日南乳動物ミトコンドリアのバイオジェネシスに関する基礎研究
履 歴 書
論 文 目 録
論 文 内 容 要 旨
様 式
6
給
文
目
録
報 告
甲 薬
第
GJ
号
氏 名
姫 田 敏 樹
番 号
学位輪文題目￨日甫乳動物ミトコンドリ
アのバイオジェネシスに関する基礎研究
公刊槍文
Gene E
x
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b
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Sangawa，
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T
.，
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H
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， T.よB
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ol
.Chem. 2
7
2
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6034-6037 (
1
9
9
7
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344 R
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K
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Ara
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H
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i，
T
.
Eur
.
よB
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h
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m
. 267
，
6938-6942 (
2
0
0
0
)
公刊参考論文
S
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Ca
2+
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Ueyama，
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H
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M.，
Himeda
，
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，
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H
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S
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Kuagawa，
K
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.
(
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(
2
0
0
1
)
そ の 他 ( 総 説 ・ 単 行 本 等 )
C
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Gene E
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Mamrnalian H
七ATPs
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H
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，
Himeda，
T
.，
Koto，
Y
.
and Morokami，
K
.
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M
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(
K
a
j
i
y
a
r
n
a
，
T
.，
e
d
)
pp362
司366，
Fukuoka (
1
9
9
8
)
ミトコンドリアのバイオジェネシスーその分裂と融合「新ミトコンドリア学
J
姫田敏樹，樋口富彦
(内海耕憧
・井上正康監修，共立出版，印刷中) (
2
0
0
1
)
V.A.2，mRNAの単離精製， V
.
A
.
3
-
a，5'RACE法による mRNAの 5
'末端領域の解析， V.A.3-b，
3'RACE法による mRNAの3'末端領域の解析， V
.
B
.
3，
mRNAの 絶 対
量
の定量， V.E，
Genetyx
とゲノムネットによる遺伝子の解析，
姫田敏樹，樋口富彦
V
.
C
.
1，
CATアッセイ， V
.
C
.
5，ゲルシフトアッセイ法，
武田京子，姫田敏樹，樋口
富 彦
V.D.
4
，サブトラクション法による生理機能に関わる遺伝子の解析，
新垣尚捷，姫田敏樹
付録，分子細胞生物学な関連したデータベースの有用なサーバ紹介，
姫田敏樹
様 式
7
報 告
甲 薬 第
番 号
論 文 内 容 要
ヒ2 回63
号
氏 名
姫 田 敏 樹
学位論文題目
I
~甫乳動物ミトコンドリアのバイオジェネシスに関する基礎研究
内容要旨
ミトコンドリアは，これまでラグビーボールあるいは葉巻状の形をしたも
ので，外膜とマトリックス内に入りくんだ内膜からなり，また，ある程度大き
くなるとその中程に内膜の隔壁を形成して
2
分裂する方式でミトコンドリア数
を増生させると考えられてきた.しかし最近，全てのミトコンドリアが融合し
た網状体が観察されたり，クリステは内膜が単純に入り込んだものでないこと
が明らかにされてきたことから，長く保持されていたこれまでの絵図や説明が
間違っていることが明かとなってきた
.
つまり，ミトコンドリアの研究は，そ
の概念を改めて考察すべき時期を迎えたといえる.
そこで本研究では，ミトコンドリアの中でも中心的な働きを担っている
ATP
合成酵素と，心筋細胞においてミトコンドリアの異常な増殖が確認される
ハ
l
S
マウス
(
J
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S
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u
s
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)
に着目し，ミトコンドリアのバイ
オジェネシスの解明を目的として，以下の
2
つのテーマから解析を行った.
1
.
ATP
合成酵素の分子構築における分子シンク口ナイゼイション現象の発見
哨乳動物のミトコンドリアの
ATP
合成酵素は
1
6
種のサブユニットが一定
の化学量論比で構築された世界最小の分子モーターで，
ATP
合成反応を触媒す
る
F，と，エネルギ一変換反応に携わる F
o
' そしてこの 2つのセグメントをつ
なぐ
s
t
a
l
k
で構築されているが，これらを構成するサブユニットの発現制御機
構は，いまだ明らかにされていない.そこで本研究では，
ATP
合成酵素の核遺
伝子にコードされたサブユニットの転写レベルにおける制御システムを明らか
にすることを目的とし，
F
o
'
s
t
a
l
k
に属するサフユニット
7
種と
F
，
の
s
s
u
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t
，
そして活性制御因子である
I
F
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A
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t
o
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e
i
n
)
の全
9
種について転写
物量の解析を行った.その結果，これら
9
種のサブユニットの
m
R
r
吋
A
は大部
分心臓において最も多く発現しているが，これら
mRNA
の分子モル比は，脳・
肝臓・心臓・
腎
臓の
4
種の臓器にお
い
て，全く同
一
の割合で発現されているこ
i
とが初めて明かとなった.この発現パタ
ー
ンは
，
2~
90
週齢ラットにおいても
一
定
に
保持されていることが明らかとなった.これは，
ATP
合成酵素サブユ
ニットを一定の割合で発現するための
3転写レベルでの分子シンクロナイゼイ
ションシステム“ジ-ンシンクロナイザ"の存在を強く示唆している.
2
.
ミトコンドリアの分裂・融合・分配に関わる新規因子の探索
全身性カルニチン欠乏マウスである
JVS
マウスの心筋細胞では，ミ
ト
コン
ドリア数が細胞質の大部分を占めるほど劇的に増加していることが知られてい
る.この事実は，
JVS
マウスの心筋細胞では，ミトコンドリア数の増加を引き
起こす制御因子が正常マウスのそれに比し極端に多く発現していることを示し
ている
.
また
，
ATP
合成酵素サブユニットの転写量および組織特異的発現パタ
ー
ンを調べたところ，
JVS
マウスと正常マウスとの聞に違いは認められなかっ
た.このことは
ミトコンドリアの増加にその構成成分の増減は伴っていない
ことを示しており
ミトコンドリアの増殖にはその構成成分の発現とは独立し
た増殖制御機構が存在することが示唆されてきた.
そこで，ミトコンドリア数の増加を引き起こす制御因子を明らかとするた
め，蛍光
D
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f
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n
t
i
a
lD
i
s
p
l
a
y
法を用いて
JVS
マウスと正常マウスで発現してい
る
mRNA
の差を解析した.その結果，現段階でミトコンドリアの増殖に関与す
る可能性のある新規遺伝子を 6種得ることに成功した.とれらの因子の完全長
cDNA
クローニングを行なうとともに，これらの因子がミトコンドリアにどの
ような影響を及ぼすかを調べるために，ミトコンドリア輸送ペプチドを融合さ
せた蛍光タンパク発現ベクターと共にこれらの
DNA
断片を培養細胞中にトラ
ンスフェクトして，生細胞中におけるミトコンドリアの動態変化をタイムラプ
スデコンボリュ
-
ション
CCD
蛍光顕微鏡下で直接観察することを考え，その
実験系を確立させた.
今後
，
0
甫乳動物のミトコンドリアの分裂・融合と娘細胞への分配の分子メ
カニズムが解明されることが期待される.
P
甫乳動物ミトコンドリアの
バイオジェネシスに関する基礎研究
2001
姫 田 敏 樹
日南乳動物ミトコンドリアの
バイオジェネシスに関する基礎研究
2001
目
;
欠
第
3
章
ミトコンドリアが異常増殖した
JVS
マウス心筋からの
ミトコ
ン
ドリアの分裂・融合と娘細胞への分
配
に関わる新規因
子の
探
索
3
.
1
諸 言
33
第
1章 緒 言
.
1
第
2
章
H
+
-ATP
合成酵素の分子構築における
遺伝子制御の分子シンク口ナイゼイション現象の発見
3
.
2
実 験 結 果
3
.
2
-
1
H
+
-ATP
合成酵素の各サブユニット遺伝子の転写発現量の定量
.
.
.
3
7
3
.
2
-
2
JVS
マウスの心臓における特異的発現遺伝子の検出
3
9
2
.
2
実 験 結 果
2
.
2-
1 m
悶ぜ
Aの定量法の開発
2
.
2
-2
プローブの作製.
.
.
.
8
3
.
2
-
3
特異的発現遺伝子断片の抽出
・
精 製 .
3
.
2
-
4
単離した特異的発現遺伝子断片のシークエンス決定
•
3
.
2
-
5
JVS
マウス
・
正 常 マ ウ ス の 心 筋 細 胞 由 来
cDNA
ラ
イ
ブラリーの作製
3
.
2
-
6
タイムラフスデ
コ
ンボリューション
CCD
蛍光顕微鏡
を用いたミト
コ
ンドリア観察系の確立
4
1
2
.
1
諸 言
5
4
3
4
6
9
2
.
2
-3 J
n
V
Itr
o
転写システムを用いた
mRNA
の合成
2
.
2
-4
p
o
l
y
(
A
r
R
N
A
の精製
•
2
.
2
-
5
ドットプロッティング法による
mRNA
の定量
.
1
0
48
.
1
1
3.3
考 察
.
S
l
1
2
2
4
3
.
4
実 験
方
法
3
.
4
-
1
蛍光
D
i
低r
e
n
t
i
a
lD
i
s
p
l
a
y
法
3
.
4
-
2
2
n
d
PCR
および
H.A
.
-
Y
e
l
l
o
w
による分離
3
.
4
-
3
シーク工ンス反
応…
.
S3
2
.
3
考 察
1
7
2
.
4
実験方法
2
.
4
-
1
実験動物
2
.
4
・2
J
n
V
j
t
r
o
転写系による
RNA
の合成
2
.
4
-
3
組織からの
m貯
~
A
の精製
.
.
2
.
4
-
4
ドットブロッティング.
.
.
.
S3
.
5
3
2
4
3
.
4
-
4
cDNA
ライブラリーの作製
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
・
…
.
.
.
.
.
.
.
.
.
5
4
2
4
3
.
4
-
5
p
D
s
R
e
d
1
-
M
i
t
o
v
e
c
t
o
r
の
C
2
C1
2
細 胞 へ の ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン … …
.
5
4
2
5
2
.
4
-
5
ハイブリダイゼ-シヨノ
3
.
5
参考文献
S
5
2
5
2
.
5
参考文献
.2
6
第
4
章
総 括
.
5
9
4 叶 J A 口 封 切 - - -2 n H百
字
.
.
6
3
第
1
章
5
者
Eコ
全ての生物は，生命維持に必要なエネルギ
-源として，
太陽光・食物等か
らのエ
ネルギ
ーを
，
“エネルギ
一
変換システム"において
ATP
という形に変換して
r
t
j
!
践
)
し
‘
これを必要に応じて加水分解することによりエネルギ
ーを得て生命活動を常ん
でいる
.
真核生物におけるエネルギ
一
変換反応は，細胞体積の約 22
%
(肝細胞で
細胞当たり約
1
，
7
00
個)を占めるミトコンドリアの酸化的リン酸化反応で行われて
おり，ここでエネルギ-要求量の約 8
0
%
以上がまかなわれている.
このミ
ト
コンドリアは
4
0
年前に電子顕微鏡写真が撮られて以来，
1
ミクロノ川
後のラグビ
ーボールあるいは葉巻状の形をしたもので，外膜とマトリックス内に入
りくんだ内膜からなると，長い間考えられ教科書として定着していた.また，ミト
コンドリアは，半自己増殖能を持っており，それ自身のゲノムと核のゲノムの支配
のもとに成長し
ある程度大きくなると，細菌の場合と同践に，ミトコンドリアの
中程に内膜の隔壁(s
e
ptum
)
を生じ，その後， 2分裂するノ
7
式でミトコンドリア
数を増生させると考えられてきた
.
しかし，最近，これらの長く保持されていた絵
図や説明が間違っている可能性が示唆されてきた1.
2)ミトコンドリアは
高度に動的なオルガネラで，セルサイクルの G
1
-期には~
てのミトコンドリアが融合した
c
e
l
l
u
l
a
rm
i
t
o
c
h
o
n
d
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n
ともいうべき連続した網状体
(
c
o
n
t
i
n
u
o
u
s
r
e
t
i
c
u
l
u
m
)
として観察され(図
1
)
，そして
S
-
W
I
にはより小さな色:状
体に断片
化
されることが観察されたのである
3)そこで，このようなミトコンドリ
アの種々の形態の制御において中心的な役割を担っている“分裂"と“融合'¥そ
して娘細胞への“分配"のイベントが，現在の研究の最も問先なホットスポットと
なっている
.
ミトコンドリアの分布と動態は，ランダムではなくチュ
ープリンや中間経フィラ
メント (
i
n
t
e
rm
e
d
i
a
t
ef
i
l
a
m
e
n
t
)等のサイトスケルトンと，キネシンやダイニンなど
のオルガネラを輸送するモータ
-
蛋白によってコントロ
ー
ルされていることが明カ
となっておりの
さらに.
R
u
t
l
e
r
と
R
i
z
z
u
t
o
は，ミトコンドリア外膜が， e
n
d
o
p
l
a
s
m
i
c
r
e
t
i
c
u
1
u
m (
E
R
)
と結合しており，細胞内のカルシウムシグナリングにおいてミトコ
ンドリアがカルシウムレベルのレギュレータとして重要な役割を演じていると説明
している
5) 図1•哨乳動物の線維芽細胞におけるミ
トコンドリア網状ネットワーク
3)COS-7
細胞のミトコンドリア(緑)
と微小管(赤)を，蛍光抗体法を用いた
共焦点顕微鏡により観察した.ミトコン
ドリアは
ATP合成酵素の日サブユニッ
トに対する抗体とローダミン標識した
二
次抗体を用いて蛍光標識された.微小位
はチュープリンに対する抗体とフルオレッ
センを結合した
二
次抗体を用いて蛍光標
識された.
ミトコンドリアの網状構造体は
細胞内カルシウムのホメオスターシスだけでなく，
エネルギ一代謝においても重要な利点がある.すなわち，膜電位の細胞内ケーブル
として機能することにより，細胞内のある部分でエネルギーを生産し，そととは距
離的に離れた部位で使用されることが可能であろう
6)また，最近の電子線トモグラフィーの研究から，今までのミトコンドリア内の構
造は単
純化しすぎており，外膜と内膜聞に多くの接続点があること，クリステは，
膜が単純に入り込んだものでなく，図
2
に示されるように，独自のコンパートメ
ノトを作っていることが明らかにされている
7)-
2
-図2.ニワトリ小脳のミトコンドリアの断
片
3D
トモグラムから作製されたコ
ンビューターモデル
η(左)ミトコンドリア内の全体像.
(右)代表的なクリステの 4つのタイプが
示されている
.
Q
u
i
c
k
t
i
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eビデオが次のサ
イトで観察できる.
h
r
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:
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/
w
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M
o
v
i
e
.
h
t
m
このように，これまで考えられていた様なミトコンドリア
の形態やその動態につ
いての概念は新しく書き換えられる時期を迎え，そしてミトコンドリア自体を改め
て考察する必要が生じてきている
.
また，ミトコンドリアは，ミトコンドリア病を
はじめ，糖尿病，アルツハイマ
-
病，老化，アポト-シス
等の様々な疾患や生理
的変化に関与していることでも良く知られており，さらに最近では，癌の診断にも
ミトコンドリア遺伝子が利用されるようになってきていることからも、このミトコ
ンドリアの分裂増殖の制御機構といったような基本的な生理反応を明らかにするこ
とにより，上記疾患を筆頭に様々な疾患の治療に役立つ有用な情報が得られること
が大いに期待できる
.
そ こ で ， 本 研 究 で は ， ミ ト コ ン ド リ ア の 中 で も 中 心 的 な 働 き を 担 っ て い る
H
+
-
A
T
P
合成酵素と，心筋細胞においてミトコンドリアの異常な増殖が確認される
JVS
マウス
(
J
u
v
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l
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V
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s
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S
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a
t
o
s
i
s
m
o
u
s
e
)
l))に着目し，ミトコンドリアのバイオジ、工
ネシスの解明を目的として，
F
!
H
+
-
A
T
P
合成酵素の転写レベルにおける発現制御機
構の解明』と!F
JVS
マウスにおけるミトコンドリア数の増加に関わる新規因子の探
索』の
2
つのテーマから実験
・
考察を行った
.
H
+
-
A
T
P
合成酵
素と
JVS
マウスの詳
細については，各章で述べているので
ここでは省略する.
-
3
-参考文献
第
2章
H
+
-ATP合成酵素の分子構築における遺伝子制御の
分子シンクロナイゼイション現象の発見
酸化的リン酸化系は，ミトコンドリア内膜に存在し， 85種のタンパク質がある
特定の化学量論比で 5 種の複合体(I ~v) に分子構築された超分子複合体である
これらの複合体のサ
ブユニットのうち，複合体
1
，
I
I
I
，
IV
ヲV
に関わる 1
3
種のサブユ
ニットはミトコンドリア遺伝子にコードされている(シトクローム b，シトクロ
ムオキシダーゼの COI
，
I
I
，
I
I
I
，
NADH
脱水
素酵素の N
D1
~6，
ND4L
，
H+
-ATP
合成
酵素の s
u
b
u
n
i
t
a
，
A6L
)
1.7)(
図 2
-
1)
.
つまり，これら 4つの複合体は，核遺伝子と
ミ ト コ ン ド リ ア 遺 伝 子 の
二 重 支 配 を 受 け て い る と 推 測 さ れ る
NRFs(N
u
c
l
e
a
r
樋口富彦
(
2
0
0
0
)
分子がつくるナノの不思議一切って集めたタンパク質-第
1
4
回
「
大学と科学」公開シンポジウム組織委員会編，
pp
.
1
4
5
-
1
5
5
3
クパプロ出版
姫田敏樹，樋口富彦 (2001) ミトコンドリアのバイオジェネシス
ーその分裂と融合「新ミトコンドリア学」内海耕値
・
井上正康監修，
共立出版
(印刷中)
2.1
諸 言
R
e
s
p
i
r
a
t
o
r
y
F
a
c
t
o
r
s
)
山
)や，
PGC-1 (Peroxisome
P
r
o
l
i
f
e
r
a
t
o
r
-
A
c
t
i
v
a
t
e
d
R
e
c
e
p
t
o
r
Gamma
C
o
a
c
t
i
v
a
t
o
r
1
)
1
1
)
等は，この二重支配を協調的に制御するとされている因子であるが
その制御機構には，いまだ不明な点が多い.
Matrixハ
﹂
L
F
⋮ ぃ
2
)
Y
a
f
f
e
，
M.
P
.
(
1
9
9
9
)
百
l
e
m
a
c
h
i
n
e
r
y
o
f
m
i
t
o
c
h
o
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d
r
i
a
l
i
n
h
c
r
i
t
a
n
c
e
and
b
e
h
a
v
i
or
.
Soe
刀c
e
283
1493-1497
4
)
S
e
t
o
u
，
M.
Nakagawa
，
T
.
，
Seog
，
D
.
H.
a
n
d
Hirokawa
，
N. (
2
0
0
0
)
図
2
・1
ミトコンドリア内膜における
酸化的リン酸化反応の模式図
酸化的リン酸化系の 5つの複合体のうち上図に示した 4つの複合体は，その
各サブユニットが核遺伝子とミトコンドリア遺伝子に分かれてコードされている
その割合を(核遺伝子:ミトコンドリア遺伝子)で示した
K
i
n
e
s
i
n
s
u
p
e
r
f
a
m
i
l
y
motor
p
r
o
t
e
i
n
KIF17
a
n
d
mLin-10 i
n
NMDA
r
e
c
e
p
t
o
r
-C
o
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t
a
i
n
i
n
g
v
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s
i
c
l
e
t
r
a
n
s
p
o
r
t
.
S
c
i
e
刀c
e
288
，
1796-1802
R
u
t
t
e
r
，
G. A.
a
n
d
R
i
z
z
u
t
o，
R
.
(
2
0
0
0
)
R
e
g
u
l
a
t
i
o
n
o
f
m
i
t
o
c
h
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n
d
r
i
a
l
m
e
t
a
b
o
l
i
s
m
b
y
E
R
Ca
2+
r
e
l
e
a
s
e
:
a
n
i
n
t
i
m
a
t
e
c
o
n
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c
t
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n
.
T
r
e
n
d
s
B
i
o
c
h
e
m
.
S
c
i
.
25
フ215
-
221
C
a
p
a
l
d
i
，
R
.
A.
(
2
0
0
0
)
Th
e
c
h
a
n
g
i
n
g
f
a
c
e
o
f
m
i
t
o
c
h
o
n
d
r
i
a
l
r
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s
e
a
r
c
h
CytosoJT
r
e
n
d
s
Bioch
e
m
.
S
c
i
.
25
ヲ212
-
2
1
4
i
ミ
:
-
[
，
g
て
j
;
ミ
込
、
ぐ
ち
三
、
，
uclear DNAsF
r
e
y，
T
.
G.
a
n
d
M
a
n
n
e
l
l
a，
C
.
A
.
(
2
0
0
0
)
Th
e
i
n
t
e
m
a
l
s
t
r
u
c
t
u
r
e
o
f
m
i
t
o
c
h
o
n
d
r
i
a
.
T
r
e
刀d
s
Biochem.Sc
j_25
，
319-324
)
Koizumi
，
T
.
N
i
k
a
i
d
o
，
H
・
，
Hayakawa
，
J
.
，
Nonomura
，
A.
and
Yoneda
，
T
.
(
1
9
8
8
)
I
n
f
a
n
t
i
l
e
d
i
s
e
a
s
e
w
i
t
h
m
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v
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y
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l
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n
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o
u
s
l
y
o
c
c
u
r
r
i
n
g
i
n
t
h
e
C3H-H-2
0s
t
r
a
i
n
o
f
mouse w
i
t
h
s
j
m
i
l
a
r
i
t
i
e
s
t
o
R
eye
1s
s
y
n
d
r
ome.
L
a
b
.
An
j汀1.22
，
8
3
-
8
7
ribosomes (80S)このような酸化的リン酸化反応の最終反応を司り
、
ミトコンドリア機能の中
心
的
役割を担っているのが，史上最小の分子モーターともいわれる
1
0
)
H
+
-ATP
合成酵素
である(図
2
-
2) .
H+-ATP合成酵素は F
1 と Foと呼ばれる機能的に異なるセグメ
/トとこの
2つをつなぐ s
t
a
l
k
部分から構成された超分子複合体である
.
F
l
はミ
ト
コンドリアの内膜から突出している
ATP
合成反応の触媒部位であり，
Fo
はプロ
ト
ンを透過させる膜内の通過路で、エネルギ一変換反応に携わるセグメン
ト
である
.
F
l
セグメントは，
α
，
s
，
y
，
6，
Eと呼ばれる
5
つのサブユニッ
ト
からなり
，α
，
s
につい
てはその立体構造も
W
a
l
k
e
r
らのグループに
よ
り明らかにされ
1
2
)，
Walk
e
r
は
1997
年度のノーベル化学賞を
Bo
y
e
r
と
Sk
a
u
らと共に受賞した
.
一 方
Fo
セグメント
と
酸
化
能の著しい低下
・
細胞老化の鍵は核に存在すると考えられる.しかし，酸化的
リン酸化の組織特異性やミトコンドリアに起因する脳障害や老化(加齢)といった
生体エネルギー学的原因に基づく疾患の詳細については，ほとんど解明されていな
、、 A 'じ vそ
こ
で
，
本
研
究
では
H
+
-ATP
合成酵素の核に
コ
ードされたサブユニットの
.
転写
レ
ベルにおけ
る
制
御
システムと，加齢に伴う
mRNA
量の変化の解明を行うために
λa
l
k部分は，ラット 2
・.
7
1
3
-
2
3
)においては，
s
u
b
u
n
i
t
a
，
s
u
b
u
n
i
t
b，
s
u
b
u
n
i
t
c
，
s
u
b
u
n
i
t
d
s
u
b
u
n1
t
e
，
f
a
c
t
o
r
6，
OSCP (
O
l
i
g
o
m
y
c
i
n
s
e
n
s
i
t
i
v
i
け
c
o
n
f
e
r
r
i
n
gp
r
o
t
e
i
n
)，
A6Lの 8
つのサブ
ユ
ニットから
構
成されている
こ
とが明らかとなっており，更
に
，ウシ2
4
.
2
5
)については
u
b
u
n
i
t
f
，
s
u
b
u
n
i
t
gの存在が，酵母あ)につい
て
は
s
u
b
u
n
i
t
fの存在が確認されている
.
これらの各サブユニットのストイキオメトリーは
，F
lセグメン
ト
の
α，
s
ヲy
，
6
，
E
が
3
:
3
:1:1:1
であり
2
7
却 )，
Fo
セグメン
ト
の
b
，
d
，
e
，
f
a
c
t
o
r
6，
O
SCP，
A6L
が そ れ ぞ
れ
1
.
8
0
，
1
.
1
0
，
2
.
0
0
，
2
.
0
0
，
1
.
1
0
，
1
.
00 (mo
l
/
mol F
l
)
である
4
.
2
9
.
3
0
こと
が
決
定されている
.
このように
，
H
+
-ATP
合成酵素はある定まったストイキオメトリーで
構
築されてしミ
るわけであるが，転写レベルではいったいどのようになってい
るの
で
あ
ろうか
.
細
胞
内
の好気的エネルギ-供給は，短期
的
には
呼吸
調節
能
で，長期
的
には
ミトコ
ノドリア形成によって調節されている
.例え
ば
，
ホルモンや解
糖
系の基質
で
あ
る
グ
ルコース等によって，各酵素遺伝子の発現量が転写レベルで
変化
する
こ
とが
確
認さ
れており，また
.
力日齢によっても酸
化的リ
ン酸
化能
は著しく
低下するこ
とが
知
ら
れ
ている
3ト36)こうしたことからも，呼吸能を担う各酵素のサブ
ユニット
が
，様
々な
件においてどのような転写調節を受けているのかは，大変興味深いものとなっ
て
くる
また
，
加齢によって酸化的リン酸
化
能が著しく低下することについてはさら
に
.
若い細胞の核と老
化
した
細
胞の細胞質を融合させたサイブリッド(細
胞
質
雑 種
)
では，老化細胞由来のミトコンドリアの呼吸
能
が完全に回復し
，
逆の組み合わせで
は老化の様相を示すという報告がある
1
2
.
3
6
.
3
7
)
このことから加齢による酸
化的
リン
筆者らの研
究
室等でクロ-ニングされたラットの
s
u
b
u
n
i
tb
1
1
1
8
)
3
s
u
b
u
n
i
t
C
2
1
2
)
‘s
u
b
u
n
i
t
d
2
3)
，
s
u
b
u
n
i
t
e
I
6)
，
f
a
c
t
o
r
6
1
り
初
)
，
os
c
p
Z
リと
F
l
-
ss
u
b
u
n
i
t
3
8
l，そして
ATP
の浪費的な分解を
防
いでいる
1
F
1
(ATPas
e
i
n
h
i
b
i
t
o
r
p
r
o
t
e
i
n
)
2
1
)の全
9
種について，その転写物量の解析
を行
った
.
図
2・2ミトコンドリア内
膜
に存在
す
る
H+-ATP合成
酵素の模式図
本酵素の触媒部位を構築している
Fl複合体は
，
α
，
s
，
y，
O
，
Eのストイキオメ
ト
リ
ーで構築されており
，
その三次元的構造が決定されている.他方，エネルギ
一変換部位を構築している
F
o
複合体は，
s
u
b
u
n
i
t
a
，
b
，
c
，
d
，
e
，
F
a
c
t
o
r
6
，
OS
C
P
，
A6
から構築されている
.
そして，
Fl複合体の日
s
u
b
u
n
i
t
に結合して活性制御を行っ
ていると考えられる
I
F
l
とから成る
-
6
-
-
7
-2
.
2
実験結果
2
.
2
-
2
プ口-ブの作製
2
.
2
-
1
mRNA
の定量;去の開発
n
3り)pT
7
4
}
)
S
P
6
4
1
)
等のパクテリオファージ
由来の
DNA
依 存 性
RNAp
o
l
y
m
e
r
a
s
e
に
特異的なプロモーターの下流に組み込んだ目的
c
DNA
から
，
InvItro転写システム
を用いて
m
RNA
を合成し，これを段階希釈して内部標準試料とし，目的のサンプ
ルの
p
o
l
y
(
ArRNA
と同時に一枚のメンブランにブロッティングする
.
これをハイブ
リダイゼ-ションした後，富士フィルムのイメージングアナライザ-
C
B
A
S
-
1
5
0
0
)
を用いて各シグナル強度を測定し，内部標準試料のシグナル強度を基にした直線回
帰により，組織
・
細胞内に存在する
m
RNA
の 量 を 計 算 す る
ことによ
り，その
mRNA
の絶対量を
1
0
0n
g
の
mRNA
当たりの量
(
p
g
!
1
0
0
n
gp
o
l
y
(
A
f
R
N
A
)
として
得る
ことに成功した
.
この方法の概略を図
2
-
3
に示す
.
筆者らの研究室では，これまでラット日
+
-
A
T
P
合成酵素の
F
o
セグメントの核に
コ
ー
ドされた
7
つのサブユニットについて
cDNA
ク口
一二ングを行っており
lM3)，
今回，図
2
-
4
に示すよ
うな部位を切り出してフローブの鋳型とした. このうち
ゅ
u
n
i
tc
については
シグナルペフチドの異なる
2
つのアイソフオームがクロ-ニ
ングされているので
21)，図
2
-
4
に示すとおり互いに配列の異なるシグナル
ペプチド
を コ ー ド し て い る 部 位 を 用 い た
.
一 方
Fl-s
s
u
b
u
n
i
t
は
，配列
J!l)の一部を
N
e
s
t
e
d
RT-PCR
法でク口一二ングすることにより得た
8
2
2
-
1
1
1
3
のフラグメント
(
2
9
1
b
p
s
)
を用いた
.
これらは全て，シークエンスを行って塩基配列を確認後，超遠心
で精製
したものを実験に用いた
.
このとき同時に，クロ
一
二ングした各サブユニットに含
まれる
p
o
l
y
(
A
f
t
a
i
l
の
A残基の正確な数を明らかにした
.
得られたフラグメントの
[
J
2
p
]
による
ラベ
ルは，ランダムプライマ一法により行った
.各
プローブは
5X
1
0
コc
p
m
/
m
l
となるようにハイブリ夕
、イゼ-ションバッフアーに加えた
.
Poly(A)+R NAの準備
ラット組織の摘出ホ モジナイズ 育長 sー刊宗主摂可~FUFFF///UUU///.HILÆi瓦uDLZO'ULUDdLUDD/D/~
』 ト-~ In
ν
itro転写による円
NAの合成
B22 b ・5ーl I・M ・:::W/////H /F///////IYIY//.ff////l ト2 BrI，
りI1cul c 吋叩削(P刊伊仰1り):5 一 1ぷ以5土以川以抗山.日日;.;日汗日川:::::::;心叫川ιχ汗以十以以ω渋おω.に山山川日日山いJ日川以χ以以白〈日日;χ日0….:お主辺.:ぷぶ!主三:;:;:川山..γ川λ:::~:可パ泊 x掴1 E回 剛c(P2): 5 - : : I 古 川 ・ ィ ::::Y7FIY.H;i"//.H/'~下-:y
TotalRNAの単離 A田 E"由1閣l
↓
泳動による確認と， 2ωnmの吸収による定前↓
{~IJ.t Poly(A)+RNA RN A (wcck old) d:5'→ W7H/b"/H////.H'~.HD"'Æ---r-3 A~I A四 川￨
白
ー…∞
dng吋 DnI
図Import均ruJIp叩lide' (グアニジンテオシアネー卜.C~CI組泌心11.) (Pl¥)，
2 320..r孟 孟 三 コ ロ 一 一 一 ト...BfilIn : 5 -WHD2TsD4
二
コ
- 3 ~ Malure proll:In Livcr Poly(A) + RNAの精製[Oligodl La~x <s upcr> :
1
1
.-1，ロヅシュ]F6: S'一1f:::::::::お，...開 i9D"'.D77A一一寸-3' HnY1Tt HIf百111
ー
I'mbe の 陶 製 託 作 3 H d 町 山 内 希 F hd 円 ζ blol -一一ー.. Hc~ 円4
0
.
.
1
c:コ一 一 一 一 一 同Kiunc 20"1・・・ 1~コ~---11三1...ー--' blot 1== 司@一一一-2.5・
~I=コ' ￨門 5一円烹烹烹VHH'/H/4mL__)--'3 附rd州 ApoU Poly(A) +RNAを 100ngずつに調製 oSCP 日 ド・::f"H-'//H/-'/////H/U/////.HJl 下 2 H，
rd 111 Aρ・
u Hybridization (Pmoc .ランダムプライマ-11.によりラベル)J
バイオ・イメージングアナライザ一 :MacBAS-1500 (FUJIF1LM)により解析
図
2
・3
mRNA
の絶対量の定量;
去の概要
図
2
-
4
H
+
-ATP
合成酵素サブユニットの
cDNA
マップとプロープ
DNA
の構成
F
l
-
s
s
u
b
u
n
i
t
は
，
Nested-RTPCR
によりクローニングした断片を，他のサブユニットは，
cDNA
