岡 山 医 誌 (1994) 106, 429∼441
慢性 骨髄性 白血病並び に周辺疾患の分子生物学的解析
岡 山大 学 医 学部 第二 内科 学 教 室(指 導:木 村 郁 郎教 授)
関
藤
典
子
(平成6年2月4日
受 稿)
Key words: chronic myelocytic leukemia, variant Ph1 chromosome, Ph1-negative CIVIL, bcr rearrangement,
unclassified chronic myeloproliferative disorders
緒 言 フ ィ ラ デ ル フ ィ ア(Ph1)染 色 体 は 慢 性 骨 髄 性 白 血 病(CML)の95%に 認 め られ, 9番 染 色 体 と22番 染 色 体 と の 相 互 転 座t(9; 22) (q34; q11)の 結 果 生 じ た もの で あ る1). 22番 染 色 体 の breakpointは わ ず か5.8kbの 限 局 し た部 位 に 集 中 し て お り, breakpoint cluster region(bcr; Major-bcr, M-bcr)と 名 付 け ら れ た2).こ の 相 互 転 座 に よ って9q34上 のABL遺 伝 子 が22q11上 の BCR遺 伝 子 と結 合 し, BCR/ABLキ メ ラ 遺 伝 子 が 形 成 さ札 さ らに8kbのBCR/ABL mRNA に 転 写 さ れ3), p210BCR/ABL.蛋 白 に翻 訳 さ れ る.こ の 蛋 白 で は,正 常 のp145 ABL蛋 白 よ り も tyrosine kinase活 性 が 亢 進 し て お り,こ れ が CMLの 発 症,進 展 に 重 大 な役 割 を 果 た し て い る と考 え ら れ て い る4).ま た こ れ らCMLの 発 症, 進 展 に 関 す る分 子 生 物 学 的 解 析 は,本 症 の 診 断 を 形 態 学 的 解 析,細 胞 遺 伝 学 的 解 析 か ら分 子 生 物 学 的 解 析 へ とす す め, bcr再 構 成 の 有 無 あ る い はBCR/ABL mRNAの 有 無 がCMLの 分 子 診 断 法 と し て 一 般 化 しつ つ あ る. さ て 人 口構 成 の 高 齢 化 と と も に 高 齢 者 疾 患 の 病 像 特 異 性 あ る い は ま た 疾 患 構 成 の 再 整 理 が 検 討 さ れ て い るが,こ の こ とは 血 液 疾 患 に お いて も例 外 で は な く,臨 床 像 や 血 液 像 はCMLに 合 致 し な が ら もPh1染 色 体 の 認 め ら れ な いPh1陰 性(Ph1-)CML5-7), CML以 外 の 慢 性 骨 髄 増 殖 性 疾 患(CMPD),さ ら に は 従 来 の 診 断 基 準 か ら は 既 存 の 疾 患 単 位 に 位 置 づ け る こ とが 困 難 で い わ ゆ る 分 類 不 能 型CMPD(uclassified CMPD; UCMPD)と せ ざ る を 得 な い 症 例8,9)が 中 高 齢 者 を 中 心 に 増 加 しつ つ あ り,こ れ ら報 告 はCMLを 中 心 と し た 各 種CMPDと そ の 周 辺 疾 患 の 相 互 関 係 あ る い は 病 態 の 再 整 理 を 要 求 す る も の で あ ろ う.本 研 究 に お い て 著 者 はstandard Ph1陽 性(Ph1+)CML,こ れ ま で に 報 告 をみ な い転 座 例[t(9; 22) (q21; q11)]を 含 むvariant Ph1+CML, Ph1-CML/UCMPD,若 年 型CML (JCML),慢 性 好 中球 性 白 血 病(CNL), CML 以 外 のCMPDな どCMLと そ の 周 辺 疾 患 に お け るbcr再 構 成 に つ い て 検 討 し,こ れ ら疾 患 群 の 病 態 解 析 と臨 床 血 液 学 的 位 置 づ け に 対 す る一 助 とせ ん と し た. 対 象 と 方 法 1.対 象 Standard Ph1+CML 54例, variant Ph1+CML 3例, Ph1-CML/UCMPD 5例, JCML 2例, CNL 3例,慢 性 骨 髄 単 球 性 白 血 病(CMML) 9例,真 性 多 血 症(PV)8例,本 態 性 血 小 板 血 症(ET)15例,原 発 性 骨 髄 線 維 症(MF)4例 を 対 象 と し た. 2.染 色 体 分 析 骨 髄 直 接 観 察 法 な い し末 梢 血 短 期 培 養 法 で, 染 色 体 標 本 を 作 成 し, Qバ ン ド法 な い しGパ ン ド法 に て 解 析 し た. 3.bcr再 構 成 の 検 討 末 梢 血 な い し骨 髄 液 の 白 血 球(buffy coat)よ 429
りphenol-chloroform法 に て 高 分 子DNAを 抽 出 し, DNA10μgを そ れ ぞ れ 制 限 酵 素, Bgl II, Bam HI, Eco RI, Hind IIIで 消 化 し た.そ の
後0.8%agarose gel(Sigma Type I)で 電 気 泳 動 し, Hybond N(Amarsham)にSouthern
transferし た.そ の フ ィ ル タ ー をbcr probeと hybridizationさ せ た 後, -70℃ で1∼4日, autoradiographyを お こ な っ た10).
な お, probeと し て は3'bcr probe(1.2kb Hind III-Bgl II, Pr-1)とTransProbe-1(Phl/
bcr-3)(Oncogene Science), 5'bcr probe(0.6 kb Hind III-Bam HI,東 京 医 科 歯 科 大 学 広 沢 信 作 先 生,神 山 尚 先 生 よ り 供 与)を 用 い,マ ル チ プ ラ イ マ ー 法 で 比 活 性5×108∼1×109cpm/μg DNAに 放 射 性 ラ ベ ル し た. 結 果 1. Standard Ph1+CMLに お け るbcr再 構 成 の 検 討
3'bcr probeを 用 い たSouthern blot analy sisの 結 果, standard Ph1+CML 54例 中49例 に bcr再 構 成 が 認 め ら れ た(bcr+). bcr再 構 成 が 認 め られ な か っ た5例 に つ い て, 5'bcr probe, TransProbe-1を 用 い て 検 討 し た 結 果, 3例 で はbcr再 構 成 を 認 め た が, 2例 で はbcrは germlineで あ っ た(bcr-). つ ぎにstandard Ph1+bcr+CMLに お け るbcr 内 の 切 断 部 位 と病 期 の 関 連 を 検 討 し た. 3'bcr probeを 用 い た 解 析 に お い てbcr+で あ った49例 の 病 期 は,慢 性 期38例,急 転 期2例,慢 性 期 か ら 急 転 を き た し た もの9例 で あ っ た が,図1に 示 す ご と くbcr内 の 切 断 部 位 の 局 在 に つ い ては, 表1 Variant Ph1+CMLの 臨 床 ・血 液 所 見
Molecular analysis of CML and related diseases 431 図1 Standard Ph1+CMLの22番 染 色 体 内break point 図2 Variant Ph1+CML(症 例1)に お け る染 色 体 分 析: 46, XX, t(9; 22; 13) (q34; q11; q22) 図3 Variant Ph1+CML(症 例2)に お け る 染 色 体 分 析: 46, XX, t(9; 22) (q21; q11) 病 期 に よ る差 は 認 め ら れ な か っ た.ま た 慢 性 期 お よ び 急 転 時 の 検 索 を お こ な い 得 た9例 で は, 同 一 症 例 に お け るbcr再 構 成 バ ター ン は 不 変 で あ っ た.な お,そ の う ち の1例 は 慢 性 期,急 転 期 と も にdouble Ph1を 有 して い た. 2. Variant Ph1+CMLに お け るbcr再 構 成 の 検 討 1)症 例 呈 示(表1) 症 例1: 51歳,女 性.染 色 体 分 析 は 図2に 示 す ご と く, 46, XX, t(9; 22; 13)(q34; q11; q22)の 複 合 転 座 を示 し, 9q34→9qterは22q11 に 転 座 し て い る も の と思 わ れ る. CML診 断 後14 ヶ 月 で 急 転 を き た し,そ の24ヶ 月 後 に 死 亡 した. 症 例2: 35歳,女 性.染 色 体 分 析 は 図3に 示 す ご と く, 46, XX, t(9; 22)(q21; q11)を 呈 し, 9番 と22番 の 相 互 転 座 で は あ るが9番 の 切 断 点 が 標 準 型 のq34と は 異 な るq21で, 22番 がmasked Ph1と な っ て い る.初 診 か ら15ヶ 月 後 に 急 転 を き た し,一 旦 完 全 寛 解 に 到 達 し た が,再 び 急 転 を き た し初 診 か ら66ヶ 月 後 に 死 亡 し た. 症 例3: 73歳,女 性.染 色 体 分 析 は 図4に 示 す ご と く, 46, XX, t(9; 22)(q34; q11), inv (9)(9q22; 22q13)を 呈 し, Ph1転 座 に 加 え て9 番 染 色 体 の 長 腕 内逆 位 が 認 め ら れ た.こ の 症 例 は 無 治 療 で 初 診 か ら63ヶ 月 の 現 在 も 慢 性 期 の ま ま 経 過 して い る. な お,こ れ ら3例 で は 全 経 過 を 通 じ て 核 型 に 変 化 は な く,付 加 的 染 色 体 異 常 は 認 め られ て い な い. 図4 Variant Ph1+CML(症 例3)に お け る 染 色 体 分 析: 46, XX, t(9; 22) (q34; q11), inv(9) (9q22: 22q13)
2) bcr再 構 成 の 検 討 bcr再 構 成 の 検 討 結 果 は 図5に 示 す ご と く で variant Ph1+CML 3例 と も にstandard Ph1+ CMLと 同 様, bcr再 構 成 が 認 め られ た. 3. Ph1-CML/UCMPDに お け るbcr再 構 成 の 検 討 Ph1-CML/UCMPDの 診 断 は 白 血 病 裂 孔 (hiatus leukemicus)を 伴 わ な い 顆 粒 球 系 細 胞 増 多 を 示 し, CMMLとPV, ET, CNLな ど のCMPDを 除 外 し,さ らに 各 種 検 査 か ら類 白 血 病 反 応 を 否 定 し得 た も の と し た. 1)症 例 呈 示(表2) 症 例1: 54歳,男 性. 1987年11月 会 社 の 検 診 で 白血 球 増 多(10,000/μl)を 指 摘 さ れ た が,自 覚 症 状 も な く放 置 して い た. 1988年11月 検 診 で 再 び 白血 球 増 多(29,000/μl)を 指 摘 さ れ, 12月 精 査 目的 で 入 院 と な っ た.入 院 時 肝 脾 腫 は 認 め ら れ ず,白 血 球 数38,600/μlで 幼 若 細 胞 の 出 現 を
図5 Southern blot analyisに よ るvariamt Ph1+ CMLのbcr再 構 成 の 検 討
上 段 に22番 染 色 体 のbcrの 制 限 酵 素 地 図 を 示 す. Probeと して3'bcr probe(a)を 用 い た. Bgl IIに よ る 切 断 で は4.8kb, Bam HIに よ る 切 断 で は3.3kbのgermlineバ ン ドが み ら れ る が,症 例1.2, 3で は 矢 印 で 示 す ご と く,再 構 成 バ ン ドが 認 め ら れ た. (B=Bam H I, Bg=Bgl II, E=Eco RI, H=Hind III)
伴 う顆 粒 球 系 細 胞 増 多 を認 め,貧 血 は な く,血 小 板 数 は55.8×104/μlと 増 加,骨 髄 有 核 細 胞 数 (NCC)は39×104/μlで,成 熟 障 害 を 伴 わ な い 顆 粒 球 系 細 胞 の 増 多 を認 め,好 中 球 ア ル カ リ ホ ス フ ァ ター ゼ(NAP)値 は19と 低 値,染 色 体 分 析 で は正 常 核 型 を示 した. Ph1-CMLの 診 断 の も と,無 治 療 で 経 過 観 察 して い た が, 1989年11月 白 血 球 数83,200/μlと 増 加 し た た めbusulfan (BSF)内 服 治 療 を 開 始 し, CML慢 性 期 の 経 過 を 辿 っ て い た が, 1993年1月 転 勤 の た め 転 院 し た. 症 例2: 20歳,男 性. 1990年5月 末 か ら全 身 倦 怠 感 が 出 現 し, 6月 初 旬 感 冒 様 症 状 に て 近 医 受 診,白 血 球 数116,900/μlと 著 増 しCML疑 い で 紹 介 入 院 と な っ た.入 院 時 肝 を2cm,脾 を5 cm触 知 し,左 前 腕 と左 大 腿 の 筋 肉 内 に 母 指 頭 大 の 硬 結 を 認 め た. Hb 11.2g/dl,白 血 球 数 140,400/μl,血 小 板 数19.7×104/μl,骨 髄 で は NCC96×104/μlで 成 熟 障 害 を伴 わ な い 顆 粒 球 系 過 形 成 を 認 め, NAP値 は32と 低 値,染 色 体 分 析 で は 正 常 核 型 を示 し た. Ph1-CMLの 診 断 の も と, 8月 か らBSF内 服 治 療 を 開 始 し,肝 脾 腫 は 縮 小 し,白 血 球 数 も10,000/μl前 後 で コ ン トロ ー ル で き た た め9月 に 退 院 し た. 1991年5月 白 血 球 数 が35,400/μlと 増 加 し た た め6-mercapto-purine(6MP), vindesine(VDS), prednisolone
(PSL)に 変 更 し,再 び 白血 球 数 は 安 定 し た. 1993年4月 骨 髄 で 芽 球11.6%,前 骨 髄 球37.8% と 増 加 し急 転 の 疑 い で再 入 院 と な っ た.再 入 院 時 自覚 症 状 は な く,肝 を3cm,脾 を5cm触 知, 表 在 リ ン パ 節 腫 大 は な く,神 経 学 的 所 見 に 異 常 は 認 め ら れ な か っ た.白 血 球 数5,000/μl(芽 球 1%,前 骨 髄 球+,好 塩 基 球38%), Hb12.7g/ dl,血 小 板 数25.1×104/μl,染 色 体 分 析 で は46, XYに 加 え て+8, 4p+, 18p+の 付 加 的 異 常 が 認 め られ た. daunorubicin(DNR), vincristine (VCR), PSL,さ ら にetoposide(VP-16), behenoyl-cytosine arabinoside(BHAC)を 投 与 した が 慢 性 期 に は 戻 らず, 12月 胸 水 貯 留,呼 吸 不 全 で 死 亡 し た.剖 検 は 家 族 の 同 意 が 得 ら れ ず 施 行 で き な か っ た. 症 例3: 66歳,男 性. 1987年4月 全 身 倦 怠感 に て 近 医 を受 診 し た 際,白 血 球 増 多,肝 脾 腫 を
Molecular analysis of CML and related diseases 433 表2 Ph1-CMLの 臨 床 ・血 液 所 見 指 摘 さ れ, 7月 某 院 を受 診 し た.初 診 時 肝 を5 cm,脾 を5cm触 知, Hb11.0g/dl,白 血 球 数 は 110,700/μlと 著 増 して お り, hiatusを 伴 わ な い 幼 若 顆 粒 球 が 出 現 し,好 塩 基 球 増 多 は み ら れ な か つ た.血 小 板 数 は30.1×104/μlと 正 常 範 囲 内 で, NAP値 は381と 軽 度 上 昇,骨 髄 はNCC54× 104/μlで 顆 粒 球 系 の過 形 成 を示 し,染 色 体 は正 常 核 型 で あ っ た.そ の 後 白血 球 数 は200,000/μl以 上 と な り,各 種 抗 白 血 病 剤 に も 不 応 性 を示 し, ranimustine(MCNU)で も細 胞 減 少 は み ら れ な か つ た.髄 膜 炎,下 痢 な ど を合 併 し, 1988年5 月 に 死 亡 し た が,最 後 ま で 急 転 像 は 認 め られ な か っ た. 症 例4: 63歳,女 性. 1987年 頃 よ り近 医 で 白 血 球 増 多 を指 摘 され て い た が 放 置 して い た. 1988 年6月 全 身 倦 怠 感,微 熱 が 出 現 し,某 院 を受 診 し,著 明 な 白血 球 増 多 と脾 腫 を 認 め 入 院 と な っ た.家 族 歴 と して 甥 がCML急 転 で 死 亡 し て い る.入 院 時 肝 を2cm,脾 を5cm触 知 し,白 血 球 数96,800/μl,好 塩 基 球5%,血 小 板 数55.4× 104/μl,骨 髄 で も 顆 粒 球 系 細 胞 の 増 多 を 認 め,成 熟 抑 制 は な く,好 塩 基 球3.4%, NAP値121,染 色 体 分 析 で は46, XX, i(17q)を 認 め た. Ph1-CML の 診 断 の も と, BSF内 服 で 治 療 を 開 始 し,自 覚 症 状,血 液 所 見 と も に 改 善 し外 来 通 院 し て い た が, 1989年4月 貧 血 と脾 の 急 激 な 再 腫 大 を認 め 再 入 院 と な っ た.再 入 院 時 肝 を1cm,脾 を6cm 触 知 し,表 在 リ ン パ 節 腫 大 は な く,神 経 学 的 所 見 に も異 常 を認 め な か っ た.赤 血 球 数271×104/ μl, Hb7.4g/dl,白 血 球 数20,000/μl(芽 球 3%,前 骨 髄 球1%,骨 髄 球15%,好 塩 基 球14%) で 好 塩 基 球 増 多 が み ら れ た.血 小 板 数 は18.3× 104/μlと 慢 性 期 よ り は 減 少 し,骨 髄NCC70× 104/μlと 著 増,芽 球4.2%,前 骨 髄 球8.4%と 成 熟 抑 制 傾 向 を伴 う 顆 粒 球 系 細 胞 増 多 を 認 め た. NAP値156,染 色 体 分 析 で は初 回 入 院 時 と 同 様 に46, XX, i(17q)が 認 め られ た.再 入 院 後VP (VCR+PSL)療 法 を施 行 し た が, 6月 頃 よ り 末 梢 血 に 芽 球 の 増 加 を 認 め,急 転 像 が 成 立, 8 月 敗 血 症 を 併 発 し死 亡 し た. 症 例5: 48歳,男 性. 1988年11月,発 熱,白 血 球 増 多 で 近 医 に 入 院, PSLで 軽 快 し た が,貧
血 と幼 若 細 胞 の 出 現 を伴 う 白 血 球 増 多 を 認 め, 1989年4月 某 院 に 入 院 とな っ た.入 院 時 肝 脾 腫 は 認 め ら れ ず,赤 血 球 数296×104/μl, Hb9.6g/ dlと 軽 度 の 貧 血 を 認 め,白 血 球 数 は20,000/μlで, 低 率 な が ら芽 球,前 骨 髄 球 の 出 現 を 認 め た.血 小 板 数21.1×104/μl,骨 髄 で はNCC55×104/μl で 成 熟 抑 制 を伴 わ な い 顆 粒 球 系 細 胞 の 増 多 を 認 め た. NAP値 は33と 低 下 し,染 色 体 分 析 で は8 番 染 色 体 の ト リ ソ ミー が 認 め られ た.同 年6月 退 院 し無 治 療 で 経 過 観 察 し て い た が,白 血 球 増 加 傾 向 の た め 近 医 に てBSFの 投 与 が 開 始 さ れ た.さ ら に 発 熱 エ ピ ソ ー ドを 認 め る よ うに な り, 1992年1月 再 入 院 と な っ た.再 入 院 時 の 骨 髄 検 査 で はNCC107×104/μlと 著 増 し,分 類 で は 著 明 な 顆 粒 球 系 細 胞 増 多 を 認 め,芽 球5.2%とac celerated phaseへ の 移 行 が 疑 わ れ た. BSF, 6 MP, hydroxyurea(HU)な ど に て 対 応 し た が, 貧 血,血 小 板 減 少 が 進 行 し て 骨 髄 不 全 の 状 態 と な り, 1992年11月 呼 吸 不 全 の た め 死 亡 し た.な お, 1992年9月 施 行 の 骨 髄 検 査 で は 芽 球18.8%, 前 骨 髄 球41.6%とhiatusの 形 成 が 認 め られ,急 転 像 が 成 立 し た.ま た 骨 髄 液 の 染 色 体 検 査 で 初 診 時 の+8に 加 え て1992年8月 にt(9; 22) (q34; q11)が20細 胞 中17細 胞 に 認 め られ た. 2)bcr再 構 成 の 検 討(図6) 症 例1, 2で はPh1+CMLと 同 様 にbcr再 構 成 が 認 め ら れ た が,他 の3例 で はTransProbe -1を 用 い て もbcr再 構 成 は 認 め ら れ な か っ た. Late-appearing Ph1が み ら れ た 症 例5で は, Ph1 出 現 後 の 検 索 に お い て もM-bcr領 域 で の 再 構 成 は 認 め ら れ ず,さ ら にminor-bcr(m-bcr)領 域 で の 切 断 に つ いてRT-PCR法 に よ りBCR/ABL mRNAの 検 索 をお こ な っ た が, chimeric mRNA
の 出 現 は 認 め ら れ な か っ た11). 4. JCML, CNL, CMMLに お け るbcr再 構 成 の 検 討 JCML 2例, CNL 3例, CMML 9例 で は 全 例 でbcr再 構 成 は 認 め ら れ な か っ た. 5.慢 性 骨 髄 増 殖 性 疾 患(CMPD)に お け るbcr 再 構 成 の 検 討 PV 8例, ET 15例, MF 4例 で は 全 例 でbcr再 構 成 は 認 め ら れ な か っ た.
図6 Southern blot analyisに よ るPh1-CMLの bcr再 構 成 の 検 討
上 段 に22番 染 色 体 のbcr周 辺 の 制 限 酵 素 地 図 を 示 す. Probeと し て3'bcr probe(a)と Trans Probe-1(b)を 用 い た. Probe(a)で は Bgl IIに よ る切 断 で4.8kb, BamHIに よ る 切 断 で3.3kbの, probe(b)で はBgl IIに よ る 切 断 で4.8kb, 2.3kb, 1.1kbのgermlineバ
ン ドが み ら れ る.症 例1.2で は 再 構 成 バ ン ドが 認 め ら れ た が,症 例3, 4, 5で は 認 め ら れ な か っ た. (B=Bam HI, Bg=Bgl II, E=Eco RI, H=Hind III)
考 察
CMLで はPh1染 色 体 が95%以 上 の症 例 に 認め ら れ1),こ れ に よ り生 じたbcr再 構 成 とBCR/
ABL融 合 型mRNAあ る い はBCR/ABL蛋 白
の 検 討 が そ の 診 断 と病 態 解 析 に 応 用 さ れ つ つ あ る2-4).今 回 著 者 は, Ph1+CMLとvariant Ph1+ CMLのbcr再 構 成 に つ い て 解 析 し,病 期 ・病 態 と の 関 連 に つ い て 検 討 す る と 同 時 に, Ph1-CML/UCMPD, JCML, CNL, CMML, CMPD な どCML周 辺 疾 患 のbcr再 構 成 に つ い て も検 討 し た わ け で あ る が, standard Ph1+CML54例 中52例, variant Ph1+CML3例, Ph1-CML5 例 中2例 でbcr再 構 成 が 認 め られ,そ の 他 の 疾 患 で は 認 め られ な か っ た. 3'側bcr probeでbcr 再 構 成 の 認 め られ な か っ たstandard Ph1+CML 5例 の う ち3例 は他 のprobeで 再 構 成 を認 め, bcr 3'側 の 部 分 的 な 欠 失12,13)と考 え ら れ るが, 残 る2例 は い ず れ のprobeを 用 い て もbcr再 構 成 を 認 め な か っ た.こ の よ う にbcrに 変 化 の
Molecular analysis of CML and related diseases 435 な いCML症 例 も ま れ に 報 告 され て い るが14-17), CMLで は 高 率 にbcr再 構 成 を 認 め て お り,そ の 病 因 論 的 あ る い は 診 断 学 的 意 義 は 極 め て 高 い もの とい え よ う.さ らに 著 者 はvariant Ph1+CML につ い て も検 討 を加 え た が まず症 例1は46, XX, t(9; 22; 13)(q34; q11; q22)の 複 合 転 座 で, 9q34上 のABLは22q11に 転 座 し てBCR/ABL の 近 接 が 生 じて い る も の と,ま た症 例3は ま ず 9番 と22番 のstandard Ph1転 座 を 生 じ,そ の 後 さ ら に9番 で腕 内 逆 位 を起 こ した もの と思 わ れ, 染 色 体 レベ ル でBCR/ABLの 融 合 が 説 明 可 能 と考 え られ る.一 方,症 例2は こ れ まで に 報 告 の な いt(9; 22)(q21; q11)を 呈 し, 9番 の 切 断 点 はq21で, q34のABLか ら は るか に 離 れ た と こ ろ に あ り,こ の 転 座 だ け で はBCR/ABLの 近 接 は 証 明 しに くい. Ohyashikiら18)はt(9; 22)(q22; q11)のCMLに つ い てstandard Ph1 転 座t(9; 22)(q34; q11)が 成 立 し た 後 に9q22 →q34がPh1染 色 体 の 長 腕 末 端 に 転 座 し た とい う 複 雑 な 転 座 の 可 能 性 を 推 定 して い る が,本 例 で も 同様 の 機 転 が 生 じ た 可 能 性 が 推 定 さ れ, CML の 病 因 論 と して 分 子 レベ ル で のBCR/ABL融 合 の 重 要 性 を 強 く示 唆 す る も の で あ ろ う. ま たCMLで は 多 くの 症 例 が 数 年 の 間 に 急 性 転 化 を き た す が,そ の 機 序 に つ い て は 未 だ 解 明 さ れ て い な い. BCR/ABL遺 伝 子 の 量 的 増 加(増 幅)19)や,質 的 変 化20),慢 性 期 と急 転 時 と で はbcr 内 の 切 断 部 位 の 局 在 が 異 な る と の 報 告 も み られ る が21),今 回 の 検 討 で は 慢 性 期 と急 転 時 とでbcr 内 の 切 断 部 位 の 局 在 に 差 は 認 め られ ず,同 一 症 例 に お け る慢 性 期 と急 転 時 のbcr再 構 成 パ ター ン も不 変 で あ っ た.急 転 の 機 序 に つ い て は 最 近, 癌 抑 制 遺 伝 子p53の 再 構 成 や 欠 失,点 突 然 変 異 とい っ た構 造 上 の 変 化 が 骨 髄 性 急 性 転 化 例 で 高 頻 度 に 認 め られ た と い う報 告 やRb蛋 白質 が 巨 核 芽 球 性 急 性 転 化 症 例 で は 検 出 され な か っ た と の 報 告 が な され22,23), lineage特 異 性 か ら も注 目 さ れ て い る.ま たWetzlerら24)は 骨 髄 性 あ る い は 分 類 不 能 型 急 転 例6例 の 骨 髄 間 質 細 胞 を培 養 し た 結 果, 5例 で イ ン ター ロ イ キ ン-1β(IL-1 β)とIL-6 mRNAの 発 現 を 認 め,こ の 発 現 は リ ン パ 性 急 転 例,増 悪 期 例,慢 性 期 例 で は 認 め られ な か っ た こ と,さ ら に 急 転 細 胞 と骨 髄 間 質 細 胞 との 混 合 培 養 でIL-1β とIL-6の 発 現 が 認 め られ た こ とか ら,ト ラ ン ス フ ォ ー ム し た 急 転 ク ロ ー ン か ら産 生 さ れ るIL-1β が 骨 髄 間 質 細 胞 を刺 激 す る こ と に よ っ て 各 種 造 血 因 子 が 産 生 さ れ,こ れ がCMLの 進 展 に 関 係 して い る の で は な い か と推 定 し て い る.こ の よ うにCMLの 進 展 に は 多 因 子(癌 抑 制 遺 伝 子 の 不 活 性 化,各 種 癌 遺 伝 子 の 活 性 化 あ る い は 増 幅,造 血 因 子 の 量 的 ・質 的 変 調 な ど)が 多段 階 的 に 関 与 し,急 転 像 へ と移 行 して ゆ くの で は な い か と考 え られ る. さ て こ れ ま で 臨 床 血 液 所 見 がCMLに 類 似 し な が ら もPh1染 色 体 が 認 め られ な い症 例 がPh1-CMLと して 報 告 さ れ て き た5-7).こ れ ら 症 例 は Ph1+CMLと 比 較 して 高 齢 の 男 性 に 多 く,脾 腫 が 軽 度 で,好 塩 基 球 増 多 を 認 め ず,血 小 板 数 が 少 な く,か っ 治 療 に 抵 抗 性 を示 し,生 存 期 間 が 短 い 点 な どか らCMLと は 別 の 疾 患 概 念 で 把 握 さ れ て き た こ と も あ る.ま た 高 齢 化 社 会 の 出 現 を 背 景 と し て 従 来 のCMPDに 該 当 し な い 症 例, す な わ ちUCMPDと せ ざ る を得 な い 症 例 に遭 遇 す る機 会 が 増 え,Ph1-CMLを 含 め た 病 因 と臨 床 的 位 置 づ け が 注 目 され る. Pughら25)はPh1-CML と さ れ る25例 を 形 態 学 的 に 再 検 討 し た 結 果, 17 例 は 骨 髄 異 形 成 症 候 群(Myelodysplastic syn dromes; MDS), 7例 はCMPDあ る い は reactive conditionsで あ っ た と し, Ph1-CMLと い え る もの は1例 の み で あ っ た と してい る. Travis ら8)はPh1-CMLと さ れ る22例 を 再 検 討 し た 結 果, 13例 はCMML, 1例 はCMML-t, 3例 は preleukemic syndrome, 5例 はUCMPDに 分 類 さ れ た と し, Katoら9)も ①Ph1-, ②hiatus leukemicusを 認 め な い 骨 髄 球 系 細 胞 の 永 続 的 な 増 加(2×1010/1以 上), ③ 成 熟 障 害 を伴 わ な い 骨 髄 過 形 成, ④ 脾 腫, ⑤ 診 断 後 最 低1年 間 生 存 す る 症 例 をPh1-CMLと し,こ れ ら症 例 のbcr 再 構 成 に つ い て 検 討 し た 結 果, 2例 にbcr再 構 成 を 認 め, bcr再 構 成 の 認 め ら れ な か つ た6例 は お の お のUCMPD, CMML, CNL, CML様 症 候 群 に 分 類 さ れ た と して い る.今 回著 者 は, 臨 床 像 な ら び に 血 液 所 見 か らPh1-CMLあ る い はUCMPDと し た5例 に つ い て 検 討 し た 結 果, 2例 にbcr再 構 成 を認 め た. Morrisら26),はPh1-CMLにbcr再 構 成 を 認 め, ABLのbcr内 へ
の 挿 入 や,複 雑 な 転 座 に よ っ てPh1-で も分 子 レ ベ ル で はBCR/ABLの 近 接 を 生 じ て い る も の と 述 べ て お り, Ph1-で もbcr+の 症 例 は,分 子 レ ベ ル で はPh1+CMLと 同 一 に 論 じ ら れ る も の と 考 え ら れ る.そ れ で はbcr-の 症 例 を 如 何 に 把 握 す れ ば よ い の か. BCR/ABL融 合 の 関 与 し な い CMLす な わ ちPh1-bcr-CMLが 存 在 す る の か. 存 在 す る と す れ ばPh1+bcr+CMLと 比 較 し,何 等 か の 特 徴 が 臨 床 的 に 存 在 す る の か.ま た そ の 病 像 発 現 は 如 何 な る機 序 に よ る の か と い っ た 問 題 が 提 起 さ れ る. Kurzrockら27)は 臨 床 ・血 液 所 見 がCMLに 類 似 し, CML以 外 のCMPDあ る い はMDSが 否 定 さ れ, Ph1, bcr再 構 成 と も陰 性 で あ っ た11例 をPh1-bcr-CMLと し,そ の 臨 床 像,血 液 学 的 所 見 を 解 析 し て い る が,染 色 体 分 析 で は 正 常 核 型 を 示 し た もの は6例 で, 他 の5例 は 正 常 核 型 と異 常 核 型 との モ ザ イ ク を 示 し, +8, +19, +21, i(17q), 20q-な ど が 認 め ら れ て い る.ま た 臨 床 像 をbcr+CMLと 比 較 し た 結 果,病 初 期 に は 年 齢 層 が 高 齢 で あ る こ と以 外 に 差 は 認 め ら れ て い な い が,病 期 が 進 行 す る に つ れ 両 者 の 病 像 が 異 な っ て くる.す な わ ちbcr+ CMLが 急 激 な 幼 若 細 胞 の 増 加 に よ って 特 徴 づけ ら れ る 急 転 像 へ と進 展 し て い くの に 対 し, bcr-CMLで は 芽 球 の 著 明 な 増 加 を伴 わ ず,白 血 球 増 多,臓 器 腫 大,髄 外 浸 潤 を示 し,最 終 的 に は 貧 血 と 血 小 板 減 少 を伴 う骨 髄 不 全 へ と進 展 して い く点 が 特 徴 的 で あ っ た と し て い る.今 回bcr再 構 成 を認 め な か っ た3症 例 に つ い て そ の 臨 床 ・ 血 液 所 見 を み る と,症 例5を 除 き肝 脾 腫 を認 め, 全 例 に 幼 若 細 胞 の 出 現 を伴 う顆 粒 球 増 加 と 貧 血 を 認 め,血 小 板 数 は 症 例4を 除 き正 常 範 囲 内 で あ っ た.骨 髄 検 査 で は 成 熟 抑 制 を伴 わ な い 顆 粒 球 系 細 胞 増 加 を 認 め, NAPは 症 例3を 除 き低 値 を示 した.こ の よ う に 各 症 例 に つ い て み る と, 血 小 板 増 加,好 塩 基 球 増 加 あ る い はNAP低 値 な ど を 欠 く もの が あ り,典 型 的 なCMLと は 若 干 そ の 病 像 を 異 と す る が,病 像 の 主 体 は 顆 粒 球 系 細 胞 の 増 殖 病 態 に あ り, Ph1-bcr-CMLの 存 在 を 強 く示 唆 す る もの で あ ろ う。 そ れ で は こ の よ う な 病 態 は 如 何 な る 機 序 に よ っ て 引 き起 こ さ れ る の か.症 例4で は 初 診 時 よ りi(17q)が 認 め ら れ た が,こ れ はCML急 転 時 の 付 加 的 染 色 体 異 常 と して し ば し ば み ら れ る もの で, 17番 染 色 体 の 長 腕 に はG-CSF遺 伝 子 が28),ま た 短 腕 に は 癌 抑 制 遺 伝 子 で あ るp53遺 伝 子 が 位 置 して お り, 17番 染 色 体 の 異 常 が 病 態 に な ん らか の 影 響 を及 ぼ し た 可 能 性 も 考 え られ る.ま た 症 例5で は 初 診 時 の+8に 加 え て 発 症 か ら45ヶ 月 後 にPh1 が 出 現 し た. CMLでPh1が 初 診 時 に は 認 め られ ず,経 過 中 に 出 現 す るlate-appearing Ph1の 存 在29,30)は, Ph1が 癌 化 の 第 一 段 階 か ど うか と い う 疑 問 を投 じて い る31).こ れ ま で に 報 告 され たlate appearing PhlのANLL症 例(M2, M6, M 7)で は 各 々M-bcr再 構 成 も新 た に 出 現 して お り32-34),ま たM1, M4, M7の 症 例 でBCR/ ABL蛋 白 はp190の も の とp210の もの とが 報 告 さ れ て い る が34-36),本 例 で は 検 討 した 範 囲 内 で はM-bcr, m-bcrと も に 切 断 点 は 確 認 さ れ な か っ た. Saglioら17)は 従 来 のM-bcrか ら20kb下 流 で 切 断 し た と考 え られ るPh1+CML 2例 を 報 告 し て い る が,本 例 が こ れ ら の 症 例 に 相 当す る の か ど うか 今 後 の 課 題 と考 え られ る.そ の他RAS 遺 伝 子 の 変 異 がPh1-bcr-CMLに お い て 高 頻 度 に み ら れ た との 報 告37)も あ るが,未 だ 明 確 に は さ れ て い な い.こ れ ら症 例 は 比 較 的 高 齢 者 に 多 い こ と も特 徴 の ひ とつ で あ り,今 後 老 化 の 分 子 生 物 学 的 解 明 と あ わ せ,癌 遺 伝 子 の 活 性 化.増 幅, 癌 抑 制 遺 伝 子 の 変 異,造 血 因 子 の 変 調 な どの 検 討 が 必 要 と考 え られ る. CMPDはDameshekに よ り提 唱 さ れ た 疾 患 概 念 で あ り38),臨 床 的 に はCML, PV, ET, MF な ど を 包 括 し た も の で あ るが,各 疾 患 に お け る 相 互 移 行,あ る い は 病 像 の 重 複 な ど が 注 目 さ れ て い る.今 回PV 8例, ET 15例, MF 4例, CNL 3例, JCML 2例, CMML 9例 を対 象 にbcr再 構 成 に つ い て 検 討 した が,対 象 症 例 で は 全 例 に お い てbcr再 構 成 は 認 め られ ず, CMPD に お け るbcr再 構 成 の 検 討 はCMLを 除 外 す る た め に 必 須 の 検 索 と い え よ う. ま たJCMLは 小 児 の な か で も 比 較 的 乳 幼 児 に 多 く, Ph1-, HbF増 加,末 梢 血 の 単 球 増 加,血 小 板 減 少 を 伴 い,予 後 不 良 の 疾 患 で あ る.末 梢 血 のinvitro培 養 で マ ク ロ フ ァー ジ コ ロ ニ ー が 優 位 性 を 示 す こ と な どか ら, CMLと は 別 の疾 患 概 念 に 入 れ る べ き と の 見 方 も あ る39,40).今 回
Molecular analysis of CML
and related diseases
437
JCML 2例 に つ い てbcr再 構 成 は 認 め ら れ ず, こ の 点 か ら も成 人 型CMLと は 異 な っ た 病 態 を 示 し,そ の 病 因 に つ い て は 多様 性 が 推 定 さ れ る が,成 人 に お け るPh1-bcr-CMLの 成 因 を 検 討 す る上 で 共 通 の 領 域 を有 す る も の で は な い か と 考 え られ る. 今 後 ひ ろ く慢 性 骨 髄 増 殖 病 態 でbcr再 構 成 の 検 討 が な さ れ る こ と に よ りPh1-bcr-CML/ UCMPD症 例 の 集 積 が な さ れ て ゆ くも の と思 わ れ るが,そ の 臨 床 像 と 血 液 学 的 所 見 の よ り詳 細 な解 析 の な か で,疾 患 の 独 立 性 が 明 確 に され る と と も に 慢 性 骨 髄 増 殖 病 態 の 再 整 理 が な され て ゆ く も の と 思 わ れ る. 結 論 今 回, CMLと そ の 周 辺 疾 患 のbcr再 構 成 に つ い て 検 討 し た 結 果, 1. Standard Ph1+CML 54例 中52例, 96%に bcr再 構 成 が 認 め られ た. 2. Standard Ph1+bcr+CML 49例(慢 性 期38 例,急 転 期2例,慢 性 期 → 急 転 期9例)に お い てbcr内 切 断 部 位 と病 期 ・病 態 移 行 との 関 連 に つ い て 検 討 した が,両 者 に 関 連 は 認 め ら れ な か っ た. 3. Variant Ph1+CML3例[症 例1: 46, XX, t(9; 22; 13)(q34; q11; q22),症 例2: 46, XX, t(9; 22)(q2l; q11),症 例3146, XX, t(9: 22)(q34; q11), inv(9)(9q22; 22q13)]で はbcr再 構 成 が 認 め られ た.な お,こ れ ま で 報 告 の な い 転 座 様 式 を示 す 症 例2で はt(9; 22) (q34; q11)が 成 立 し た 後 に9q21→q34がPh1染 色 体 の 長 腕 末 端 に 転 座 し た も の と推 定 さ れ た. 4-Ph1-CMLで は5例 中2例 にbcr再 構 成 が 認 め られ,分 子 レベ ル でPh1+CMLと 同 様 の 変 化 が 生 じて い る も の と考 え ら れ た が, 3例 で はbcr再 構 成 は 認 め ら れ ず, UCMPDあ る い はPh1-bcr-CMLと して 位 置づ け られ る も の で あ っ た. 5. JCML 2例, CNL 3例, CMML 9例 で はbcr再 構 成 は 認 め ら れ な か っ た. 6. PV 8例, ET 15例, MF 4例 で はbcr 再 構 成 は 認 め られ な か っ た. 以 上 の 結 果 を 得 た が, bcr再 構 成 はCMLに 特 異 性 が 高 く,今 後 そ の 検 討 はPh1-CML, UCMPDの 病 態 解 析,な か で もPh1-bcr-CML の 疾 患 独 立 性 の 検 討 と,ひ ろ く慢 性 骨 髄 増 殖 病 態 の 再 整 理 に 重 要 な 情 報 を 提 供 す る もの と考 え ら れ る. 稿 を終 え る に あ た り御 指 導,御 校 閲 を賜 った 木 村 郁 郎 教 授 な ら び に高 橋 功 講 師 に深 甚 な る謝 意 を表 し ます. (本研 究 の 要 旨は 第49回 日本 血 液 学 会 総 会,第29回 日本 臨 床 血 液 学 会 総 会(シ ンポ ジ ウム)で 発 表 した.)文
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