岡 山 医 学 会 雑 誌 第118巻January2007,PP.209-213
平成17年度岡山医学会賞(結 城賞)受 賞論文
ボ ツ リヌ スC型 とD型 神 経毒 素 を支配 す るバ クテ リオ フ ァー ジの
遺伝 子解 析 と溶 原 化 の分 子機構
阪 口 義 彦a*,林
哲 也b,c,黒
川
顕d,中
山 恵 介c,大
島 健 志 郎e,藤
永 由 佳 子f,
大 西
真g,大
坪 栄 一,服
部 正 平e,小
熊 恵 二a
a岡 山大学 大学 院 医歯薬 学総 合研 究科 病 原細 菌 学, b宮 崎大 学 フロ ンテ ィ ア科 学実 験総 合 セ ンター 生命 科学 研究 部 門生命 環境 科学 分野,c宮 崎大 学 医学部 医学科 感染 症学, d奈 良先 端科 学技 術大 学 院大学 情報 科学 研究 科 比較 ゲ ノム ,e北 里大学生命科学研究所, f大阪 大学 微生 物病研 究 所 附属感 染症 国 際研究 セ ンター,9国 立感染 症研 究所 細 菌第 一部, h東 京大 学分 子細 胞生 物学 研究 所 分 子情報 ・制 御 キ ー ワ ー ド:バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ,ボ ツ リ ヌ ス 毒 素,挿 入 配 列,プ ラ ス ミ ド,プ ロ フ ァ ー ジ は じ め に ボ ツ リ ヌ ス 菌 は 強 力 な 神 経 毒 素 を 産 生 し,ヒ トや 家 畜 に 強 力 な 致 死 作 用 を 示 す1).本 毒 素 は 無 毒 成 分 と結 合 して い る た め,胃 液 や 腸 液 に 強 く,毒 素 型 中 毒 を引 き起 こ す2).毒 素 は そ の 抗 原 性 の 違 い に よ りA∼G型 に 分 類 さ れ る が,そ の 生 化 学 的 性 状 か ら は1∼IV群 に 分 類 さ れ て い る.こ れ ら の 型 の 中 で,毒 素 遺 伝 子 はC 型 とD型 菌 に お い て の み 宿 主 特 異 性 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ の ゲ ノ ム 上 に存 在 し て い る3-7).ま た,こ れ ら の フ ァ ー ジ 上 に はC3酵 素 遺 伝 子 も存 在 す る8).飯 田 らお よび 小 熊 ら は,C型 お よ びD型 菌 毒 素 産 生 株 で あ る C-Stockholm(C-ST),C-468,D-1873よ り得 た フ ァ ー ジ を そ れ ぞ れc-st ,c-468,d-1873フ ァ ー ジ と名 付 け,こ れ らの フ ァー ジ を,同 じ有 毒 株 か ら ア ク リ ジ ン オ レ ン ジ 処 理 に よ り 得 ら れ た 無 毒 株 で あ る (C)-AO2,(C)-468NT,(D)-139,(D)-151に そ れ ぞ れ 感 染 させ る と,無 毒 株 は毒 素 産 生 株 へ と変 換 さ れ る, フ ァ ー ジ 変 換 で あ る こ と を 認 め た3,4).毒 素 産 生 能 は 特 定 の フ ァ ー ジ と無 毒 株 に お い て の み 認 め ら れ る が,無 毒 株 の 中 に は 感 染 す る フ ァ ー ジ の 種 類 に よ り,C型 ま た はD型 に変 換 さ れ た.こ れ ら の フ ァ ー ジ に お い て, そ の 形 態 は よ く似 て い る が,抗 原 性 が 異 な っ て い る こ とか ら,3つ の グ ル ー プ に 分 類 さ れ た.(グ ル ー プ1: c-stとc-468,グ ル ー プH:d-1873,グ ル ー プIII:d-4947)9). 他 方,菌 体 内 に 挿 入 さ れ た 毒 素 遺 伝 子 は,毒 素 変 換 菌 を 抗 フ ァ ー ジ 血 清 ま た は ア ク リ ジ ン オ レ ン ジ の 含 む 培 地 で,容 易 に 毒 素 産 生 性 が 消 失 し た こ と か ら,毒 素 遺 伝 子 が 宿 主 染 色 体 に 完 全 に 溶 原 化 さ れ て い な い, " pseudolysogeny"で あ る と結 論 さ れ た5,6,10).今 回, 我 々 はC型 毒 素 変 換 フ ァ ー ジ(c-stフ ァ ー ジ)の 全 ゲ ノ ム 塩 基 配 列 の 決 定 を 行 い,本 フ ァ ー ジ ゲ ノ ム の 様 々 な 特 徴 を 明 ら か に し た の で こ こ に 報 告 す る. 平 成18年10月 受 理 *〒700-8558岡 山 市 鹿 田 町2-5-1 電 話:086-235-7158FAX:086-235-7162 E-mail:[email protected] ◆ プ ロ フ ィ ー ル ◆ 阪 口 義 彦 平成11年,徳 島文 理 大 学大 学 院 薬 学研 究 科修 士課 程 を卒 業 後,4月 よ り岡 山大 学 大 学 院 医学 研 究 科博 士 課 程 に入 学 、小 熊 恵 二教 授 の 指 導 の下,ボ ツ リヌス 毒素 遺 伝 子 を伝 達 す る バ クテ リオ フ ァ ー ジの研 究 を行 う.平 成12年1 月 ∼12月 には,信 州 大 学 医学 部 に 国 内留 学 し,林 哲 也教 授 の 指 導 の下,本 ファ ー ジの全 ゲ ノム 塩基 配 列 の 決 定 を 行 った.そ の 後,岡 山大 学 に も ど り,本 フ ァー ジ の様 々 な特徴 を明 らに し,Proc.Natl.Acad.Sci.USAに 発 表 した.平 成17年,医 学 博 士 の学 位 を取 得 し,4月 よ り岡 山大 学 大 学 院医 歯 薬学 総 合 研 究科 病 原 細 菌学 の助 手 とな る.c-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム の 特 徴 c-stフ ァ ー ジ の 全 塩 基 配 列 は185,682bpの 線 状2 本 鎖DNAで,ゲ ノ ム の 両 末 端 に は404bpのterminal directrepeat(TDR)が 存 在 し た.GC含 量 は26.2% と 宿 主 ゲ ノ ム お よ び 近 縁 の ク ロ ス ト リ ジ ウ ム 属 細 菌 に 類 似 し て い た11-13).本 フ ァ ー ジ ゲ ノ ム 上 に はC型 神 経
毒 素,
hemagglutinin
(HA),
non-toxic non-HA
(NTNH),botR,C3exoenzyme
を 含 む198個 の タ ンパ ク 質 コ ー ド領 域(ORF)が 同 定 さ れ た が,tRNA遺 伝 子 は 存 在 し て い な か っ た(図1).ま た,Bacillus subtilis のSPβ フ ァ ー ジ ゲ ノ ム のORFと 有 意 な 相 同 性 を 示 す ORFが 多 数 存 在 し,そ の 並 び も 保 存 さ れ て い る こ と か ら,c-stはSPβ 類 縁 の フ ァ ー ジ で あ る こ と が 示 唆 さ れ た14,Insertion sequence(Is)
element
c-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム 上 に は 新 し い タ イ プ のISと そ の 残 骸 が 多 数 存 在 し,c-stゲ ノ ム で は 全 体 の 約10%を 占 め て い た.全 部 で12コ ピ ー のISが 存 在 し,7つ に 分 類 で き た が,互 い に 類 似 性 が あ っ た.こ の う ち の4 種 類(ISCbt1-4)に つ い て は,ISと し て の 構 造 を 確 定 す る こ と が で き た が,い ず れ も 明 ら か なinverted repeatを 持 た ず,特 定 の 配 列 を 特 異 的 に 認 識 し て 転 移 す る タ イ プ で あ っ た.こ れ ら の 全 て のISは,末 端 に inverted repeatを 持 た な いIS200/605フ ァ ミ リ ー に
図1c-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム のgenolne organizationとC型 とD型 フ ァ ー ジ のPCRス キ ャ ニ ン グ 解 析
c-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム 上 の 矢 印 は 確 定 し たopenreadingframe(ORF)を ,box上 ま た は 下 の 番 号 はORF.番 号 を 示 し て い る.線 の 上 ま た は 下 に 示 し て い るORFは,そ れ ぞ れ 左 か ら 右,右 か ら 左 に .転写 さ れ る 方 向 で あ る.推 定 し た 機 能 か ら,ORFは8つ の グ ル ー プ に 分 類 し,同 じ グ ル ー プ のORFは 同 じ 色 で 示 し て い る.斜 線 で 示 し たboxは403bpのTDRで,緑 色 のboxはISelementで あ る .ま
た,推 定 し たreplication origin(ori)とterminus(ter)の 位 置 も 示 し た.星 印 はc-stフ ァ ー ジ タ ン パ ク 質 のN末 端 解 析 に よ:,決 定 し た4つ の 構 造 タ ン パ ク 質 で あ る.c-468,d-1873フ ァ ー ジ のPCRス キ ャ ニ ン グ 解 析 の 結 果 はORFInapの 下 に 示 し た.実 線 はPCR 産 物 が 得 ら れ た 部 分,破 線 は 得 ら れ な か っ た 部 分 で あ る.(+)はc-stフ ァ ー ジ よ り 大 き なPCR産 物 が,(一)は 小 さ いPCR産 物 が 得 ら れ た こ と を 示 す.
毒 素遺伝 子 の伝 達 とフ ァー ジの溶 原化:阪 口義 彦,他9名 属 す る 新 規 のISelementで あ る た め,必 ず し も末 端 が 同 定 で き な か っ た15). Pseudolysogeny C型 とD型 菌 はC型 ま た はD型 フ ァ ー ジ に よ り溶 原 化 さ れ て い る が,容 易 に 消 失 す る.こ の 現 象 の 理 由 と して は,幾 つ か 考 え ら れ て い る が,ま だ 証 明 さ れ て い な い.今 回,我 々 はc-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム は 宿 主 内 に 挿 入 さ れ た 後,細 胞 質 に プ ラ ス ミ ド様 に環 状 化 し て 存 在 す る こ と を 明 ら か に し た. c-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム 構 造 の 全 体 的 な 特 徴 を み て み る と,ゲ ノ ム 両 末 端 付 近 か ら 中 央 部 へ と 向 か うORF の 方 向 性 と こ れ に 対 応 し たGCス キ ュ ー か ら,本 フ ァ ー ジ ゲ ノ ム は 細 菌 染 色 体 と 同 じ構 造 を示 す と推 察 さ れ た.こ の よ う な特 徴 か ら,C-stフ ァー ジ が 感 染 し た 際 に は,両 末 端 に存 在 す るTDR問 で の 組 換 え に よ り環 状 化 した 後,複 製 して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た.ま ず, C-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム が 宿 主 内 で 環 状 化 す る こ と を 確 か め る た め,特 異 的 な2つ の プ ラ イ マ ー 対,lfと1r お よ び2fと2rを 用 い てPCRを 行 っ た(図2).c-st フ ァー ジ が 感 染 して い るC-ST株 と溶 原 株 で は3.8kb と2.3kbの バ ン ドが 得 ら れ た が,感 染 し て い な い 宿 主,indicatorstrain,(C)-AO2で はPCR産 物 が 検 出 さ れ な か っ た(図2B).さ ら に,得 られ た そ れ ぞ れ の PCR産 物 の 塩 基 配 列 を 決 定 す る と,フ ァ ー ジ ゲ ノ ム は 両 末 端 の 反 復 配 列 を介 し た 組 み 換 え に よ り,環 状 化 し て い る こ とが 示 唆 さ れ た. 溶 原 化 し て い る フ ァ ー ジ の 末 端 領 域 の 構 造 を さ ら に 確 認 す る た め,サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析 を 行 っ た.そ れ ぞ れ のDNAを 、4αtIIとSαlIでdouble-digestionし, フ ァ ー ジ 末 端 領 域 に ハ イ ブ リ ダ イ ズ す るP1,P2, P3の3種 類 の プ ロ ー ブ を 用 い て サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析 を行 っ た(図2C).P1を 用 い た 場 合,c-stフ ァー ジ は1kbの 位 置 に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た が,C-ST株 と 溶 原 株 は2.7kbの 位 置 に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た.P3 を 用 い た 場 合,c-stフ ァ ー ジ は1.9kb,C-ST株 と 溶 原 株 は2.7kbの 位 置 に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た.P2を 用 い た 場 合 は,C-ST株 と溶 原 株 は2.7kbの 位 置 に1 つ の シ グ ナ ル が 検 出 さ れ る の に 対 し て,C-stフ ァ ー ジ で は,1kbと1.9kbの2つ の シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た. こ れ ら の 結 果,C-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム は フ ァ ー ジ粒 子 内 で は両 末 端 に 反 復 配 列 を も っ た 線 状 構 造 を と る の に対 して,溶 原 菌 内 で は こ の 両 末 端 の 反 復 配 列 が1つ に な っ た 環 状 化DNA分 子 と して 存 在 す る こ とが 示 唆 さ れ た. さ ら に,溶 原 菌 内 に 存 在 す るc-stフ ァ ー ジDNAが 宿 主 染 色 体 に 組 込 ま れ て い る の か,あ る い は 染 色 体 と は独 立 し たDNA分 子 と して 存 在 す る の か,を 明 らか A B C 図2 溶 原 株 と フ ァ ー ジ 粒 子 内 で のc-stフ ァ ー ジ の ゲ ノ ム 構 造
A;c-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム の 線 状(a)と 環 状(b)構 造 で の フ.ロ ー ブ(a)とPCRプ ラ イ マ ー(b)の 位 置. B;2つ の プ ラ イ マ ー 対,1fと1r(レ ー ン1∼4)ま た は2fと2r(レ ー ン5∼8)を 用 い たPCR解 析.
C-ST,溶 原 株,(C)-AO2,c-stフ ァ ー ジ 粒 子 か らDNAを 精 製 し,実 験 に 用 い た.レ ー ンM;DNAサ イ ズ マ ー カ ー,レ ー ン1と 5;C-ST,レ ー ン2と6;溶 原 株,レ ー ン3と7;(C)-AO2,レ ー ン4と8;c-stフ ァ ー ジ 粒 子.
C;サ ザ ン プ ロ ッ トハ イ ブ リ ダ イ ゼ イ シ ョ ン.
そ れ ぞ れ のDNAを.4αtIIとSαlIで 消 化 し,1%ア ガ ロ ー ス ゲ ル で 分 離 し た.プ ロ ー ブP1(b),P2(c),P3(d)を 用 い て サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析 を 行 っ た.レ ー ンMと レ ー ン1∼4はBの 標 品 と 同 様 で あ る.
A B
図3 溶 原 株 と フ ァ ー ジ 粒 子 内 で のc-stフ ァ ー ジDNAの サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析 A;c-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム の 線 状(a)と 環 状(b)構 造 で のPvuII部 位 と プ ロ ー ブ の 位 置. B;サ ザ ン プ ロ ッ トハ イ ブ リ ダ イ ゼ イ シ ョ ン.
C-ST,溶 原 株,(C)-AO2,c-stフ ァ ー ジ 粒 子 の そ れ ぞ れ のDNAをApaI(レ ー ン1∼4)ま た はPvuII(レ ー ン5∼8)で 消 化 し,pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)に よ り分 離 し た(a).プ ロ ー ブP2(b),P4(c),P5(d),P6(e)を 用 い て,サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析 を 行 っ た.レ ー ンM;DNAサ イ ズ マ ー カ ー,レ ー ン1と5;C-ST,レ ー ン2と6;溶 原 株,レ ー ン3と7;(C)-AO2, レ ー ン4と8;c-stフ ァ ー ジ 粒 子. に す る た め に,genomic DNAのPFGEと サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析 に よ り検 討 し た.そ れ ぞ れ のDNAを.4paI ま た はPvuIIで 消 化 し,4つ の プ ロ ー ブ(P2,P4, P5,P6)を 用 い て サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析 を行 っ た(図 3).c-stフ ァ ー ジ ゲ ノ ム 上 に は,.ApaI部 位 は存 在 し て い な い が,PvuII部 位 は2ヵ 所 存 在 す る.ApaI で 消 化 し たDNAを 解 析 し た場 合 に は,い ず れ の プ ロ ー ブ を 使 っ た 場 合 も ,溶 原 株 か ら得 ら れ る シ グ ナ ル は, 完 全 なc-stフ ァ ー ジDNAと 同 じサ イ ズ の も の が 検 出 さ れ た.一 方,PvuII消 化 に お い て は,プ ロ ー ブ2 の 場 合,c-stフ ァ ー ジ で は48kbと72kbの2つ の シ グ ナ ル が 認 め られ た が,溶 原 株 で は120kbの シ グ ナ ル が 得 ら れ た.こ れ は そ の サ イ ズ か ら,環 状 の フ ァ ー ジ DNAに 由 来 す る と考 え ら れ た.同 様 の 結 果 は,P4と P6に お い て も 得 ら れ,環 状 の フ ァ ー ジDNAに 由 来 す る シ グ ナ ル が 得 られ た.こ れ に対 して,P5の 場 合, 溶 原 株 に お い て もc-stフ ァ ー ジ と 同 様 に65kbの シ グ ナ ル の み が 検 出 さ れ た.こ れ らの 結 果 は,C-stフ ァ ー ジDNAは 宿 主 の 染 色 体 に組 込 ま れ ず,染 色 体 と は 独 立 し た 環 状DNAと して 存 在 し て い る こ と を 示 して お り,ゲ ノ ム の構 造 的 特 徴 か ら予 測 さ れ た 結 果 と一 致 し た. C型 とD型 フ ァ ー ジ の ゲ ノ ム 構 造 の 比 較 C型 とD型 フ ァ ー ジ の ゲ ノ ム 構 造 をc-stと 比 較 す る た め,c-stの ゲ ノ ム 記 列 を 基 に 全 体 のPCRス キ ャ ニ ン グ 解 析 を 行 っ た と こ ろ,全 体 的 に は 非 常 に バ リ エ ー シ ョ ン が あ っ た が ,C型 とD型 毒 素 遺 伝 子 とC3 exoenzymeの 上 流 お よ び 下 流 領 域,DNA複 製 に 関 与 す る 遺 伝 子,oriとterの 領 域,TDRに お い て は非 常 に よ く保 存 さ れ て い た(図1).さ ら に,d-1873の 毒 素 遺 伝 子 の 上 流 と下 流 の5kbの 配 列 決 定 を 行 っ た と こ ろ,小 さ い 遺 伝 子 が 欠 損 し て い た が,配 列 レ ベ ル で はC型 とD型 は 同 じ で あ っ た.し た が っ て,C型 とD 型 フ ァ ー ジ は 互 い に 良 く似 た フ ァ ー ジ で あ る可 能 性 が 高 い と考 え られ た. お わ り に 今 回,我 々 はc-stフ ァ ー ジ の ゲ ノ ム解 析 を行 っ た 結 果,本 フ ァー ジ の 様 々 な 特 徴 が 明 ら か と な っ た.最 も 興 味 深 い こ と は,本 フ ァ ー ジDNAが 宿 主 染 色 体 に 組 込 ま れ ず,宿 主 内 で 両 末 端 で の 組 換 え に よ り環 状 化 し て 存 在 して い る こ と で あ る.こ の こ と か ら,小 熊 ら が 以 前 か ら"pseudolysogeny"と 推 察 し て き た 結 果 と一 致 し,容 易 に毒 素 産 生 性 が 消 失 す る 理 由 が 解 消 さ れ た. 謝 辞 本稿作 成 にあた り,研 究 を支援 して頂 いた 日本 学術 誌振 興会 の未来 開拓研 究事 業 に深 く感 謝致 します.
毒 素遺 伝 子 の伝 達 とフ ァージ の溶 原化:阪 口義彦,他9名
