博 士 （ 農 学 ） San San Mar
学位論文題名
Reaction and Structure of Two ぱ‑Amylase 工soforms form Azuki Beans
（2つ のア ズキ ぱ― アミラ ーゼ アイソフオームの機能と構造）
学位論文内容の要旨
。‐アミラーゼ（1，4‑a‑D‑glucan glucanohydrolase，EC 3.2.1.1）は、a‑l，4−グルコシド結合を有する 高分 子 基 質を ラ ン ダム に 加水分 解し、a‑アノメリ ック構 造を有す る生成 物を遊離 させるエ ンH型 の酵素で ある。植 物・動 物・微生 物に普 遍的に存 在し、 澱粉やグ リコーゲ ンなど の分解代 謝に関 与する重 要な糖質 加水分 解酵素の ーっで ある。特 に、植 物細胞に おいて基 質とな る澱粉は 不溶性 の粒子で あり、澱 粉粒分 解の初期 段階に おいて作 用する 酵素とさ れている 。その 後、フオ スフオ リラ―ゼ 系やロ‐ アミラ ーゼ‑a‑グルコ シダーゼ系が作動し、最終的にグルコース‑1‑リン酸やグル コースに 導かれる 。これ まで、単 子葉類 や双子葉 類の種 子発芽時 に複数のa‑アミラ ーゼ遺伝 子が 植物ホル モンの制 御下で 発現され ること が明らか になっ ており、 菜豆類の 発芽時 にも本酵 素活性 が認めら れる。本 研究で は、重要 な食用 作物であ るアズ キの種子 発芽にお いて発 現するa‑ア ミラ ーゼ に 着 目し 、2種類 の 酵 素の 存 在 を示 し た 。そ れ らの 緒性質や 蛋白構 造を解析 した結果 、2つ のa‑ア ミ ラ ー ゼ は 澱 粉 粒 へ の 吸 着 能 の 異 な る ア イ ソ フ オ ー ム で あ る と 推 定 さ れ た 。
（1）発芽過程で発現する2種のロ‐アミラーゼの単離と性質
7品種のアズキ種子を暗所下30゜Cにおいて発芽させ、a‑アミラーゼ活性の経日変化を調べた。
いずれの種子も吸水処理後、酵素活性の上昇が観察され、8日目に最大値を与えた。最も高い活 性を示した品種（ホクトダイナゴン）を研究試料に選び、発芽後8日のものを各器官（根・茎・
葉・種皮・子葉）に分割し、それぞれの酵素活性を測定した。子葉に高いa‑アミラーゼ活性が観 察され、それ以外の部分の活性は極めて低いことが認められた。発芽8日目の子葉300gを材料に し、a‑アミラーゼの精製を開始した。0.1M酢酸緩衝液(pH 6.0、5mM CaCI2とプロテアーゼ阻 害剤を含む）中で磨砕して得られた抽出液を粗酵素液とした。酵素活性の殆どを40‑70％硫安分画 で回収後、アフイニティークロマトグラフイーに供した。担体には、ロ‐サイクロデキストリン
（ロ‑CDと略）を固定化したセファロース6Bを用いた。本操作でa‑アミラーゼは2つの活性区 分に分離した。一方はロ‑CD担体に弱い相互作用（遅延溶出）を示し、他方は溶出にロ‑CDを要 す る強 い吸 着を 示し た。 それ ぞれ をVAAmylおよ ぴVAAmy2と命名した。ロ‑CDはa‑アミラー ゼ分子における澱粉粒の吸着部位と相互作用することが知られている。2つの活性画分は非変性
条件 にお ける 電気 泳 動お よぴSDSを用 いた 変性 条 件の 電気 泳動 で単 一の バンドを与え、精 製標品 と し て 以 降 の 実 験 に 使 用 し た 。 両 精製 酵素 の粗 酵素 液か らの 活性 回収 の総 和は78％(VAAmylで 37%、VAAmy2で41％）であり、高い収率を与えた。
VAAmylお よ びVAAmy2の 性 質 を 解 析 し た 。SDSを 用 い た 電 気 泳 動 でVAAmylは47，000の 、 VAAmy2は44，000の 分 子 量 を 与 え た 。5.2のpI値 は 一 致 し た 。 両者 の至 適pH (pH 5.3と5.2)、 至適 温度(70°C） お よぴpHや 温度 に対 する 安定 領域(pH 4.6‑10.4とpH 3.9‑11.9、70°C以 下）は ほば 同様 の結 果を 示 した。グルコース重合度が17および7の基質に対する作用を定量的に解 析し、
2つ のa‑ア ミラ ーゼ は似 た 特異 性を 示す こと が認 めら れた 。重 合度 が5の 基質 を用 いて 、活 性部 位を 構成 する サブ サ イト 構造 と基 質切 断様 式の 関係を調べた。両酵素ともに基質を形成す るグル コ ー ス 残基 のう ち非 還元 末端 から4と5残基 問で 主な 切 断が 生じ るこ とが 判明 し、 基質 はサ ブサ イト．4か ら十1に結合することが明ら かになった。植物a‑アミラーゼは活性発現や分子構造の保持 のため、CI22゛を要求する。Cl22゛を 酵素液に加えたが活性の上昇は認められず、既に酵素分子に Cl22゛が結合していることが想像され た。EDTA処理により酵素活性が低下し、Cl22゛を与えても活性 の 回 復 が 認 め ら れ ず 、EDTA処 理 は 不可 逆な 失活 を与 える こと が明 らか にな った 。 ロ‑CD吸 着が 異 な るVAAmylお よ びVAAmy2を 澱 粉 粒 に 作 用 さ せ た 。VAAmylの 約40％ な ら ぴ にVAAmy2の 約90％ が 澱 粉 粒 に 保 持 さ れ 、 澱 粉 粒 へ の 吸 着 能 が 相 違 す る こ と が 認 め ら れ た 。
（2）構造解析と2つの 酵素アイソフオーム
VAAmy1お よ びVAAmy2の ア ミ ノ 末 端15残 基 の 配 列 は 完 全 に 一 致 し た 。 内 部 配 列 の 解 析 は 、 両 酵素 をト リプ シン 消化 後、 生成 する ベプ チド 断片を飛行時間型質量分析装置に供することで行 っ た。 得ら れた スベ クト ラム も一 致す るこ とか ら2つ の酵 素の アミ ノ酸 配列は同一のものと判断 できた。これらの配列情 報は、ぬぴロradiata酵素のものと符号するため、賄ぴロradiata酵素の遺伝 子 配 列 を 基 に ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イマ ーを 作製 し、 ア ズキ 子葉 のcDNA． ライ ブラ リー からPCR法
（5 RACE)で 本 酵 素 のDNA断 片 の 増幅 を行 った 。DNA配列 解析 の結 果か ら、5 領 域に 相当 する 1種 類 の増 幅断 片が 得ら れた 。本 配列 の一 部か らプ ラ イマ ーを 合成 し3 RACE法 で 酵素 遺伝 子の 全 域 にわ たる クロ ーニ ン グを 行っ た。PCR法に おけ る 幾っ かの 誤反 応も あっ たが 、1種 類の 転写 産 物か ら増 幅さ れた 遺伝 子で ある こと が明 らか になった。本遺伝子のORFは1，266 bpからなり、
421ア ミ ノ 酸 残 基 を コ ー ド す る 。 推 定 さ れ た 全 ア ミ ノ 酸 一 次 配 列 は 、VAAmylお よ ぴVAAmy2の N末端 配列 を含 み、 内 部配 列を 構成 する ペプ チド の質 量解 析の 結果 と完 全に一致した。23アミノ 酸 から なる シグ ナル ベプ チド の配 列お よび1箇所 の糖 鎖付 加モ チー フが 存在した。a‑アミラーゼ の 活性 部位 を構 成す る4つ の特 徴的 な配 列が 確認 され 、触 媒残 基を 含み 活性クレフトを構築する
（ ロ／a)8構造 のド メインA、もう一方の活性クレフトを形成するドメインBならびに澱粉粒吸着に 関 与 す る ド メ イ ンCの 存 在 が 示 さ れ た 。 全 ア ミ ノ 酸 配 列 か ら の推 定分 子量(44，379)はVAAmyl (47，000)より 小さ くVAAmy2 (44，000)と一 致し た。 従っ て、 分子 量が 増加するタイプの翻訳後 修飾、すなわち糖鎖修飾 により澱粉粒吸着能が低下したと考えられた。
VAAmylお よ ぴVAAmy2は 同 じ 基 質 特 異 性 を 与 え 、 そ れ ら の アミ ノ末 端と カル ポ キシ ル末 端の
ー1245―
両配列ならぴ内部配列が同一である。得られた配列情報がORFから推定された全アミノ酸一次構 造に認められ、かつ同一遺伝子に起因することから2つのa‑アミラーゼはアイソフオームと推定 した。澱粉粒吸着能が異なる両酵素はアズキ種子の発芽に伴い活性が増加し同程度存在するため、
澱粉粒の分解機構に関し異なる役割を担っていると想像される。すなわち、VAAmy2が粒の分解 に 主 に 関 与 し 、 遊 離 し た グ ル コ ー ス ポ リ マ ー をVAAmylが 分 解 す る機 構 を 想定 し た。
学位論文審査の要旨 主査 教授 木村淳夫 副査 教授 内藤 哲 副査 助教授 森 春英
学位論文題名
Reaction and Structure of Two ぱ ‑Amylase 工 soforms form Azuki Beans
（2つの アズキロ ―アミラ ーゼアイソ フオーム の機能と 構造）
本論文は 、英文97頁 、図27、表13、4章からな り、他に 参考論文3編が添えられている。
a‑アミラーゼは、澱粉やグリコーゲンなどの代謝に関与する重要な糖質加水分解酵素のーっで あり、高分子基質をランダムに分解し、a‑アノメリック構造を有する生成物を遊離させる。植物 細胞において澱粉は不溶性の粒子であり、澱粉粒分解の初期段階に作用する酵素とされている。
これまで、単子葉類や双子葉類の種子発芽時に複数のば‐アミラーゼ遺伝子が発現されることが明 らかになっている。本研究では、重要な食用作物であるアズキの種子発芽において発現するa‑ア ミラーゼに着目し、2種類の酵素の存在を示した。それらの緒性質や蛋白構造を解析し、2つの a‑ア ミ ラ ー ゼ は 澱 粉 粒 へ の 吸 着 能 の 異 な る ア イ ソ フ オ ー ム で あ る と 推 定 さ れ た 。
（1）発芽過程で発現する2種のa‑アミラーゼの単離と性質
7品種のアズキ種子を発芽させ、最も高い活性を示した品種（ホクトダイナゴン）を研究試料 とした。吸水後8日目に最大活性となり、子葉に高い酵素活性の局在が観察された。発芽8日目 の子葉から抽出液を調製し、40‑700／o硫安分画、アフイニティークロマトグラフイーに供した。ア フイニティー担体には、ロ‐サイクロデキストリン（ロ‑CDと略）を固定化したセファロースを用 いた。本操作でa‑アミラーゼは2つの活性画分に分離した。一方はロ‑CD担体に弱い相互作用を、
他 方は強 い吸着を 示した。そ れぞれをVAAmylおよぴVAAmy2と 命名した 。ロ‑CDはa‑ア ミラ ーゼ分子における澱粉粒の吸着部位と相互作用する。両活性画分は電気泳動で単一バンドを与え、
精製 標品とし て以降の 実験に使用 した。活性回収は78％(VAAmylで37％、VAAmy2で41％）で あり、高い収率を与えた。
ー1247―
SDS電 気 泳 動 法 でVAAmylは47，000の 、VAAmy2は44，000の 分 子 量 を 与 え た が 、pI値は 一致 した 。両 者の 至適pH、 至適 温度 お よぴpHや 温度 に対 する 安定 領域 はほ ば同 様で あっ た。 グ ルコ ース 重合 度が17お よぴ7の基 質に 対す る特 異性 も似 た結 果を 与 え、 重合 度が5の 基質 への 切 断様 式も一致した。植物a‑アミラーゼは分子構造の保持にCl22゛を要求する。Cl22゛を酵素に与えたが活 性上昇はなく、既にCl22゛の結合が想像され た。EDTA処理により酵素活性が低下し、Cl22゛を与え ても 活性 は回 復せ ず、 不可 逆な 失 活で あっ た。 澱粉 粒へ の吸 着実 験を 行い 、VAAmylの約40％な ら び にVAAmy2の 約90％ が 澱 粉 粒 に 保 持 さ れ 、 澱 粉 粒へ の 吸着 能が 異な るこ とが 認め られ た。
（2） 構造 解析 と2つの 酵素 アイ ソ フオ ーム
VAAmylお よ ぴVAAmy2のN末 端 配 列 は 完 全 に 一 致 し た 。 内 部 配 列 の 解 析 は 、 両 酵 素 の ト リ プ シン 消化 ペプ チド を質 量分 析す る こと で行 った 。得 られ たス ペク トラムは一致し、2つの酵素 の 全ア ミノ 酸配 列は同ーと判断できた。これらの配列 情報はりぴロradiata酵素の ものと符号する た め 、 同 酵 素 の 遺 伝 子 配 列 を 基 に ア ズ キ 子 葉 のcDNAラ イ ブ ラ リ ー か らPCR法 （5 RACE)で 本 酵 素 のDNA断 片 の 増 幅 を 行 っ た 。5 領 域 に 相 当 す る1種 類 の 増 幅 断 片 が 得 ら れ た 。 次 に 、 3 RACE法 で 酵 素 遺 伝 子 の 全 域 に わ た る ク ロ ー ニ ン グ を 行い 、1種 類のmRNA由来 の遺 伝子 を 得 た 。本 遺伝 子のORFは1，266 bpか ら なり 、421ア ミノ 酸残 基を コ ードする。推定 された全アミノ 酸 一 次 配 列 は 、VAAmylお よ ぴVAAmy2のN末 端 配 列 な ら ぴ に 内 部 配 列 を 完 全 に 含 ん で い た 。 シ グナ ル配 列お よび1箇所 の糖 鎖付 加モ チー フが 存在 した 。a‑ア ミラーゼの触媒 アミノ酸が確認 さ れ、 澱粉 粒吸 着ド メイ ンの 存在 も 示さ れた 。全 アミ ノ酸 配列 から の推 定分 子量(44，379） は VAAmyl (47，000)よ り小 さくVAAmy2 (44，000)と 一致 した 。従 って 、分 子量 が増 加す るタ イ プ の 翻訳 後修 飾、 すな わち 糖鎖 修飾 に より 澱粉 粒吸 着能 が低 下し たと 考え られ た。VAAmylお よ び VAAmy2は同 じ基 質特 異性 を与 え、 全 アミ ノ酸 一次 配列 が同 一で ある 。か つ同 一遺 伝子 に起 因 す る こと から2つのa‑ア ミラ ーゼ はア イソ フオ ーム と推 定し た。 澱 粉粒吸着能が異 なる両酵素はア ズ キ種 子の 発芽 に伴 い活 性が 増加 し 同程 度存在するため、澱粉粒の分解機構に関 し異なる役割を 担 って いる と想 像さ れる 。す なわ ち 、VAAmy2が粒 の分 解に 主に 関与 し、 遊離 した グル コー ス ポ リ マー をVAAmylが主 に分 解す る機 構 を想 定し た。
以上 のよ うに 本研 究は 、ア ズキ 発 芽種 子に存在する2つのQ‐アミラーゼの単離 、性質および構 造 の解 析を 行っ たも ので ある 。両 酵 素は アイソフオームであり、他の植物とは異 なり1種類のQ‐ ア ミラ ーゼ 遺伝 子の 発現 によ るこ と 、さ らにそれらが翻訳後修飾により澱粉粒へ の吸着能が変化 す る こ と な ど 、 植 物Q‐ ア ミ ラ ー ゼ に 関 し 学 術 的 に 貴 重 な 基 礎 的 知 見 を 提 供 し て い る 。 よっ て審 査員 一同は、San San Marが博士（農学）の学位を受けるに十分な資格 を有するものと 認 めた 。
