Clostridium thermocellum を用いたセルロースからのグルコース生産

(1)

1

修士論文

BGL 発現細菌と

Clostridium thermocellum を用いたセルロースからのグルコース生産

平成 30 年度 2 月 12 日

教育学研究科理数生活系教育領域

伊藤敏之

(2)

2

要旨

第１章緒論

第

2

章

Clostridium thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

を用いたグルコース生産

第１節目的

第２節材料と方法

2-2-1 BGL

活性測定

2-2-2 C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

を用いたグルコース生産第３節結果

2-3-1 BGL

発現

B. subtilis

培養液の

BGL

活性

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いた精製セルロースからのグルコース生産

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いたセルロース系バイオマスからのグルコース生産

と

BGL

発現

B. subtilis

の共培養によるグルコース生産

2-3-5

ジャーファーメンターでの

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いたグルコース生産

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いたグルコース生

産時における精製

BGL

添加

(3)

3

第４節考察第５節図表

第

3

章

BGL

活性を有する土壌細菌探索第１節目的

第２節材料と方法

3-2-1

培地作成と土壌細菌の培養

3-2-2 土壌細菌培養液のBGL

活性測定第３節結果

3-3-1 BGL

活性を有する土壌細菌の単離

3-3-2 BGL

活性を有する土壌細菌を用いたグルコース生産

第４節考察第５節図表

第

4

章

C. thermocellum

と

BGL

発現

Escherichia coli

を用いたグルコース生産第１節目的

第２節材料と方法

4-2-1 BGL

発現

E. coli

の

BGL

活性

と

BGL

発現

E. coli

を用いたグルコース生産第３節結果

4-3-1 BGL

発現

E. coli

の

BGL

活性測定

と

BGL

発現

E. coli

培養液を用いた精製セルロースからのグルコース生産

と

BGL

発現

E. coli

の培養液を用いたセルロース系

(4)

4

バイオマスからのグルコース生産

と

BGL

発現

E. coli

の共培養によるグルコース生産第４節考察

第５節図表

第

5

章

C. thermocellum

と

BGL

発現

Brevibacillus choshinensis

を用いたグルコース生産

第１節目的第２節材料と方法

5-2-1 BGL

遺伝子の調製と

B. choshinensis

の形質転換

5-2-2 BGL

発現

B. choshinensis

の選抜

5-2-3 セルラーゼ活性測定

培養液からのセルロソームの回収第３節結果

5-3-1 BGL

発現

B. choshinensis

の

BGL

活性測定

5-3-2 BGL

発現

B. choshinensis

の

60℃処理での死滅

と精製

BGL

を用いたグルコース生産

と精製

BGL

を用いた

BGL

活性別グルコース生産

と

BGL

発現

B. choshinensis

用いた精製セルロースか

らのグルコース生産

と

BGL

発現

B. chosinensis

を用いた培養条件別グルコース生産

5-3-7 BGL

発現

B. chosinensis

の大量培養

と

BGL

発現

B. chosinensis

を用いた培地成分別グルコ

(5)

5

ース生産

5-3-9 グルコース生産におけるセルロソームの添加の影響

5-3-10

バイアル瓶を用いたグルコース生産

第４節考察第５節図表

参考文献

謝辞

(6)

6

第

1

章緒論

近年、地球温暖化対策として、原因と考えられている二酸化炭素の排出削減が世界的な課題となっている。二酸化炭素の排出削減には、化石資源の使用を削減することと、より二酸化炭素の排出量の少ない資源を利用することが必要になる。そのため、現在、非化石資源の利用拡大が進められている（石油連盟、

2015）

。非化石資源である植物バイオマスは、持続的利用が可能な再生可能資源であり、

また、燃焼により大気中の二酸化炭素の増減に影響しないカーボンニュートラルである点において二酸化炭素の排出削減に有効である。その中でも、地球上に豊富に存在し、食糧と非競合である草本系、木質系といったセルロース系バイオマスは、安定供給が可能であるため、化石燃料に代わる有力な非化石資源として挙げられる（村上、2008）。セルロース系バイオマスを原料とするエネルギー製品や化学製品の製造では、微生物が利用できる糖を原料とする微生物発酵が用いられている。そのため、セルロース系バイオマスに含まれる多糖類であるセルロースを分解して、発酵可能なグルコースを得ること必要になる。

セルロースの分解には、硫酸などを用いる化学的手法に比べて環境への負荷が低く、さらに発酵阻害物質の生成を抑制できるメリットがある微生物由来の酵素が用いられる。現在、セルロース分解に用いられる酵素は、真菌由来の酵素である（近藤ら、

2012

）。しかし、酵素添加によるセルロースの分解は、高コストな酵素を大量に必要とするため、グルコース生産により多くの費用を要することになる。

そこで本研究では、酵素添加を必要とせず、セルロース系バイオマスを分解で

きる

Clostridium thermocellum

という細菌に注目した（

Demain

ら、

2005

）。好熱嫌

気性細菌である

C. thermocellum

は、多種類のセルロース分解酵素を持ち、セル

(7)

7

ロース系バイオマスを効果的に分解する酵素複合体と呼ばれるセルロソームを生産する。C. thermocellum は、このセルロソームによりセルロースを分解して、

主に二糖であるセロビオースを生産することができる。そして、生産したセロビオースを栄養源として利用して様々な代謝物を生産する。先行研究では、セルロースを含む

C. thermocellum

の培養液に、セロビオースをグルコースに変換する酵素である

β -グルコシダーゼ（BGL）を添加したとき、培地中に多くのグルコ

ースが蓄積させることができた（

Prawitwong

ら、

2013

）。これは、添加された

BGL

により、セロビオースからグルコースへの変換が促進されたためである。

セルロースからのグルコース生産の実用化には、よりコストの低いグルコース生産技術の開発が必要である。高価な精製

BGL

の添加を必要とする先行研究の方法では低コスト化が難しいので、酵素添加を必要としないグルコース生産が求められる。C. thermocellum を遺伝子工学的手法を用いて改変し、BGL を発現・分泌させることで、

BGL

の添加を省くことが試みられたが、その時の

BGL

活性は必要量の

1/500

であった（市原ら、2015）。

堆肥中では

C. thermocellum

と

Bacillus

属細菌は共存しているため、

C.

thermocellum

と Bacillus 属細菌を共培養できるのではないかと考えた（伊藤、

2016

）。

Bacillus subtilis

は遺伝子組み換えしやすく、目的のタンパク質の生産に

長けているためこの細菌を

BGL

発現細菌として用いる事を構想した。

BGL

発現細菌として大腸菌

Escherichia coli

にも着目した（市原、

2017

）。

C.

thermocellum

の培養最適温度が

60℃であること（Olson

ら、2012）、また、大腸

菌の生育可能な最高温度が

40~55

℃であることに注目した（一色、

2010

）。これ

より、菌体内に

BGL

を発現した大腸菌（BGL 発現

E. coli）を、C. thermocellum

の培養液に添加した時、大腸菌の死滅・溶菌により、菌体内の

BGL

が菌体外に

放出されると予想した。そして、放出された

BGL

により、セロビオースが分解

(8)

8

され、グルコースを生産することができれば、菌体破砕や精製などの工程を削減でき、BGL の調製工程の簡略化につながると考えた（市原

2017）

。

大量の

BGL

を発現・分泌できる細菌を新たに開発することを目的に、

Brevibacillus choshinensis

にも着目した。B. choshinensis はタンパク質を大量に分泌生産する特長を有しており、加えてプロテアーゼ活性をほとんど示さず、培養、

滅菌が容易で遺伝子操作がしやすいため（TAKARA）、この細菌に

BGL

を発現させることを構想した。

本研究では、B. subtilis、E. coli、B. choshinensis に

BGL

を発現させる方法を提案する。

B. subtilis

、

E. coli

、

B. choshinensis

に

BGL

を発現させることができれば、

これを利用することでセルロース系バイオマスから低コストでグルコースを大量に得ることができるものと予想される。この仮説を実証するために、

B. subtilis

、

E. coli、B. choshinensis

を遺伝子工学的手法を用いて改変し

BGL

を発現させ、こ

れを利用してグルコースを生産することを試みた。

(9)

9

第２章

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

を用いたグルコース生産

第

1

節目的

セロビオースをグルコースに分解する酵素である

BGL

を添加したとき、培地中に多くのグルコースが蓄積させることができた（

Prawitwong

ら、

2013

）。セルロースからのグルコース生産の実用化には、よりコストの低いグルコース生産技術の開発が必要である。高コストである

BGL

の添加を必要とする先行研究の方法では低コスト化が難しいので、酵素添加を必要としないグルコース生産が求められる。堆肥中では

C. thermocellum

と

Bacillus

属細菌は共存しているため、

C. thermocellum

と Bacillus 属細菌を共培養できるのではないかと考えた（伊藤

ら、

2016

）。

B. subtilis

は遺伝子組み換えしやすく、目的のタンパク質の生産に長

けているためこの細菌を用いる事を構想した。磯崎は

BGL

発現

B. subtilis

（以降

BGL

発現

B. subtilis

）を創出した（磯崎、

2018

）。創出した株を用いてセルロース

からのグルコース生産を目的とした。

(10)

10

第２節材料と方法

2-2-1 BGL

活性測定

5ml

の

LB

培地で

BGL

発現

B. subtilis

を

1

晩、37℃、180 rpm で振とう培養した。

500 μl

の培養液をマイクロチューブに移した。

15000 rpm

で２分間遠心分離を行い、菌体を沈殿させ、上清を回収した。また、

500 μl

の培養液をマイクロチューブに移し、

60

℃

1

時間インキュベートし、

15000 rpm

で２分間遠心分離を行い、菌体を沈殿させ、上清を回収した。これらを

BGL

活性測定の酵素溶液とした。

100μl

の

10 mM p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド (pNPG)

と、280 μl の

5 mM CaCl2

含有

100 mM

酢酸バッファー（

pH 6.0

）を試験管にとり、

3

分間

60℃でプレインキュベーションした。20 μl

の

BGL

溶液をここに加え、60℃で

インキュベーションした。

10

分後、反応を止めるために

600μl

の

400 mM Na2CO3

を加えた。15000 rpm で２分間遠心分離を行い、その上清の波長

410 nm

の吸光度を測定した。

pNPG

は

BGL

により分解されると、グルコースと

p-ニトロフェノールを生じ

る。

1

分間に

1 μmol

の生成物を生じるとき、これを１ユニット

(U)

と定義する。

1 mM p-ニトロフェノールの吸光係数は18.6

である。ここから、10 分間に

0.186

の吸光度の増加がある場合、酵素活性は

50 U/L

とした。

と

BGL

発現

B. subtilis

を用いたグルコース生産

精製セルロース（Sigmacell Cellulose）をそれぞれ

5%、7%、10%、14%含む BM7CO

培地（

1.5 g/l KH2PO4

、

2.9 g/l K2HPO4

、

2.1 g/l urea

、

6.0 g/l yeast extract

、

0.5 g/l cysteine hydrochloride、4 g/l Na2CO3

、

0.5 mg/l MgCl2 6H2O、0.0075 mg/l CaCl2

(11)

11

2H2O

、

25 μl of 1% resazurin

、

pH 7.0

）を調製した（市原ら、

2015

）。また、アルカリ処理粉砕稲わら

5%、10%を含むBM7CO

培地を調製した。試験管に窒素ガスを封入し、密栓することで嫌気条件を作った。

60

度で

C. thermocellum

を接種・

培養し、培養

1

日後に

BGL

発現

B. subtilis

の

LB

培地培養液を 2mL 添加して再び

60

度で静置した。培養液中のグルコース濃度は、グルコース濃度測定キット

（グルコース

CII-テストワコー）を用いて測定した。

(12)

12

第３節結果

2-3-1 BGL

発現

B. subtilis

培養液の

BGL

活性

BGL

発現

B. subtilis

の培養液中の

BGL

活性を測定した（磯崎ら、

2018）

。細胞

を含む培養液の

BGL

活性は

119 U/L

、培養液の遠心分離後上清の

BGL

活性は

62.7 U/L、60℃処理培養液の遠心分離後上清のBGL

活性は 77.1 U/L であった（図１）。培養液の

BGL

活性は上清の

BGL

活性に比べ有意に高かった（

p < 0.01

）。

上清と

60℃処理上清の間には有意な差はなかった。

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いた精製セルロースからのグルコース生産

C. thermocellum

を接種した

5%セルロースを含むBM7CO

培地に、

BGL

発現

B.

subtilis

の培養液を

2mL

添加し、

60

度で静置培養した。培養

16

日目で終濃度

3.6%セルロースから3.2%グルコースが生産された（図２）

。また、精製セルロー

ス濃度を高くすると、培養

8

日目のセルロース残渣量が多くなった（図３）。培養

8

日目における終濃度

3.6%、5%、7.1%、10%セルロースからのグルコース濃

度は、それぞれ

2.7%

、

2.7%

、

1.8%

、

2.1%

であった（図４）。

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いたセルロース系バイオマスからのグルコース生産

C. thermocellum

を接種した

5%

、

10%

アルカリ処理粉砕稲わら含有

BM7CO

培

地に、

BGL

発現

B. subtilis

の培養液を

2mL

添加して

60

度で培養し、培養液中の

グルコース濃度を測定した。

BGL

発現

B. subtilis

培養液添加後

12

日目で、終濃

度

3.6％稲わらから 0.83%グルコースが、終濃度 7.1％稲わらから 2.3%グルコー

(13)

13

スが、培地中に生産された（図５）。

と

BGL

発現

B. subtilis

の共培養によるグルコース生産

3%、 5%、 10%精製セルロースを含む BM7CO

培地で

C. thermocellum

を

60

度

3

日培養し、蓋を開け

BGL

発現

B. subtilis

を接種しモルトン栓をして

37

℃で

2

日間培養した。その後、窒素ガスを再度封入し、60 度で

15

日間培養した。培養

20

日目において、グルコース濃度がそれぞれ

1.62%

、

2.23%

、

2.41%

となった

（図６）。BGL 発現

B. subtilis

接種後

2

日目における

BGL

活性はそれぞれ、

7.44U/L

、

15.2U/L

、

22.8U/L

であった。

2-3-5

ジャーファーメンターでの

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いたグルコース生産

ジャーファーメンターを用いて、

16

日間グルコース生産を行った。培養

16

日目において、終濃度

10%精製セルロースから2.12%グルコースが生産された（図

７）。

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いたグルコース生産時における精製

BGL

添加

10%

精製セルロースを含む培地で

C. thermocellum

を

60

度で培養し、培養

1

日

目に

BGL

発現

B. subtilis

培養液を

2mL

添加した。添加後

60

度インキュベータ

ーで

10

日間培養した。また培養

5

日目に、試験管内の

BGL

活性が

1000U/L

に相当する

BGL

溶液（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 由来

BGL

溶液）を添加した（伊藤、

2016

）。培養

10

日目時点で終濃度

7.1%

セルロースから、

BGL

添加有りは

3.01%、添加無しは2.25 %のグルコースが生産された（図８）

。

(14)

14

第４節考察

高価である精製

BGL

溶液の添加を必要とする先行研究の方法では低コスト化が難しいので、酵素添加を必要としないグルコース生産が求められる

（

Prawitwong

ら、

2013

）。本研究で用いた

BGL

発現

B. subtilis

の

BGL

活性を測定したところ、培養液の

BGL

活性は上清の

BGL

活性に比べ有意に高かった（p

< 0.01

）（図１）。また、

C. thermocellum

培養条件において

BGL

発現

B. subtilis

のグルコース消費はほとんどないことが分かっている（伊藤ら、

2016）。以上から、

グルコース生産時には

BGL

発現

B. subtilis

培養液を

BGL

溶液として直接投入したら良いと判断した。

先行研究では、

C. thermocellum

培養条件において精製

BGL

を添加することで、

10%セルロースから約7%のグルコースが生産されている（Prawitwong

ら、

2013）

。本研究室では、

C. thermocellum

培養条件において

BGL

発現

B. subtilis

を

2mL

添加することで、培養

11

日目において終濃度

3.6%セルロースから 3.0%のグルコ

ースを生産できた（伊藤ら、

2016

）。高濃度のグルコースを生産するために、セルロース濃度を上げてグルコース生産を行ったところ、培養

8

日目において、

終濃度

3.6%

、

5%

、

7.1%

、

10%

セルロースから、

2.7%

、

2.7%

、

1.8%

、

2.1%

グルコースが生産されることがわかった（図４）。したがって

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

を用いた高濃度グルコース生産には課題がある。

培養

12

日目において終濃度

3.6％稲わらから0.83%グルコースが、

終濃度

7.1％

稲わらから

2.3%

のグルコースが、培地中に生産された（図５）。アルカリ処理稲

わら中のセルロース含有量を

50%とすると（市川ら、2016）セルロースからグル

コースへの変換率は、終濃度

3.6

％稲わらでは

46

％、終濃度

7.1

％稲わらでは

65

％

であった。生産されるグルコース濃度は小さいため、稲わらから高濃度グルコー

(15)

15

スを生産するための条件検討も必要となる。

C. thermocellum

の培地で

B. subtilis

の増殖が確認できることから（伊藤ら、

2016

）、

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

を共培養できるのではないかと考えた。共培養の実験では、

3%、 5%、 10%の精製セルロースから培養20

日目において、それぞれ

1.62%

、

2.23%

、

2.41%

のグルコースが生産された（図６）。

BGL

発現

B. subtilis

接種後

2

日目における

BGL

活性はそれぞれ、7.44U/L、15.2U/L、

22.8U/L

であった。共培養におけるグルコース濃度が低い要因として、

BGL

活性

が低いことが考えられた。

先行研究では、グルコース生産時に

130 rpm

、

rotaly shaking

の条件において培養されていた（Prawitwong ら、2013）。また、C. thermocellum 培養時の

pH

の調整により、セルロース系バイオマスから生産されるグルコースが増加することが分かっている（安井ら、2015）。よって、ジャーファーメンターで培養することで、撹拌と

pH

調整をすることを構想した。ジャーファーメンターを用いた培養では、培地中のセルロースの最濃度

10%から、培養 16

日目で

2.1％のグルコ

ースが生産された（図７）。試験管での実験において、終濃度

10%

セルロースを含む培地から培養

8

日で

2.1％のグルコースが生産されていた（図４）。ジャー

ファーメンターによって撹拌、

pH

調整を行ったが、グルコース濃度は上昇しなかった。この要因として、培養時における嫌気度が考えられた。サンプル接種や

pH

調整の際には一時的に蓋を開けていたため、嫌気度が低下していたと予想された。つまり、撹拌、pH 調整による効果を検証できていない可能性がある。

グルコース生産時に精製

BGL

を添加することで、添加無しの場合と比較して、

グルコース濃度が上昇した（図８）。したがって、グルコース生産時における培養液中の

BGL

活性が不足している事が分かった。

以上の結果から、高濃度セルロースから、高濃度グルコース生産をすることに

(16)

16

課題あることが明らかになった。

BGL

添加実験から、グルコース生産時におけ

る培地中の

BGL

活性を上げる必要があることが分かった（図８）。そのため、高

濃度セルロースから、高濃度グルコース生産するには

BGL

活性を上げる必要が

ある。

(17)

17

第５節図表

図１：BGL 発現

B. subtilis

培養液の

BGL

活性

BGL

発現

B. subtilis

を一晩培養した。細胞を含む培養液、培養液の遠心分離後

上清、60℃処理培養液の遠心分離後上清の

BGL

活性を、pNPG を用いて測定した。

(N=3)

0 20 40 60 80 100 120 140

培養液上清 60℃処理上清

BGL活性(U/L)

(18)

18

図２：

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

を用いた

3.6%

セルロースからのグルコース生産

5%

セルロースを含む培地で

C. thermocellum

を

60

度で培養し、培養

1

日目に

BGL

発現

B. subtilis

の培養液を添加した。BGL 発現

B. subtilis

培養液添加後

10

日目、

13

日目、

16

日目の、終濃度

3.6%

セルロースの培養液中のグルコース濃度を測定した。(N=2)

0 5 10 15 20 25 30 35

0 5 10 15 20

グルコース濃度(g/L)

培養日数(日)

(19)

19

図３：濃度別セルロース含有培地でグルコース生産時の培養液の様子

上段は

BGL

発現

B. subtilis

培養液添加前

1

日目、下段は

8

日目の培養液の様子を示す。セルロースを含む培地で

C. thermocellum

を

60

度で培養し、培養

1

日

目に

BGL

発現

B. subtilis

の培養液を

2mL

添加した。セルロース終濃度は、3.5%

（

①②

）、

5%

（

③④

）、

7.1%

（

⑤⑥

）、

10%

（

⑦⑧

）である。

(N = 2)

(20)

20

図４：濃度別セルロース含有培地でグルコース生産

セルロースを含む培地で

C. thermocellum

を

60

度で培養し、培養

1

日目に

BGL

発現

B. subtilis

培養液を

2mL

添加した。添加後

60

度インキュベーターで

8

日間

培養した。グラフ中に示されたセルロース濃度は終濃度を表す。(N = 2)

0 5 10 15 20 25 30

0 2 4 6 8

グルコース濃度 (g/ L )

培養日数(日)

3.7％濃度3.6% 5％濃度5% 7.1%濃度7.1% 10％濃度10%

(21)

21

図５：

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

を用いたアルカリ処理粉砕稲わらからのグルコース生産

アルカリ処理粉砕稲わらを含む培地で

C. thermocellum

を

60

度で培養し、培

養

1

日目に

BGL

発現

B. subtilis

培養液を

2mL

添加した。添加後

60

度インキュ

ベーターで

12

日間培養した。グラフ中に示された稲わら濃度は終濃度を表す。(N=2)

0 5 10 15 20 25

0 3 6 9 12

培養日数（日）

稲わら3.6%

稲わら7.1%

(22)

22

図６：

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

の共培養による精製セルロースからのグルコース生産

精製セルロースを含む

BM7CO

培地で

C. thermocellum

を

60

度

3

日培養し、蓋

を開け

BGL

発現

B. subtilis

を接種しモルトン栓をして

37℃で2

日間培養した。

その後、窒素ガスを再度封入し、

60

度で

15

日間培養した。

(N=2)

0 5 10 15 20 25 30

0 5 10 15 20

3%

5%

10%

(23)

23

図７：ジャーファーメンターを用いた

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

によるセルロースからのグルコース生産

ジャーファーメンターを用いて、

14%

セルロースを含む

BM7CO

培地で、

C.

thermocellum

を

60

度で培養した。培養

1

日目に

BGL

発現

B. subtilis

培養液を

400ml

添加し、

16

日培養した。終濃度

10%

セルロース培養液中のグルコース濃

度を示した。(N = 1)

0 5 10 15 20 25

0 5 10 15

グルコース濃度（ g/ L ）

培養日数(日)

(24)

24

図８：

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. subtilis

培養液を用いたグルコース生産時

における精製

BGL

添加

14%

精製セルロースを含む培地で

C. thermocellum

を

60

度で培養し、培養

1

日

目に

BGL

発現

B. subtilis

培養液を

2mL

添加した。添加後

60

度インキュベータ

ーで

10

日間培養した。また、培養

5

日目に、試験管内の

BGL

活性が

1000U/L

に相当する

BGL

溶液（精製

TtBGL

溶液）を添加した。終濃度

10%セルロース培養

液中のグルコース濃度を示した。

(N=2)

0 5 10 15 20 25 30 35

0 2 4 6 8 10

グルコース濃度（ g/ L)

培養日数

BGL添加あり BGL添加なし

(25)

25

第

3

章

BGL

活性を有する土壌細菌探索

第１節目的

第

2

章では、 BGL 分泌

B. subtilis

を用いたグルコース生産を行った。高濃度セルロースからのグルコース生産では、培養

8

日目においてセルロース残渣が多く、グルコース生産量は向上しなかった（図３、４）。グルコース生産に使用

している

BGL

分泌

B. subtilis

培養液の遠心分離上清の

BGL

活性を測定すると

62

U/L

であった（図１）。

Prawitwong

らの研究では、グルコース生産時の培養液中の

BGL

活性は

1000 U/L

であった（

Prawitwong

ら、

2013

）。

14%

精製セルロースを含む

C. thermocellum

の培養液に

BGL

分泌

B. subtilis

を

2mL

添加し、培養

5

日目に、試験管内の

BGL

活性が

1000U/L

に相当する

BGL

溶液（精製

TtBGL

溶液）

を添加したところ、

BGL

添加条件においてグルコース濃度が

BGL

添加無しに比べ増加した。（図８）。したがって、培養液中の

BGL

活性が不足していることが、

高濃度グルコース生産の１つの課題であることがわかった。BGL 分泌

B. subtilis

は遺伝子組み換えをしているため、廃液処理等の管理費用が大きいことも課題

となる。そこで、BGL 活性を有する新たな微生物を探索することにした。

(26)

26

第２節材料と方法

3-2-1

培地作成と土壌細菌の培養

エスクリンと塩化鉄（Ⅲ）を含む

BM7CO

寒天培地（1.5 g/l KH

2PO4

、2.9 g/l

K2HPO4

、

2.1 g/l urea

、

6.0 g/l yeast extract

、

0.5 g/l cysteine hydrochloride

、

4 g/l Na2CO3

、

0.5 mg/l MgCl2 6H2O、0.0075 mg/l CaCl2 2H2O、1.0 g/L esculin sesquihydrate、0.3 g/L FeCl3 6H2O

、

25 μl of 1% resazurin

、寒天

1%

、

pH 7.0

）を調製した。寒天培地上に土壌懸濁液を塗布し、60 度で培養した。

エスクリンと塩化鉄（Ⅲ）を含む

BM7CO

培地を調製し、

96

ウェルプレート

に

200μL

ずつ入れ、寒天培地上に形成したコロニーをピックアップし、60 度

で

1

晩培養した。

3-2-2

土壌細菌培養液の

BGL

活性測定

10 mM

の

pNPG 100μl

と、280 μl の

5 mM CaCl2

含有

100 mM

酢酸バッファー

（

pH 6.0

）を混合し、

pNPG

溶液とした。この

pNPG

溶液を

96

ウェルプレートに

190μL

ずつ入れ、土壌細菌培養液を

10μL

入れ、1 晩

60

度でインキュベート

することで、

BGL

活性を有する培養液をスクリーニングした。

pNPG

溶液を試験管に

380μL

とり、3 分間

60℃でプレインキュベーションし

た。

20 μl

の

BGL

活性がある土壌細菌培養液を加え、

60

℃で

10

分間インキュベーションした。反応を止めるために

600μl

の

400 mM Na2CO3

を加えた。この溶

液を

rpm 14500

で２分間遠心分離し、上清の波長

410 nm

の吸光度を測定した。

2-2-1

と同様に、10 分間に

0.186

の吸光度の増加がある場合、酵素活性は

50 U/L

とした。

(27)

27

第３節結果

3-3-1 BGL

活性を有する土壌細菌の単離

採取した土壌を滅菌水で懸濁し、寒天培地上に塗布した。60℃で

1

晩培養することで、土壌細菌のコロニーを形成させた（図９）。寒天培地上の茶色を呈色しているコロニーをピックアップし、

96

ウェルプレートにて

60℃で1

晩培養した。茶色の呈色によって、

BGL

活性を有する土壌微生物培養液をスクリーニングした（図９）。新たな

96

ウェルプレートに、pNPG 溶液

190μL

と茶色の呈色を示した土壌微生物培養液を

10

μ

L

加え、

60

℃で

1

晩反応させることで、土壌微生物培養液が

pNPG

分解活性を有していることを確認した（図１０）。その中から特に黄色の呈色が濃いサンプルを選んだ。

BGL

活性を有する細菌をプレート番号から

5-43-1、5-42-1、5-42-2、7-13-1

とした。土壌細菌

5-43-1、5-42-1、5- 42-2

、

7-13-1

の培養液の

BGL

活性を測定すると、

12.6 U/L

、

15.6 U/L

、

17.2 U/L

、

13.4 U/L

であった（N=1）。

3-3-2 BGL

活性を有する土壌細菌を用いたグルコース生産

C. thermocellum

を接種した

5%

セルロースを含む

BM7CO

培地に土壌細菌

5-

43-1、5-42-1、5-42-2、7-13-1

の培養液

2mL

を添加してグルコース生産を行った。

試験管内のセルロース終濃度は

3.6

％である。土壌細菌

5-43-1

、

5-42-1

、

5-42-2

、

7-13-1

の培養液を添加後、培養

13

日目におけるグルコース濃度は

0.65%、0.61%、

0.63%

、

0.64%

であった（図１１）。

(28)

28

第４節考察

BGL

がエスクリンを分解し、分解産物が塩化鉄（Ⅲ）と反応することで茶色を呈色する。エスクリン含有寒天培地上で茶色を呈する土壌細菌コロニーを複数取得することができた（図９）。またこれら細菌の培養液は

pNPG

分解活性を有していた（図１０）。これらの方法で、土壌から

BGL

活性を有する細菌を探索することができた。

これらの土壌細菌

5-43-1、5-42-1、5-42-2、7-13-1

の培養液を用いてグルコース生産を行った結果、培養

13

日目におけるグルコース濃度は

0.65%

、

0.61%

、

0.63%、0.64%であった（図１１）

。2 章では、BGL 発現

B. subtilis

を用いたグルコース生産において、培養

16

日目で終濃度

3.6%

セルロースから

3.2%

のグルコースが生産された（図２）。

BGL

活性を有する土壌細菌の培養液を用いたグルコース生産において、グルコース濃度が低い要因がいくつか予想される。まず、

BGL

活性を有する土壌細菌の

BGL

活性が、BGL 発現

B. subtilis

の

BGL

活性に比べ、約

1/8

であったことである。加えて、

BGL

活性を有する土壌細菌がグルコースを消費する可能性があることである。

BGL

発現

B. subtilis

は

C. thermocellum

培養条件においてグルコースを消費しないことが分かっている（伊藤、

2016

）。

本章では土壌から新たに

BGL

活性の高い土壌細菌の探索を考えたが、

BGL

発現

B. subtilis

以上の

BGL

活性を有する微生物を土壌から単離してくることは難し

いと判断した。

(29)

29

第５節図表

図９：エスクリンと塩化鉄（Ⅲ）を含む

BM7CO

培地での土壌細菌の培養（左図：寒天培地右図：液体培地）

採取した土壌を滅菌水で懸濁し、寒天培地上に塗布した。60℃で

1

晩培養

することで、土壌細菌のコロニーを形成させた。寒天培地上の茶色を呈色してい

るコロニーをピックアップし、96 ウェルプレートにて

60℃で1

晩培養した。

(30)

30

図１０：土壌細菌培養液の

pNPG

分解活性

96

ウェルプレートに、

pNPG

溶液を

190μL

と土壌細菌培養液

10 μL

をいれ、

60℃で1

晩反応させた。BGL 活性を有する微生物の培養液が入っている場合、

黄色が呈色する。

(31)

31

図１１：

C. thermocellum

と

BGL

活性を有する土壌細菌を用いた

3.6%セルロース

からのグルコース生産

5%セルロースを含む培地でC. thermocellum

を

60

度で培養し、培養

1

日目に

BGL

活性を有する土壌細菌の培養液を添加した。終濃度

3.6%

セルロースの培養液中のグルコース濃度を測定した。(N=1)

0 1 2 3 4 5 6 7

0 5 10 15

グルコース濃度 (g /L)

培養日数（日）

5-43-1

5-42-1

5-42-2

7-13-1

(32)

32

第

4

章

C. thermocellum

と

BGL

発現

E. coli

を用いたグルコース生産

第１節目的

先行研究では、セルロースを含む

C. thermocellum

の培養液に、セロビオースをグルコースに変換する酵素である

BGL

を添加したとき、培地中に多くのグルコースが蓄積させることができた（

Prawitwong

ら、

2013

）。セルロースからのグルコース生産の実用化には、よりコストの低いグルコース生産技術の開発が必要である。高コストである

BGL

の添加を必要とする先行研究の方法では低コスト化が難しいので、酵素添加を必要としないグルコース生産が求められる。

第２章では

BGL

分泌

B. subtilis

を開発し、これを、セルロースを含む

C.

thermocellum

の培養液に添加することで、酵素添加を必要としないグルコース生

産を達成できた。市原らは、

BGL

発現

E. coli

を

C. thermocellum

の培養液に添加

した時、大腸菌の死滅・溶菌により菌体内の

BGL

が菌体外に放出されることを

示した（市原ら、

2017

）。第

4

章では、

BGL

発現

E. coli

を用いてグルコース生産

を行うことを目的とした。

(33)

33

第２節材料と方法

4-2-1 BGL

活性測定

2-2-1

と同様の方法で行った。

と

BGL

発現

E. coli

を用いたグルコース生産

Thermoanaerobacter brockii

由来

BGL

（

CglT

）遺伝子を発現する

E. coli

、またここから調製した

CglT

溶液（精製

BGL

溶液）の分与を、市原らより受けた（市原ら、

2017

）。

精製セルロースを含む

BM7CO

培地を調製した。また、アルカリ処理粉砕稲わ

らを含む

BM7CO

培地を調製した。試験管に窒素ガスを封入し、密栓することで

嫌気条件を作った。60 度で

C. thermocellum

を接種・培養し、培養

1

日後に

BGL

発現

E. coli

の

LB

培地培養液を

2mL

添加して再び

60

度で静置した。培養液中

のグルコース濃度は、グルコース濃度測定キット（グルコース

CII-テストワコ

ー）を用いて測定した。

(34)

34

第３節結果

4-3-1 BGL

発現

E. coli

の

BGL

活性

2-2-1

と同様の方法で、 BGL 発現

E.coli

の培養液中の

BGL

活性を測定した。

細胞を含む培養液の

BGL

活性は

122 U/L

、培養液の遠心分離後上清の

BGL

活性は 57.0 U/L、60℃処理培養液の遠心分離後上清の

BGL

活性は 85.9 U/L であった（図１２）。培養液の

BGL

活性は上清の

BGL

活性に比べ有意に高かった（

p <

0.05）

。上清と

60℃処理上清の間には有意な差はなかった。

と

BGL

発現

E. coli

培養液を用いた精製セルロースからのグルコース生産

C. thermocellum

を接種した

5%、14%セルロースを含むBM7CO

培地に、BGL

発現

E. coli

の培養液を

2mL

添加し、

60

度で静置培養した。培養

13

日目で終濃

度

3.6%セルロースから 3.1%グルコースが、終濃度 10%セルロースから 3.6%グ

ルコースがが生産された（図１３）。

と

BGL

発現

E. coli

の培養液を用いたセルロース系バイオマスからのグルコース生産

C. thermocellum

を接種した

5%

、

10%

アルカリ処理粉砕稲わら含有

BM7CO

培地に、BGL 発現

E. coli

の培養液を

2mL

添加して

60

度で培養し、培養液中のグルコース濃度を測定した。

BGL

発現

E. coli

培養液添加後

12

日目で、終濃度

3.6％稲わらから 0.88%グルコースが、終濃度 7.1％稲わらから 2.1%グルコース

が、培地中に生産された（図１４）。

(35)

35

と

BGL

発現

E. coli

の共培養によるグルコース生産

3%、 5%、 10%精製セルロースを含むBM7CO

培地で

C. thermocellum

を

60

度

3

日培養し、蓋を開け

BGL

発現

E. coli

を接種しモルトン栓をして

37

℃で

2

日

間培養した。その後、窒素ガスを再度封入し、

60

度で

15

日間培養した。培養

20

日目において、グルコース濃度がそれぞれ、

0.61%

、

0.99%

、

1.21%

となった（図

１５）。

(36)

36

第４節考察

第２章と第３章より、

BGL

発現

B. subtilis

や

BGL

活性を有する土壌細菌よりも高い

BGL

活性が要求されることを示した。本章では、

T. brockii

由来

BGL

（CglT）

遺伝子発現

E. coli

（市原ら、

2017

）の

BGL

活性を測定し、細胞を含む培養液の

BGL

活性は

122 U/L

であることを確認した。培養液の

BGL

活性は上清の

BGL

活性に比べ有意に高かった（

p < 0.05

）（図１２）。

C. thermocellum

培養条件にお

いて

BGL

発現

E. coli

は死滅する（市原ら、2017）。したがって、グルコース生

産時には

BGL

発現

E. coli

培養液を

BGL

溶液として直接投入したら良いと判断

した。

先行研究では、

C. thermocellum

培養条件において精製

BGL

を添加することで、

10%セルロースから約7%のグルコースが生産されている（Prawitwong

ら、

2013）

。本研究室では、

C. thermocellum

培養条件において

BGL

発現

E. coli

を

2mL

添加することで、培養

13

日目において終濃度

3.6%セルロースから 3.1%のグルコー

スを生産できた。また、培養

13

日目において終濃度

10%

セルロースから

3.6%

のグルコースを生産できた（図１３）（伊藤ら、

2016）

。２章と同様に、

C. thermocellum

と

BGL

発現

E. coli

を用いた高濃度グルコース生産には課題があることがあきら

かになった。

培養

12

日目において終濃度

3.6

％稲わらから

0.88 %

グルコースが、終濃度

7.1％稲わらから2.1%のグルコースが、培地中に生産された（図１４）

。アルカリ

処理稲わら中のセルロース含有量を

50%

とすると（市川ら、

2016

）セルロースか

らグルコースへの変換率は、終濃度

3.6％稲わらでは49％、終濃度 7.1％稲わら

では

58

％であった。生産されるグルコース濃度は小さいため、稲わらから高濃

度グルコースを生産するための条件検討も必要となる。

(37)

37

第

2

章では、

BGL

発現

B. subtilis

と

C. thermocellum

の共培養の実験を行った。

BGL

発現

E. coli

も好気性の微生物である事から、同様に共培養の実験を行った。

共培養の実験では、

3%

、

5%

、

10%

の精製セルロースから培養

20

日目において、それぞれ

0.61%、0.99%、1.22%のグルコースが生産された（図１５）

。グルコース濃度が小さい理由として、

BGL

発現

E. coli

の増殖が少なく、培地中の

BGL

活性が不足していると考えられた。

4-3-1

では

BGL

発現

E. coli

細胞を含む培養液の

BGL

活性を測定し、

BGL

活性は

122 U/L

であった。グルコース生産を行う際、

BM7CO

培地

5mL

に対し、

BGL

発現

E. coli

培養液を

2mL

投入する。そのため、グルコース生産時の試験管内の

BGL

活性は

²

7

倍の

35U/L

となっている。つまり、先行研究（

Prawitwong

ら、

2013

）

で投入されている

BGL

活性

1000U/L

には大きく届いていない。したがって、更

なる

BGL

活性を有する微生物を開発する必要があると考えた。

(38)

38

第５節図表

図１２：BGL 発現

E. coli

の条件別

BGL

活性

BGL

発現

E. coli

を一晩培養した。細胞を含む培養液、培養液の遠心分離後上

清、

60℃処理培養液の遠心分離後上清のBGL

活性を、

pNPG

を用いて測定した。

N=3

0 20 40 60 80 100 120 140 160

培養液上清 60℃処理上清

BGL活性(U/L)

(39)

39

図１３：

C. thermocellum

と

BGL

発現

E. coli

培養液を用いた精製セルロースから

のグルコース生産

セルロースを含む培地で

C. thermocellum

を

60

度で培養し、培養

1

日目に

BGL

発現

E. coli

培養液を

2mL

添加した。添加後

60

度インキュベーターで

13

日間培

養した。グラフ中に示されたセルロース濃度は終濃度を表す。

(N = 2)

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 2 4 6 8 10 12 14

培養日数

3.6％平均 10%平均

(40)

40

図１４：

C. thermocellum

と

BGL

発現

E. coli

を用いたアルカリ処理粉砕稲わらか

らのグルコース生産

アルカリ処理粉砕稲わらを含む培地で

C. thermocellum

を

60

度で培養し、培養

1

日目に

BGL

発現

E. coli

培養液を

2mL

添加した。添加後

60

度インキュベータ

ーで

12

日間培養した。グラフ中に示された稲わら濃度は終濃度を表す。

(N=2)

0 5 10 15 20 25

0 3 6 9 12 15

稲わら3.6％

稲わら7.1％

(41)

41

図１５：

C. thermocellum

と

BGL

発現

E. coli

の共培養による精製セルロースから

のグルコース生産

精製セルロースを含む

BM7CO

培地で

C. thermocellum

を

60

度

3

日培養し、蓋

を開け

BGL

発現

E. coli

を接種しモルトン栓をして

37℃で 2

日間培養した。そ

の後、窒素ガスを再度封入し、

60

度で

15

日間培養した。

(N=2)

0 5 10 15 20 25 30

0 5 10 15 20

3%

5%

10%

(42)

42

第５章

C. thermocellum

と

BGL

発現

B. choshinensis

を用いたグルコース生産

第１節目的

第２章と第４章では、

BGL

発現

B. subtilis

または

BGL

発現

E. coli

を、セルロースを含む

C. thermocellum

の培養液に添加することで、酵素添加を必要としないグルコース生産を達成できた。先行研究では、精製

BGL

を添加することで

10%

精製セルロースから

7.7%セルロースが生産されている（Prawitwong

ら、

2013）

。第２章で示したように、グルコース濃度をあげるために

BGL

活性を向上させる必要がある。

そこで、

B. choshinensis

に着目した。

B. choshinensis

はタンパク質を大量に分泌生産する特長を有しており、加えてプロテアーゼ活性をほとんど示さず、培養、

滅菌が容易で遺伝子操作がしやすい（

TAKARA

）。酵素の分泌に長けている

B.

choshinensis

を遺伝子工学的手法を用いて改変し、

BGL

を発現・分泌させること

を試みた。

(43)

43

第２節材料と方法

5-2-1 BGL

遺伝子の調製と

B. choshinensis

の形質転換

磯崎らは、

BGL

発現

B. subtilis

の開発を通して、

BGL

の発現・分泌に、

lytF

遺伝子のシグナル配列が最適であることを明らかにした（磯崎ら、

2018

）。

BGL

発

現

B. subtilis

細胞をサンプルに、lytF シグナル配列と

CglT

遺伝子領域を

PCR

に

て増幅した。

冷凍保存された

Solution A（0.5M

硫酸ナトリウムを含む

70mM

リン酸緩衝液

（

pH6.3

））、

Solution B

（

40% PEG6000

を含む

70mM

リン酸緩衝液（

pH6.3

））、

MT

培地（グルコース 10.0 g/ L、ファイトンペプトン 10.0 g/ L、エルリッヒカツオエキス

5.0 g/ L

、酵母エキス

B2 2.0 g/ L

、

FeSO4

・

7H2O 10 mg/ L

、

MnSO4

・

4H2O 10 mg/ L、ZnSO4

・7H

2O 1 mg/ L、MgCl2 20mM、pH7.0）を融解した。Brevibacillus Competent Cells

を

37

℃で

30

秒間、ブロックヒーターで解凍した。

12

、

000 rpm

で

2

分間、遠心分離をして集菌し、上清をマイクロピペットで完全に除去した。

lytF

シグナル配列と

CglT

遺伝子領域の

PCR

産物

1μL

、

pBIC DNA 100ng

、超純水

3μL

加え、全量

5 μL

に調製した

DNA

溶液と、50 μL の

Solution A

を混合した。混合した

DNA

溶液を集菌したチューブに全量加え、ボルテックスにより菌のペレットを完全に懸濁した。その後

5

分間静置した。次に、150 μl の

Solution B

を加え、液が均一になるまで

10

秒間ボルテックスミキサーにより混和した。

5、000 rpm、5

分で遠心分離をして集菌し、上清を除去した。再度、

5、000 rpm、

30

秒遠心分離し、完全に上清を除去した。そして、

1 mL TM

培地（グルコース

10.0 g/ L、ファイトンペプトン 10.0 g/ L、エルリッヒカツオエキス 5.0 g/ L、酵

母エキス

B2 2.0 g/ L

、

FeSO4

・

7H2O 10 mg/ L

、

MnSO4

・

4H2O 10 mg/ L

、

ZnSO4

・

7H2O 1 mg/ L、pH7.0）を加え、マイクロピペットを使って完全に縣濁した。37℃

(44)

44

のインキュベーターに

1

時間置いた。その際、

15

分に

1

回振り混ぜた。培養液

100μL

を

MTNm

プレート（グルコース 10.0 g/ L、ファイトンペプトン 10.0 g/

L

、エルリッヒカツオエキス

5.0 g/ L

、酵母エキス

B2 2.0 g/ L

、

FeSO4

・

7H2O 10 mg/ L、MnSO4

・

4H2O 10 mg/ L、ZnSO4

・

7H2O 1 mg/ L、MgCl2 20 mM、 pH7.0、

1.5% Agar

）に播き、

37

℃で一晩培養してコロニー形成させた。

5-2-2 BGL

発現

B. choshinensis

の選抜

4-2-1

で形成したコロニーをピックアップして

TMNm

液体培地

5mL

が入った

試験管で

30

℃

5

日間、

120 rpm

で培養した。増殖が確認できた試験管の培養液の

BGL

活性を、

2-2-1

と同様の方法で測定した。

BGL

活性を示す株の培養液をグリ

セロールストックとして

-80

℃で保存した。

5-2-3

セルラーゼ活性測定

カルボキシメチルセルロース（CMC）が

1%となるように10mM

リン酸カリウムバッファー

pH7.0

に溶解し、これを基質溶液とした。基質溶液を

200

μ

l

ずつ試験管に分注した。反応温度で

5

分間、プレインキュベーションした。基質溶液に酵素溶液

100

μ

l

を加え撹拌し、反応温度に

1

分おいた。その後、

DNS

試薬

900μl

を加えた。５分間煮沸し、室温に戻した後、波長

570nm

の吸光度を測定

した。

0g/L

、

0.1g/L

、

0.2g/L

、

0.3g/L

、

0.4g/L

、

0.5g/L

グルコース溶液

300

μ

l

の濃度を同様に測定することで検量線を作成し、これを用いて酵素反応により生産された糖濃度を決定した。

1

分間に

1 μmol

の生成物を生じるとき、これを１ユニット(U)と定義した。

培養液からのセルロソームの回収

(45)

45

C. thermocellum

を

1

晩、

100mL CTFUD

培地（

3 g/L sodium citrate tribasic dehydrate

、

1.3 g/L (NH4)2SO4

、1.5 g/L KH

2PO4

、130 mg/L CaCl

2 2H2O、500 mg/L L-cysteine- HCl

、

11.56 g/L 3-morpholinopropanesulfonic acid

、

2.6 g/L MgCl2 6H2O

、

1 mg/L FeSO4

7H2O、4.5 g/L yeast extract、1 mg/L resazurin、0.5%

セロビオース、pH 7.0）で培

養した。培養液を遠心分離して上清を回収し、回収した培養液を

0.20

μ

m

のフ

ィルターに通すことで、菌体を取り除いた。その後、10 kDa 限外ろ過膜を用い

て、

4

℃、

20

分、

6500 rpm

にて、限外ろ過した。得られた濃縮液を濃縮セルロ

ソームとした。

(46)

46

3

節結果

5-3-1 BGL

発現

B. choshinensis

の

BGL

活性測定

遺伝子導入処理後、MTNm 培地上でコロニー形成をする

B. choshinensis

株を複数取得することができた。

2-2-1

と同様の方法で、

BGL

発現

B. choshinensis

の培養液中の

BGL

活性を測定した。細胞を含む培養液の

BGL

活性は

1140 U/L、

培養液の遠心分離後上清の

BGL

活性は

546 U/L

、

60

℃処理培養液の遠心分離後上清の

BGL

活性は 1257 U/L であった（図１６）。培養液の

BGL

活性と上清の

BGL

活性の間には有意な差はなかった。また、上清と

60

℃処理上清の間には有意な差はなかった。

5-3-2 BGL

発現

B. choshinensis

の

60℃処理での死滅

BGL

発現

B. choshinensis

の培養液を

1.5mL

のチューブに

1mL

取り、

60

℃インキュベーターで

1

時間処理した。処理した培養液と、処理していない培養液を

MTNm

寒天プレートに撒き、

37

℃で

1

晩培養した。処理した培養液を撒いたプレートはコロニー形成しておらず、処理していない培養液ではコロニー形成していた（図１７）。

と精製

BGL

を用いたグルコース生産

C. thermocellum

を接種した

10%セルロースを含むBM7CO

培地に、精製

CglT

を投入した。また、試験管内の

BGL

活性が

1000U/L

となるようにした。精製

CglT

を投入した場合、培養

15

日目において、グルコース濃度は

4.73%であった。

対して、精製

CglT

を投入していない場合、培養

15

日目においてグルコース濃

度は

1.69%であった（図１８）

。

(47)

47

と精製

BGL

を用いた

BGL

活性別グルコース生産

10%セルロースを含む BM7CO

培地に

C. thermocellum

を接種して、60℃インキュベーターで

1

晩培養した。その後、各試験管内の

BGL

活性が

0

、

200

、

400

、

600、800、1000U/L

となるように精製

CglT

を添加し

60℃で静置培養したところ、

培養

11

日目で培地中のグルコース濃度は

1.16%

、

3.93%

、

4.13%

、

4.55%

、

4.54%

、

4.81%となった（図１９）。

と

BGL

発現

B. choshinensis

用いた精製セルロースからのグルコース生産

14%セルロースを含む BM7CO

培地に

C. thermocellum

を接種して、60℃インキュベーターで

1

晩培養した。そして、

BGL

発現

B. choshinensis

の培養液を

2mL

添加し、60 度で静置培養した。培養

15

日目で終濃度

10%セルロースから 5.5%

のグルコースが生産された（図２０）。

と

BGL

発現

B. chosinensis

を用いた培養条件別グルコース生産

pH 7

または

pH 8

に調製した

14%

セルロースを含む

BM7CO

培地に

C.

thermocellum

を接種して、

60℃インキュベーターで1

晩培養した。そして、BGL

発現

B. choshinensis

の培養液を

2mL

添加し、

60

度で静置培養または、

170 rpm

で

振とう培養した。培養

21

日目において

pH 7・静置培養条件では4.0%、pH 7・振

とう培養条件では

5.1%

、

pH 8

・振とう培養条件では

7.1%

のグルコースが生産さ

れた（図２１）。培養

10

日目におけるグルコース濃度は、

pH 7・静置培養条件と pH 7

・振とう培養条件を比較すると、

pH 7

・振とう培養条件の方が有意に高かっ

た。また、pH 7・振とう培養条件と

pH 8・振とう培養条件を比較すると、pH 8・

Clostridium thermocellum を用いた セルロースからのグルコース生産

修士論文

BGL 発現細菌と

Clostridium thermocellum を用いた セルロースからのグルコース生産

平成 30 年度 2 月 12 日

教育学研究科 理数生活系教育領域

伊藤敏之

目次

要旨

第１章 緒論

第

章

と

発現

を用いたグルコース生 産

第１節 目的

第２節 材料と方法

活性測定

と

発現

を用いたグルコース生産 第３節 結果

発現

培養液の

活性

と

発現

培養液を用いた精製セルロー スからのグルコース生産

と

発現

培養液を用いたセルロース系 バイオマスからのグルコース生産

と

発現

の共培養によるグルコース生 産

ジャーファーメンターでの

と

発現

培 養液を用いたグルコース生産

と

発現

培養液を用いたグルコース生

産時における精製

添加

第４節 考察 第５節 図表

第

章

活性を有する土壌細菌探索 第１節 目的

第２節 材料と方法

培地作成と土壌細菌の培養

活性測定 第３節 結果

活性を有する土壌細菌の単離

活性を有する土壌細菌を用いたグルコース生産

第４節 考察 第５節 図表

第

章

と

発現

を用いたグルコース生産 第１節 目的

第２節 材料と方法

発現

の

活性

と

発現

を用いたグルコース生産 第３節 結果

発現

の

活性測定

と

発現

培養液を用いた精製セルロース からのグルコース生産

と

発現

の培養液を用いたセルロース系

バイオマスからのグルコース生産

と

発現

の共培養によるグルコース生産 第４節 考察

第５節 図表

第

章

Clostridium thermocellum を用いたセルロースからのグルコース生産

Clostridium thermocellum を用いたセルロースからのグルコース生産

教育学研究科理数生活系教育領域

第１章緒論

を用いたグルコース生産

第１節目的

第２節材料と方法

を用いたグルコース生産第３節結果

培養液を用いた精製セルロースからのグルコース生産

培養液を用いたセルロース系バイオマスからのグルコース生産

の共培養によるグルコース生産

培養液を用いたグルコース生産

第４節考察第５節図表

活性を有する土壌細菌探索第１節目的

第２節材料と方法

活性測定第３節結果

第４節考察第５節図表

を用いたグルコース生産第１節目的

第２節材料と方法

を用いたグルコース生産第３節結果

培養液を用いた精製セルロースからのグルコース生産

の共培養によるグルコース生産第４節考察

第５節図表

を用いたグルコース生産

第１節目的第２節材料と方法

培養液からのセルロソームの回収第３節結果

を用いた培養条件別グルコース生産

第４節考察第５節図表

章緒論

。非化石資源である植物バイオマスは、持続的利用が可能な再生可能資源であり、

）。しかし、酵素添加によるセルロースの分解は、高コストな酵素を大量に必要とするため、グルコース生産により多くの費用を要することになる。

）。好熱嫌

ロース系バイオマスを効果的に分解する酵素複合体と呼ばれるセルロソームを生産する。C. thermocellum は、このセルロソームによりセルロースを分解して、

主に二糖であるセロビオースを生産することができる。そして、生産したセロビオースを栄養源として利用して様々な代謝物を生産する。先行研究では、セルロースを含む

の培養液に、セロビオースをグルコースに変換する酵素である

）。これは、添加された