入 れておくと次第に脆くなることである . そこでデ ータを取り終えた後に長期保存する場合 には，サ ンプルを 一度純水で‘洗 った後に

70%

程度のエタノ ールに移しかえることにしている. それではその 目安とは どの位の時間かということになるが，筆 者は小型 の幼生サンプルでは経験上数カ月一

l

年 としている . くり返しになるが，組織切片や電子顕微鏡観察 を目的とする場合にはそれぞれ適切な固定液が必 要であるし ，最近の P C R 等による D N A 解析のた めには，最初から 純エタノールで固定しておかな ければならない. 0 2 : どの様に保管するか ? A 2 小型瓶に入れて冷暗所に保存する. 入れ物としてはサンプルの大きさと量による が，一般の幼生であれば容量10 - 5 0 m eのガラス製 スクリュー瓶が使いやすい. た だし，口径が策部

で狭くなっていないものがサンプルの出し入れ上 は良い (図 1). 色素胞な どの退色を少しでも 押 さえるために は冷暗所で保管した方が良い. この ために褐色容器に入 れたりアル ミホイルで包み遮 光する場合もある. ただしこれでも数ヶ月が限度 と考えておいた方が良い. 液浸のサンフ。ルで、注意すべきは保存液の蒸発と サン プルデータの消失である. 前者について特に エタノール類は時々点検すべきであり ，万ーを考 えて 5 0 % グリセ リンを数滴添加しておくと致命的 な乾燥を防止 出来る. 後者については，鉛筆ある いは墨でデータを記入した和紙なとεの小紙片を瓶 に入れておくと ，瓶のラベルなどが取れたりした 場合に役立つ. 筆者の経験では ，鉛筆 ・墨と 和紙 の組み合わせは相当な長期間にわたって消失する ことのない優れた記録媒体であると思う. 最近の幼生研究では論文化する場合にその形態 記載に用いた証拠サンプル

(voucher spec imen)

をしかるべき公的機関 に登録 ・保管することが勧 図 1 サンプルの保存に用いるスクリュー瓶の例. 左 の様に口径が小さいと先細ピンセ ットでも底ま で届かないので注意. められている. いずれにしても標本とは観察 ・分 析されるためにあるのであり，固定したまま放置 するものではない. 最良の保管法とはすみやかに データ 化 して論文等で公表することではないだろ

うかつ

2 .

解剖について

Q

3

: どんな道具で解剖するのか?

A 3:

極細の針，ピンセ ッ ト，ピペッ トが基本. 微小な解剖においては「つまむJ. i切るJ. i移 すJ という基本動作から成 っている. これらの動 作は互いに重復する部分も多いが，それぞれに先 端が極細のピンセ ッ ト，針，およびピペットが対 応している. ピンセットは市販の先細のものの中 から自分の指力に合ったコシの強さの製品を選ぶ ことが大切である. これを必要に応じてさらに砥 石で研いで細くする . 微細針については極細 (00 番) の昆虫針をさらに製図器機用オイ ルストーン で研いで細くしたものを 竹串の先端 に挟んで使っ ている . またタングステン 線の先端 を薬品で溶か して極細の針を作り ，同様 に使う . 図 2 にこれら の針を比較のために並べてみた . ピペ7 卜はサン プルの大きさに応じて，容量1

me

位の市販パスツ ールピペッ トやマイクロピペットの使用済みチッ プ( 容量は

1 - 5

me

位) を 加工して使 っている . その他. 11艮科用の微小鉄もあれば重宝するが， 手作りであるためにかなり高価である .

A

B

C

¥ ー

D

図 2 解剖に用いる微細針の例. 上から，一般の解剖 針 (A )，昆虫針 (8 )，タンクステン線を加工 したもの (C). 比較のためのヒ卜の毛髪 ( D ). 左上のスケールは 1.0mm.

0 4 :

どう すれば‘微細な解剖が出来るのか

7

A 4 大きいサンプルから始めて徐々に小さく. これは最も良く質問されることの一つであり ， またこれこそが幼生研究において 他の手段で置き 換えられない部分である . 一言でいえば練習しか ないが，その場合成体の基本体制を頭に入れてお くと良い. 相手にする物の「っくり」があらかじ め分かっていると非常に作業がはかどるものであ る. また基本的に十脚 甲殻類において幼生の体の っくりは成体の簡略あるいは縮小型で、ある . した がって最初は自分が扱えそうな 大きさのサン プル で練習をして慣れたら徐々に よ り小さいも のに移 行することを勧める . その場合，最初は意図して 太田の針で練習すると良い. 確かに結果として米 粒に字を書くよりも細かい作業をすることになる のであるが，実体顕微鏡下で行うのであるからそ う難しいことではない.

0 5

: プレパラー卜はどうするのか?

A 5

解剖・観察ごとに一時的に作成する. 筆 者 は永久 プ レパラー卜は作 らない方針であ る. あらかじめシリコンで援水コートしたスライ ドグラス上に適量の水を滴下し( 図3)，そこに 細いピペット，ピンセットあるいは微細針で解剖 後の微小サンプルを移す. 次にゴム粘土の小球 を 四隅に付けたカバーグラスを静かに上からかぶせ (図4 )，ついで必要に応じてこのカバーグラスを 水平方向に動かしながら，サンプルを転がしてち ょうど見やすい方 向 に向け る( 図5). 解剖と観 察に使用した後の付属肢等は，再びピペッ トや微 細針などにより 1つの標本瓶に戻して保存する. 図3

t

鑓水コートしたスライドグラス (A ) と通常の スライドグラス (8 ). 後で必要になったら ， ここから取り出してくり返 して使用出来る rわずか数十 ミクロンの物を選 んで扱えるのか? J と言 われるかも知れないが， これも慣れてしまえば難しい事ではない. 永久ま たは半永久プレパラートにするよりは，経験上こ のやり方の方が現実的であると思う . 図4 カバーグラスの四隅に粘土を着ける作業 (上) と一時プレパラー卜 (下). サンプルの厚さに よってかき取る粘土の量を加減するのがポイン 卜. 図 5 サンプルのオリエンテーション (方向出し ). 指先でカバーグラスをわずかに動かしながら中 のサンプルを転がし，見やすい位置にする.

図 6 ゾ工ア幼生の第 2 顎脚内肢 (左 ) と，その脱皮 殻 (右). 明 らかに脱皮殻の方が観察しやすい. いずれも中性ホルマリンによる固定.

3 .

検鏡について

0 6

サンプルが不透明で見にくいが? A 6 脱皮殻カずあればそれを用いる . 幼生の形態を観察する場合に， 脱皮殻が良く 使 われていることは意外 に知 られていない. 幼生の 体はそのままでは中身が詰ま って いるので，透過 光では見づらく， K O H 等の処理あるいはエチ レ ングリコールでの固定によっても完全に透明化 す る訳ではない. そこで，中身のなくなった脱皮殻 を使えばこの問題は解消する( 図6 ). 必要に 応

A

i 1

r [

図7 スライドクラスの裏返し観察の ための方法. 通 常の顕微鏡観察 (A ) と裏返し観察 ( B )，お よび実際の写真 (C ). 裏返し観察の ではスラ イド グラスの厚さと対物レ ンズの作業距離の関 係上，

20

倍まで が限界である. じてメチ レンブル一等で染めてから検鏡すると見 やすい場合もある. ただし ，触角の感覚毛や関原 基などの生時に柔らかい部分では使えない. さら にデータとして使える脱皮殻が得られるのは ，ふ 化飼育している場合だけである .

0 7

サンプルの裏側を見るのには?

A

7

プレパラー卜の裏返し観察をする. 観察するものが不透明の場合には表だけでなく 裏からも見る 必要 が出てくる . このためにはちょ っとした工夫が必要となる . 対象サ ンプルが球状 あ るいは 円柱状であれば，前出 図5の様にして見 れば良いが，平板状であるとこの方法が使えない. そこで サ ンプルを裏返して見る必要性が出て来 る. 筆者は図7に示したようにやや大きめのスラ イドグラスにゴム板の小片を貼り付けた 小道具を 用いている. ただし裏返した場合には ， スライド グラスはカバーグラスの十倍以上厚いので，作業 距離の関係上

i20

倍の対物 レンズまで」が限度で ある . マイクロスライドという ，一種の属平なガ ラス管に試料を吸い込んで検鏡する場合 もある.

0 8

付属肢のタイプが判別しに くいが‘?

A 8

: 微分干渉顕微鏡で剛毛を判別する. 近年は付属肢等の剛毛の種類とその分布を見る

B

•

l 1 1

E

のがスタンダードとなりつつある. しかしこれら 剛毛は複雑な形状のものが多くて判別しにくいも のである. 走査型電子顕微鏡もも ちろん良いが， 手間と時間それに経費を考えると定型業務におい ては非現実的である . こ の様な場合に顕微鏡にノ マルスキー微分干渉装置を付けて観察すると， 剛 毛上の枝赫の状態が見やすくタイプ分けがしやす いことが多い. ただしこの装置もかなり高価なの が一般での使用におけるネックかも知れない. 一般的には ，顕微鏡のコンデンサーを調節して 焦点深度を浅くし， 剛毛の根元から先端までその 表面の状態を順次追 っていくのがコツである .

0 9

休の大きさはどこで測るのか? A 9 頭胸甲の長さで浪IJる場合が多い. 最も変形の少なくてかつ測りやすい部位を選ぶ のが原則である .頭胸甲の形状によ って異なるが， エビやヤドカリの幼生ならば額角から中央後縁ま での距離 を頭胸甲 長として( 図8 A ， B ) ，またカ ニでは額赫と背赫の聞の距離で示す場合が多い (図

8 D).

図

8 C

の様に額角から後側縁先端まで の距離であると ，頭胸甲 が偏圧されたり ねじれて いたりすることが多くて多数のサンプルを計測 出 来ない. いずれにしても ，論文ではどの様な部位 で計測したのかについて図示しておくと良い. 図8 幼生の大きさの計測例. 左は工ビ・ヤドカリ類 の， 右はカニ類の一般的 なゾ エアの頭胸甲を示 している.

010:

どの位の数を見れば良いか7

A

10:

少なくとも

5

個体で変異の有無を確認. もちろん数が多ければ良 いし，また ふ化飼育の サンプルであれば複数の親に 由来するもので検討 するのが望 ましい. しかし ，サ ンプルの解剖 ・検 鏡にはかなりの労力と時間を消費するので，現実 との兼ね合いとなる . どの場合でも個体問の形態 変異はどこかのレベルで存在するが，経験上では 最低5個体見ておけば良いと思われる . 参考まで に剛毛数での経験を述べると，もし変異がある場 合には2 個体，極端には 同一個体の左右の付属肢 同士でも 変異が見られるが，ない場合には

5

個体 の左右つまりサンプル数10でも見られないことが 多い. 上記の長さの問題と も関連す るが，論文で のデータは単に平均値を書いただけではなくて ， 可能な限り多目のデータに基づいた平均値と範囲 ( 最大値，と最小値)，およ び標準偏差が示されて いるものがこれを 利用 しようと す る者にと っては 有益である . 以上10項目に分けて述べてきたが，これらは本 来が属人的なものであり ，活字 になるほどのまと ま りはないかも知れない. 筆者としては ，これ ら を一つの素材として参考にして頂き，さらに良い 小 テクニックがあれば公開 して頂ければありがた し、 ( 養殖研究所)