顎 腔領域 歯 性感染症起炎 菌 相 作 用 関す 研究

顎^口腔 領域歯性 感 染 症 起 炎菌^の相^互作用^に関す^る研 究

一 特^{に 5わ}郎^わC βC C 〟5 C O 兜5ね侮ねばと 旅ぶ∂わαC才βγよ〟 椚 乃 〟 Cgβαf〟 椚 との相 乗 効 果につ いて ^‑

金 沢大 学 医学 部 歯 科口腔 外 科学 講 座 ( 主 任^: 山 本悦 秀教 授)

栗 山 智 有

顎口腔 領 域 歯 性 感 染 症^の発 症, 進 展^と関^わりがある と考 え^{ら れ る}起 炎菌^の相^互作 用^の解 明を 目 的と し て本 感 染 症か ら高 頻 度に分 離さ れ る 5加桝βC βC C 〟ぶ C O 犯ぶね助鋸5(5^. 路 棚扉 肋加) と 助 成彫 励加 椚 肌 血 加 酢軒 別血 融川) に注目し, 両 菌 間^の病原 性^の相互作 用^{につ い てマウス ロ}底 膿 瘍^モデルを 用^い検 討^を行^った. 本 研 究で は^モデ^ルと し て雌^のI C R CIj ^{マ ウス}を 用^い, 且

c o n stellatu s H r C C 2 7 8 2 3, F n u cle atu m H r C C 2 5 58 6株 を 実 験に用^いた^. 病 原 性^は膿 瘍^の形 成^の有 無, 致 死率 卜膿 瘍^{か らの}回 収 菌 数^{に て}測 定^{し た. こ の2}菌^の生薗 を 混 合し, マ ウスロ底に接 種し た場 合, 病 原 性^の相 乗 作 用が認め ら れ た^. 且 粥捉 CJβαわ̀ 椚の

生薗^{と 且c β乃∫ねJJαわJ ぶの}菌 培 養 濾 液^との混 合 液 を^{マ ウス}に接 種し た場 合, 尺別山 鹿由仰 の柄 原 性^は増 強^しなかった.

一 方, 5.

c β 那fβ加わ路の生薗と 且 柁〟CJg αf〟 椚 の薗 培 養 濾 液 を 混 合しマウスロ底に接 種し た場 合, 5^. c β刀ざね〟αねJ ざの病 原性は増 強し た^. さ ら に加 熱 処理 し た 且 ^乃〃CJβαオぴ ∽ の菌 培 養 濾 液 を 接 種^{し た}場 合 も, 且c 別 路ね仏滅椚 の病 原 性は増 強し た. こ の こと か ら 5. c ∂刀ぶfgJJαお につい て は そ^の産生物 質で はな く 生 菌 間^{に よ る}作 用が, Å 乃誕CJg 助 椚 に^ついて は産生す^る耐 熱 性^の物 質^{がこ の2}菌 間^の相 乗 作 用 発 現^に関 与^{し ている}ものと推 察^{さ れ る.} また興味 深^{い こと に}, 加 熱 処理 し た場 合 を 含む Å 乃 〟CJβαf〟 例 の菌 培 養 濾 液を^マウス

の背 部に接 種^し, 鼠 c ∂乃ぶ才β伽f〝∫の生菌 を^マウ^スロ底に接 種し た場 合^{に おいて}も^{5. c β形SregJαf鋸ぶの}病^原性^が増 強^{さ れ た. こ の且}

光〟CJg αf〟 椚に よ る増 強 作 用^の強さ はそ^の菌 培 養 濾 液^の濃 度に依 存し な か った^. こ の こと か ら, 凡 作〟CJβαf〟 刑 は そ^の耐 熱 性 産生 物 質が宿 主^の免 疫に影 響し, そ れ に よ^って 5. c β〃ぶfβJ 加鋸ぶとの相 乗 作 用^が発 現 す^るも^のと推 察^{さ れ る. 以 上の}結 果か ら, こ れ ら^の相 乗 作 用が顎口腔 領 域 歯性 感 染症^の発症に寄与し て^いること が示 唆さ れ た^.

Eey ^{w o r}ds o r ofa cial odo ntog^{e n}icinfe ctio n, mic r ob ial inte r a ctio n , O r al flo o r abs c e s s m odel,

Sfγ呼^わc ∂C C 〟ぶ C ∂乃ざfβggαお , ぬぶ0わ^αCfβわ〟 研 乃祝CJβαオ〟 椚

顎口腔 領 域に発 症 する化 膿 性 炎症^の多 く^は歯 牙^{お よ び}歯 周 組 織^の炎症に起 因し て^いる^. 国 民^の口腔衛生 に対す る認 識^の向上,

高度 化す^る歯 科 治 療 技 術, さ ら に は抗 菌 薬^の発達^{な ど に}も 関わ らず, 現 在, 歯 科口腔 外 科^の臨床に お^いて顎仁柑空領 域l敵性 感 染 症は最 も高 頻 度^に遭 遇す^る疾 患であり, かつ免疫 能に な ん ら問 題^のな^い健 康^{なヒト に}も 発症し, 進 展す る特 異な感 染症^でも あ る. そ^の‑･‑▼‑･･^･方で, 我が国^の高 齢 化や糖 尿 病を は じ め と し た慢 性 疾患患 者^の増 加, 各 種抗 菌 薬^への耐性 化等^{か ら}治 療^に難渋 す^る 症例は増 加 傾 向にある^. 本感 染 症^の発 症, 進 展 機 序^の解 明は,

より 確 実^かつ 効 果 的^な治 療 法^の理論 的 根 拠^{と な}り 得^{ること か} ら臨 床 的^に非 常に重 要である が, 未だ不 明な点が多^い. 本 感 染症は細 菌 感 染 症^である が, 分 離 菌^{のほ と ん ど がl}̲̲^{l艦 内 常 在} 菌^である^1). 以前^の研 究で は 5オγ郷∂C ♂C C 〟 g, 5 瑚 ゐ〆∂C βC C 〟 ぶ,

C 叩^{乃 e}∂αC才βγダ〟 椚等^の通 性 嫌 気 恰 もしくは好 気 惟 菌が多く 分 離 さ れ ていた^2)3). し か し な が ら, 近 年^の検 体 採 取, 保 存 法^の改 啓, 嫌気 性 菌に対 する培 養 技 術^の発 達か ら, 口腔 内^の椎 菌 混入 喝度が減 少^し, 従 来 検 出 困難^{と さ れ た}嫌 気 性 菌^の分 離が飛 躍 的

に増 加し た. こ の結 果, 近 年で は本 感 染 症か ら主に通 性棟 気惟

菌である 5fγ勿^加♂C C 〟ぶ, 偏性 嫌 気 性 菌^であ^る鞄紳^助ゆ^{加鍬 邪},

Pγβ〃βねJJα, 拘ぶβみα Cfβγf〝 ∽ 等が分 離さ れ, 以 前多く 分 離さ れて いた好 気性 菌^の分 維 頻 度^は相 対 的^に少なく な^った^4卜6). し か し な が らこれ らの菌は^いずれもl̀_{調空内常 在 菌であり}

, そ れ単 独^で

化膿 性 炎症^の起 炎 菌^{に な る 理}由について は不 明である.

興 味 深^{い こ}と に, 本感 染症^{で はこれ らの}歯^が単 独^に分 離^{さ れ} る^こと は稀であり, 多く^の場 合, 1 症 例か ら同時に複 数^の菌が 分 紅さ れ る^{7) 瑚 一}般^に複 数 菌^{に よ る}感 染 症^{に おい て は}薗^の相 射乍用が存 在し, これ が炎症^の発 症, 進展^に大 きな役 割 を 果た し ているものと考^{え ら れて いる9jl (〕).} 例 えば, 腹 膜 炎に おいて その代 表 的 な 起 炎 菌で あ る 且5ゐβ γgCゐfα C βJ才(且 ^{c ∂}Jブ) ^と βαCオg 和才dg ざ 触 ^血 (^且 如 ^拙) ^はいずれも下郎 消 化 管^の常 在 菌 である が^{I l)}, そ^の発 症に おいてこ の2菌 間^に相^互作 用^が存 在 す ること が知ら れ て おり, そ^の機 序と し て, 炎 症 初 期^{に おいて は} 好 気 惟 菌^であ^{る 且 n痛 が}増 殖^し, 局所^の酸 素 を 消 費^し, これ に より 発 育 環 境が整^った後, 偏 性 嫌 気 性 菌である 且ルαgよ掠 が増

平 成1 0年¹¹ 月4 日受付, 平 成^{1 0}年^{1 1月1 8 日}受理

A b b_{r e v}iatio n s : A T C C, Am e ric a n Typ^e C ultu r e Colle ctio n;B . g iⁿg i^{v a}lis

,B a cte r oide s giⁿgi^{v a}lis; B ^･ 什^ag ili^s, Ba cte r oide s b w ili^s; ^Cfu , C Olo nyfo r ming ^{u n}i_t; E^. c oli_, Eshe rich ia c oli;F ･ n u Cle atu m , 助s oba cte riu m n u cle atu m; I L

,inte rle ukin; P ^. inte r m ed ia _, Pr e v otella inte r m edi^a; P Y G ブロ ス

,p^eP t^{O n e‑}y^{e a S}t e Xtr a Ct^‑glu c o s e br oth_; 鼠 伽 職由㈲血 脈 _,5 れ妙^わC 即 C 〟ぶ C ∂乃ぶねg 加〟5

4 1 0

殖 す^ること が ラッ トを 用^いた実験 的 研 究に て明ら か と な ^って^い る^{1 2)1 3)}. 従^って複 数 菌 感 染 形 態 をと る顎口腔 領 域 歯 性 感 染 症に お^いても, こうし た起 炎 菌^の相互作 用が存 在し, これ が炎 症^の 発 症, 進 展に深 く 関 与し て^いる 可能 性が考 えら れ る.

さ て, 顎口腔 領 域 歯 性 感 染 症^の研 究に お^いて動 物 を 用^{い た}実 験^モデルは必 要である^. 単に菌^の病 原 性を検 討 する だけである な ら ば, 動 物^の背 部 も^しく^は鼠 樗 部^の皮^下組織 を月弓^{いること が} 多^{い1 4卜1 !り.} し か しなが ら, 本 感 染 症^の臨床 的 特 異 性 を 考 慮 す る と, 顎口腔 領 域^の組 織^を用^い, ヒト に おける臨床 像^{を 可}及 的 に反 映し た^モデ^ルで^の研 究が望 まれ る^.

そ^こで本 研 究で は, 顎口腔 領 域 歯 性 感 染 症^モデ^ルと し て独 自 に^マウスロ底 膿 瘍^モデ^ルを 製 作し, この モデ^ルを 用^いて顎口腔 領 域 歯性 感 染症^の発 症, 進 展と大 きな関わり を持つ と推 察さ れ る起 炎薗^の相互作 用に^ついて研 究 する こ と と し た^. 特^に本 感 染 症^の代表的な起 炎 菌である 鋸_{明 抽} 肌 肌 肌 り 銅融 招 加 那 (5^.

〝 批由瓜加那) ^{と 都路妨鋸ね戒 初犯 椚血 如血相} (^{且兜 〃CJβαねJ 研}) ^に注 目 し, その混 合 感 染 時^の菌^の相互作 用^の存 在お よ び その発 現 横 序 について検 討^{し た.}

材 料 と 方 法 L 使 用 動 物

使 用し た動 物は, I C R C再^{C D‑1 マウス}(^日本チャ ^ー ルズ リ^バ

ー

, 横 浜), 雌⁵ 過 齢 ( 体 重^{2 5}g ^〜2 8_g)^{. マ ウス}は 7 日間^の予 備 飼 育^の後に便 用し た^. 飼 料は実 験 動 物 用 固 形 飼 料M F (オ リ^エ

ンタル酵 母, 束 京) ^を与 え, 飲 料 水^は水 道水 を使 用^し, そ れ ぞ れ自 由 摂 取さ せ た^. 本 実 験に お^いて^マ ウ^スは1群1 0 匹と設 定 し た.

Ⅰ^. 使 用 菌 棟

使 用し た菌 株は, アメリ カ菌 株 保 存 機 関 (^{A m e ric a n T}y pe

Cultu r e Colle ctio n, A T C C) 由来^{のS. c o n stellatu s} År C C 2 7 8 2 3,

ダ∴椚 此張Ⅵね川 射A T C C 2 5 5 8 6 である^.

Ⅱ. 菌^の培 養^{お よ}び接 種 液^の準 備 1^. 菌 懸 濁 液^の作 製

5. 甜 肌加丑加那 は 5 % ヒ ツジ 血液 加ブルセ ラ H K 寒天培 地 ( 極 東 製 薬, 束 京) 上 で 1 0 % C O2, 2 0 % Ⅲ2, 7 0 % N2の環 境下 に て 3 7 ℃, 4 8時 間 培 養し た. 且 調〝 CJβαね̀ ∽ は 5 % ^{ヒ ツ}ジ血 液 加ブル セ ラ H K寒天培 地上 で 5 % C O2, 1 0 % H2, 8 5 % N2の環境下 に て 3 7 ℃, 7 2 時 間 培 養し た^. 発 育し た寒天培 地上の集 落 を 集め,

ペプ トン ^･ イ ^ー ス ト ^･ グルコ ^ー ス培 地 (p^ep t^{o n e‑}ye a St e Xtr a Ct^‑ glu c o s e br oth, P Y G プ^ロ ス) に 1^.0 ^×1 0^{f) コ ロ ニ ー} 形 成 単 位 (^{c olo n}yfo rm ing u nit, Cfu) /^{ml お よ び 4.0 ×1 09cfu}/ ^mlの濃 度に な る よう 懸 濁^{し た. な お}今 回用^いた P Y G ブ^ロスは 0^.1 % ビ タ ミ ンK (和 光純 薬^, 大 阪)^{, 1 0 % ペ プ トン}(^{Ba cto‑Pe}p^{to n e}) (^{D ifc o,} Detr oit_, U S A)^, 1 0 % イ ^{ー ス}ト Ⅳe a st^‑e Xtr a Ct) (^{D ifc o}), 1 0 % グ ルコ ^ー ス の組 成である^.

2. 菌 培 養 液^{お よ び}菌 培 養 濾 液^の作 製

S^. c o n stellatu slj:P Y G ブロ ス に て 1 0 % C O2, 2 0 % H2, 7 0 % N2の環 境下 で 3 7 ℃, 4 8 時 間培 養^{し た. これ}を5. 〝 那加批め路蘭 培 養 液と し た^{. こ の}菌 培 養 液 中^の生 菌 濃 度^{は 4.0 ×1 09c山}/ ml で あ^った.

一 方, ∫∴椚 此張協ね㈲ は P Y G ブ^{ロ ス} に て 5 % C O2, 1 0 % H2, 8 5 % N2環境下 に て 3 7 ℃, 7 2 時 間 培 養し た^{. こ} れを^ダ.

捌眈加矧如椚 菌 培 養 液 とし た. この菌 培 養 液 中^の生菌濃 度は 7^.0 × 1 0⁹c血/ ^{ml で}あ^{っ た.}

∫^. 〝 肌由舶如購 お よ び 尺 兜〃 Cgβαf〟 刑の蘭 培 養 液 を3 0 0 0回 転/

分, 1 0分 間 遠 心 分 離^{し た}私 直 径^{0.2 2}〃^m の濾 過フ ィ ルタ^ー (^{M ille x‑G S}, M illipo r e, Bedfo rd, U S A) ^{に て}濾 過 滅菌し た^. こ

うし て得ら れ た濾 過 滅 菌 液 をそ れ ぞ れ^の菌^の菌培 養 濾液と し た.

さ ら に^これ ら^の菌培 養 濾 液^{の 一}部を取 り 出し, オ ^ー ト クレ^ー ブ(^三洋 電 機, 大 阪) に て 12 1 ℃, 2 0 分加 熱し た^.

.^{Ⅳ. マウスヘの接 種 液の接 種}

1. 2菌 を 同^一部 位^に接 種 す^る場 合^{につ いての}検 討

マウ^スをジ^エ チ^{ルエ ー} テ^ル ( 和 光 純 薬) に て麻 酔さ せ, 7 0 %

エ タ^{ノー ル}(和 光 純 薬) ^{に てマ ウス のオ ト ガ イ}部^{か ら}顎下部か けて^の皮 膚 を 消 毒し, 2 6 ゲ^ー ジ ディ スポ ^ー ザ ブ^ル注 射 針 (^テル

モ

, 東 京) ^を用^いて皮 膚 側か ら針 を 進め, 口底の粘 膜1^rの筋層 部に接 種 液 を0^.1ml接種し た^. 接 種 液は 5^. c β乃ざfβJ 加鋸Sもしくは 且 乃〟CJβα≠〟 別 の菌 懸 濁 液と他 方^の菌^の菌 培 養 液, 未 加 熱 処理の

菌 培 養 濾液, 加 熱 処理^した菌培 養 液 液^のう ち^{のど れ か と}等 量混合 すること に より作 製し た^. また^{コ ン}ト^{ロ ー} ルに は S^. 川 那賊 肋励

もしく^{は 且 乃〝 Cgg α才〟 別の}菌 懸 濁 液^と末 培 養^{のP Y G ブロス}を等量 混 合^{し た}ものを接 種^{し た.}

2. 2菌 を 異な る部 位に凝 種し た場 合について^の検 討

一 方, 次^のような^マ ウ^{スヘ の}接 種 も 行^っ た^. す なわち, 5^.

c β乃ぶねJ 加祝ぶもしくは ダ∴ 那 〟皮α如拙 の菌 懸 濁 液に未 培 養^のP Y G ブ

ロ ス を加 え^{0.1 m}l と し, これをマウス の口底^に接 種^{し た.} 同時 に他 方^の菌^の未 加 熱 処理もしくは加 熱 処 理し た菌 培 養 濾液 を未 培 養^{のP Y G ブロ ス}を混合^{し 0.1ml と し}, これ を同^{じマウス の}背 部 皮 下に接 種し た^{. コ ン}ト^{ロ ー ル}と し て菌 懸 濁 液を 口底に接種 し, 末 培 養^{のP Y G ブロ ス}をマ ウ^{ス の}背 部 皮下 に接 種し たも^の を 設 定し た^.

3. 相互作 用に おける菌 培 養 濾 液^の 濃 度^の影 響につい て の

検 討

さ ら に, 且 乃 〟 CJβαわ̀ ∽ の菌 培 養 濾 液 をP Y G ブロ スに て1 0段 階 希 釈^し, これ を S. c ∂ 乃ぶ才β侮 加 の菌 懸 濁 液^と等 量^に混 合^し,

0^.1mlを^マ ウスロ底に接 種し た^. またl 希 釈し た 且 乃 〟CJβαわ̀ 椚

菌 培 養 濾 液 を 末 培 養^{のP Y G ブロス と}混 合し0.1mlをマウス背部 皮で

̀

に接 種し, 同 時に末 培 養^のP Y G ブ^{ロ ス}と等 量 混 合^{し た5.}

0

0 ㈲由蘭扉那菌 懸濁 液0^.1ml をマ ウスロ底に接 種し た^.

なお, こ の ^一連^の実 験^に用^いた全^ての接 種 液の pH は 6.8 ^＼ 7^.0 であ^っ た^.

Ⅴ. 病原性^の測 定

接 種か ら 7 日間^{の マ}ウス の致死率を検 討し た^. ま た, 接 種^か ら 7 日後^{に ジュテル エ ー テル下 に てマウスを}屠 殺し, 膿 瘍^の形 成 率^{お よ び}膿 壕か ら^の回 収生菌 数 を 求^{め た.} 膿 瘍^の判定^{につ い}

て は, S hapir o ら^{2 (1)の}方 法に準じて行^っ た^. すな わ ち, 肉 眼^で 検 索さ れ る大 きさ で, グ ラム染 色^で多核 白^血球^と接 種 菌体^の確 認が できる膿 汁を多 量に含む内 腔^のある腫癒で, 内容 液 ( 膿汁)

か ら接 種 薗 を 回 収^できるものを 膿 瘍^と判 定^{し た.} 膿 瘍か ら^の鞋 菌 数^の測 定は次^のように行^った^. すな わ ち無 菌 的^に採 取^{し た}膿 瘍 を^{ガ ラス}製ホ^モジ ナ イ ザ ^ー ( 池本^理化 学工業, 束 京) にて1ml のP Y G ブ^{ロ ス}に粉 砕 溶 解 後, 5 % 羊血液 加^{ブルセ ラ}寒^天培 地お よ び 0.7 5 % ^バ ロモ マ イ シ^ン( 協 和 発 酵^, 東 京), 0^,0 2 5 % ^{バ ンコ}

マイ シ^ン (塩 野 義 製 薬^, 東 京)^{, 5 %} 羊^血液 加^{ブルセ ラ H K} 寒天 培 地 を月弓^いて寒天平 板 希 釈 法に て菌 数 を 定 量し た^.

Ⅵ. 統 計 学 的検 討

統計 学 的 処理に^ついて は, 致 死 率, 膿 瘍 形 成 率^{について は 方2} 検 定 を, 匝川^又蘭 量について は Stude nt^‑t検 定 を用^いて そ れ ぞ れ^の 群 を^{コ ン}ト^{ロ ー ル}群と比 較 検 討し, 危 険 率が 5 % 未 満^を有意差