フーリエ変換赤外差スペクトル法: 蛋白質の活性部位構造と分子メカニズム解析

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総

説

フ ー リエ変 換 赤 外 差 スペ ク トル法:

蛋 白質 の活 性 部 位構 造 と分子 メカ ニ ズ ム解 析

野 口 巧 筑 波 大 学 大 学 院 数 理 物 質 科 学 研 究 科 茨 城 県 つ く ば 市 天 王 台1-1-1(〒305-8573) (2008年9月17日 受 領,2008年10月12日 受 理)

Fourier Transform Infrared Difference Spectroscopy:

Analyses of Active-site Structures and Molecular Mechanisms of Proteins

Takumi NOGUCHI

Institute of Materials Science, University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki 305-8573, Japan

(Received September 17, 2008; Accepted October 12, 2008)

For full understanding of the molecular mechanisms of enzymatic reactions, it is crucial to obtain the detailed structural information of the active sites of proteins. Reaction-induced Fourier transform infrared (FTIR) differ-ence spectroscopy, which detects minute changes in the infrared absorption upon some reaction, is a powerful method to investigate the structures and reactions in the active sites of proteins at the atomic and molecular levels. In particular, light-induced FTIR difference spectroscopy that uses light as a trigger to initiate reactions has been extensively used in the studies of molecular mechanisms of photosensitive proteins. In this review article, the methods of measurement and analysis of light-induced FTIR difference spectra are described and applications to the studies of photosensitive proteins are introduced.

Keywords: Fourier-transform infrared spectroscopy, Photosensitive proteins, Molecular mechanism, Vibrational spectroscopy, Structural biology

1.  は じ め に 1.1  「構 造 生 物 学 」 に お け る振 動 分 光 学 生 命 体 が持 つ精 緻 で複 雑 な シ ス テ ム を 可 能 に して い る も の は,そ の構 造 体 の構 築,及 び 様 々な 酵 素反 応 を担 う,多 くの 蛋 白 質 で あ る.20種 類 の ア ミ ノ酸 の 一 次 元 配 列 と有 限 の種 類 の有 機 ・無 機 コ フ ァ ク ター に よ って,無 限 と も言 え る多様 な反 応 を可 能 にす る,そ の メカ ニ ズ ム を 原 子 ・分 子 レベル で 明 らか に し,そ こ に潜 む 共 通 原 理 と多様 性 を 可 能 に す る要 因 とを理 解 す る こ とこそ が,生 命 科 学 が 目指 す 究 極 の 目的 で あ る と言 って も過 言 で は あ るま い.そ の生 命 原 理 が す べ て 明 らか に な った とき,人 工 的 な新 規 機 能 蛋 白 質 の設 計 が可 能 に な り,新 た な 応 用 生 命 科 学 へ の道 が 開 か れ て い く. 蛋 白質 の機 能 ・反 応 機 構 を分 子 レベ ル で 理 解 す るた め に は,ま ず,そ の構 造 を知 る こ とが 必 要 不 可 欠 で あ る.こ の 「構 造 か ら機 能 へ 」 の ス ロ ー ガ ン の 下,い わ ゆ る 「構 造 生 物 学 」 が生 命 科 学 の重 要 な 位 置 を 占め,光 合 成蛋 白質 や チ トク ロ ム酸 化 酵 素 の よ う な 巨大 な 蛋 白質 複 合 体 を 含 め,多 くの 蛋 白質 の 三 次 元 構 造 がX線 結 晶構 造 解 析 に よ っ て 明 らか に さ れ て き た.そ れ で は 蛋 白質 の 三 次 元構 造 が 明 らか に さ れ た結 果,蛋 白質 の 反 応 機 構 は 本 当 に 解 明 さ れ た で あ ろ うか?答 え は否 で あ る.蛋 白質 の 構 造 の 美 しさ に感 動 し,ド メ イ ン構 造 の 共 通 性 に納 得 し,色 素 配 置 の対 称 性 に 感 嘆 した もの の,実 際 の 酵 素 反 応 の 分 子機 構 を理 解 す る た め に必 要 な 活 性 部 位 の 詳 細 構 造 を 表 す に は,X線 結 晶解 析 の構 造 情 報 で は全 く不 十 分 で あ る.な ぜ な ら,多 くの蛋 白 質 のX線 構 造 で は 水 素 が検 出 され ず,基 本 的 に す べ て の酵 素 反 応 に お いて 最 も重 要 な 役 割 を 果 た す 水 素 結 合構 造 や ア ミノ酸 の プ ロ トン 化 構 造 が 明 らか とな らな い.ま た, 蛋 白質 結 晶 中 の 静 的 な 構 造 を 表 す の に 適 し て い るX線 結 晶解 析 は,生 理 的 条 件 下 にお け る水 溶 液 中 の動 的 な構 造 変 化,つ ま り実 際 の酵 素 反 応 の 現 場 を 捉 え るに は 非 常 に不 向 きで あ る.そ れ で は,ど の様 な 手 法 を用 い れ ば,X線 結 晶解 析 の欠 点 を補 い,真 に酵 素 反 応 を 理 解 す るの に 必要 な 構 造 ・反 応 情 報 が得 られ るで あ ろ うか.そ の 答 え とな る有

力 な手 法 が振 動 分 光 法 で あ る. 赤 外 分 光 や ラマ ン 分 光 な どの 振 動 分 光 法 は,分 子 の基 準 振 動 の振 動 数 を検 出 し,化 学 結 合 や 相 互 作 用(主 に水 素 結 合)の 存 在 や 強 度 に よ って 分 子 構 造 を表 わ す.こ れ は,X 線 結 晶解 析 が原 子(電 子 密 度)の 位 置 に よ って分 子 構 造 を 表 す の に相 対 す る手 法 で あ る.後 者 が 分解 能(一 般 的 に は 1-3A)以 下 の構 造 の違 い に対 して鈍 感 で あ るの に対 し, 基 準 振 動 の 振 動 数 は,分 子 の 微 小 な構 造 変 化(例 え ば典 型 的 なC=0結 合 の 場 合,0.001Aの オ ー ダ ー)や 相 互 作 用 変 化 を鋭 敏 に反 映 す る.ま た,結 合 の 解離 や生 成 を 直接 的 に表 し,X線 結 晶 解 析 に よ る検 出 が 困 難 で あ る プ ロ トン 化 構 造 を,X-H(Xは0,N,Sな ど)伸 縮 振 動 や変 角 振 動, ま た は それ ら とカ ップ ル した 振 動 モ ー ドな どで検 出,追 跡 す る こ とに よ り,容 易 に判 断 す る こ とが で きる.こ の よ う に,振 動 ス ペ ク トル 変 化 は 化 学 変化 を 直接 的 に反 映 して お り,そ の 解 析 か ら反 応 の プ ロセ ス を知 り,分 子 機 構 を理 解 す る こ とが で き る. 蛋 白 質 全 体 の 三 次 元 構 造 が視 覚 的 に表 示 さ れ るX線 結 晶解 析 が 「構 造 生 物 学 」 の 中核 で あ る こ とに は 間違 い は な い.し か し,そ う した 構 造 が 比較 的 容 易 に得 られ る よ う に な った 今,三 次 元 構 造 に よ るア ミノ酸 側 鎖,及 び コ フ ァク ター の 位 置 情 報 は,一 次 配 列 と同 レベ ル の,メ カ ニズ ム研 究 に必 須 な 「基 礎 デ ー タ」 とな り,そ れ らの情 報 を基 に研 究 が進 め られ る よ う にな った.現 在 で は,研 究 者 は そ れ ら の 基 礎 デ ー タだ け で は 生 体 系 に お け る複 雑 な反 応 の メ カニ ズ ム を理 解 す る こ とが で きな い こ と も知 っ て い る.そ し て 今,蛋 白質 構 造 の 基 礎 デ ー タを知 った上 で の構 造 ・機 能 解 析 と して の 振 動 分 光 学 の 重 要 性,必 要 性 が 改 め て 認 識 さ れ,注 目され て きて い る1). 1.2  反 応 誘起 フ ー リエ変 換 赤 外 差 スペ ク トル法 振 動 分 光 法 の 中 で も,ラ マ ン分 光 法 は,共 鳴効 果 に よ る 強 度 増 大(共 鳴 ラマ ン 散 乱)を 利 用 して,蛋 白質 の活 性 部 位 にお け る色 素 の 振 動 ス ペ ク トル を選 択 的 に得 る こ とがで き る こ とか ら,古 くか らヘ ム 蛋 白質 な ど,色 素 コ フ ァ ク ター を含 む 構 造 機 能 解 析 に 多 く利 用 さ れ て き た.し か し, 逆 にそ の 高 い 選 択 性 ゆ え に,色 素 中 の特 定 の振 動 モ ー ドの み が 観 測 され,活 性 部位 を構 成 す る ア ミノ酸 側 鎖 や 蛋 白質 コン フ ォ メー シ ョン の 情報 な ど,反 応 の解 析 に必 須 な情 報 を得 る こ とが で きな い とい うジ レン マ が あ っ た. 逆 に,赤 外 ス ペ ク トル に は,対 象 とな る生 体 系 に存 在 す る基 本 的 に す べ て の 分 子 の 振 動 モ ー ドが 現 れ る.そ の 結 果,振 動 モ ー ドの 数 に勝 る蛋 白質 ア ミ ド骨 格 のNH伸 縮 振 動(ア ミ ドA:∼3300cm-1),C=0伸 縮 振 動(ア ミ ド I:∼1650cm-1),及 びNH変 角+CN伸 縮 振 動(ア ミ ドII:∼1550cm-1)に よ るバ ソ ドが ス ペ ク トル の 主 な 強 度 を示 し,ア ミ ノ酸 側鎖 や コ フ ァク タ ー な ど,他 の置 換 基 及 び 分 子 種 の バ ン ドは,ほ とん どが そ の下 に埋 も れ て し ま う(図1a).さ ら に,溶 媒 で あ る水 の 吸 収 バ ン ド(OH伸 縮 振 動:∼3400cm-1,HOH変 角 振 動:∼1640cm-1) は大 き な赤 外 強 度 を 示 し,蛋 白質 のバ ソ ドを マ ス ク す る. よ っ て,か つ て の 赤 外 分 光 法 に よ る蛋 白質 研 究 に お い て は,重 水 置 換 した(ア ミ ドI領 域 か ら水 の変 角 振 動 バ ン ド を除 く)蛋 白質 試 料 を用 い て二 次構 造 解 析 を 行 い,α ヘ リ ック ス や βシ ー ト構 造 な どの割 合 を評 価 す る2),と い った も の が主 流 で あ った.一 方,活 性 部 位 に お け る個 々 の ア ミ ノ酸 側 鎖 や 特 定 の コフ ァ0クター の構 造 や反 応 に関 して は, 赤 外 ス ペ ク トル の 中 に情報 が 隠 さ れ て い る もの の,そ れ を 取 り出 して 解 析 す る こ とは極 め て 困難 で あ っ た. こ の様 な状 況 は,20-30年 程 前 に,従 来 の分 散 型 赤 外 分 光 計 が フ ー リエ 変 換 型 赤 外(FTIR)分 光 計 に取 って 代 わ っ た こ とに よ り一 変 し た.FTIR分 光 計 は,He-Neレ ー ザ ー の 波 長 を基 準 に して駆 動 鏡 の位 置 を検 出 す るた め,イ ン ター フ ェ ログ ラム の フ ー リエ変 換 に よっ て得 られ た 赤 外 ス ペ ク トル の 波 数精 度 が極 め て高 い とい う特 徴 を持 つ.よ っ て,あ る 反 応 の 前 後 で 測 定 した2つ の ス ペ ク トル の 差 ス ペ ク トル を 計 算 す る こ とに よ り,強 い 吸収 バ ン ド下 の 極 め て 微 小 な ス ペ ク トル変 化 を検 出 す る こ とが可 能 に な った (図1).通 常 の測 定 条 件 下(数 分 間 の デ ー タ積 算)に お い て,△Aが10-5オ ー ダ ー の シ グ ナ ル を検 出 す る こ とが で き る程 の 感 度 を 持 つ.こ れ は,ア ミ ド結 合 のバ ン ドで 考 え る と,10万 残 基 よ り成 る 巨大 な 蛋 白質 複 合 体 に お い て, 一 つ の ア ミ ノ酸 残 基 の変 化 を検 出 す る能 力 が あ る こ とを示 す. この よ う に,反 応 に よ って誘 起 さ れ る構 造 変 化 を差 ス ペ ク トル の 形 で 選 択 的 に検 出 す る手 法 を,反 応 誘 起FTIR 差 ス ペ ク トル 法 と呼 ぶ.こ の手 法 の重 要 な点 は,反 応 に関 与 す る構 造 部 分 に対 す る選 択 性 と,赤 外 分 光 が持 つ非 選 択 性 にあ る.生 体 中 で は赤 外 不 活 性 な分 子 は存 在 しな い と考 えて よい た め(酸 素分 子 も金 属 に配 位 す る こ とに よ り対 称 性 が崩 れ て赤 外 活 性 とな る),反 応 に よ って 影 響 を 受 け る 分 子 や 置 換 基 は す べ てFTIR差 ス ペ ク トル 中 に 現 れ る. よ って,コ フ ァク ター の み な らず,蛋 白質 骨 格,各 ア ミ ノ 酸 側 鎖,基 質,そ して水 分 子 な ど,系 に含 まれ るあ らゆ る 分 子 の 構 造 変 化 を検 出 す る こ とが で きる.こ れ は,後 で 述 べ る よ う に解 析 を煩 雑 に す る一 要 因 で は あ る もの の,酵 素 反 応 で 起 こ るす べ て の化 学 変 化 が スペ ク トル 上 に現 れ る と い う点 に お い て,共 鳴 ラマ ン 法 に対 す るFTIR差 ス ペ ク トル 法 の 優 位 点 で あ る とい え る.両 者 を併 用 す る こ とは, バ ン ドの 帰 属,解 析 に と って有 用 で あ る. 蛋 白質 にお い て反 応 を誘 起 す る方 法 と して,光 や 電 位 変 化 な どが 一 般 的 に用 い られ る.微 小 変 化 を 測 定 す る 際 に は,試 料 そ の も の を 入 れ替 え る こ とは基 本 的 に で きな い が,全 反 射 吸 収 法(ATR法)を 用 い れ ば,試 料 を交 換 せ ず に緩 衝 液 の交 換 や,基 質 の取 り込 み が可 能 で あ り,そ の 際 の 差 ス ペ ク トル を測 定 す る こ とが で きる.こ れ らの 中 で も,光 を反 応 ト リガ と して 用 い る 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク

野 口:フ ー リエ変 換 赤 外 差 スペ ク トル 法:蛋 白 質 の 活性 部 位 構 造 と分子 メ カニ ズ ム解 析 277 図1蛋 白質 のFTIRス ペ ク トル と光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル の 例 光 化 学 系II膜 標 品(ペ レ ツ ト状 態)の 光 照 射 前(a), 及 び 光 照 射 後(b)のFTIRス ペ ク トル とそ の 光 誘 起 FTIR差 ス ペ ク トル(c,d).ス ペ ク トルdは ス ペ ク ト ルcを1000倍 に 拡 大 し た もの.差 スペ ク トル に は, 光 化 学 系IIに お け るマ ン ガ ン ク ラ ス ター と第 一 キ ノ ン 電 子 受 容 体QA間 の 電 荷 分 離 状 態S2Q-Aの 生 成 に よ る 構 造 変 化 が 現 れ て い る.測 定温 度 は210K. トル 法 は 光 応 答 性 蛋 白質 の 反 応機 構 研 究 に極 め て有 効 で あ り,早 くか らロ ドプ シ ン3)や光 合成 蛋 白質4・5)に対 して応 用 さ れ て き た.直 接 光 に応 答 性 を 持 た な い 蛋 白 質 の 場 合 に も,ケ ー ジ ド化 合 物 に よ る基 質 や 金属 イオ ン の 光放 出 を利 用 す る と,結 合 部 位 の 構造 や 反 応 を調 べ る こ とが で きる. 本 稿 で は,光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル の 測 定 ・解 析 法 に つ い て簡 単 に述 べ,そ の 応 用 例 に つ い て,筆 者 らに よ っ て 得 られ た 結 果 を 中 心 に 解 説 す る.尚,反 応 誘 起FTIR差 スペ ク トル 法 に関 して は,こ れ ま で に も多 くの 総説 が 出 さ れて い るの で そ れ らを 参 照 され た い6-8). 2.  光 誘 起 フ ー リエ 変 換 赤 外 差 ス ペ ク トル 法 の 実 際 2.1  測 定 法 図2に,筆 者 らの 研 究 室 で 使 用 し て い る 光 誘 起FTIR 差 スペ ク トル 測 定 装 置 の 概 略 を示 す9).検 出 器 には,高 感 度 で の測 定 が可 能 なMCT検 出器 を 用 い る.試 料 部 は,蛋 白質 の種 類 と 目的 に応 じて 様 々な 形態 を 取 り得 る.こ こで 図2  光 誘 起FTIR差 スペ ク トル測 定 の 装 置 の 概 略 図 こ こで は,Nd:YAGレ ー ザ ー の パ ル ス光 を 用 い て 水 和 蛋 白質 試 料 を励 起 し,FTIR差 ス ペ ク トル を測 定 す る場 合 を示 して い る. は,蛋 白質 の 水 和 試 料 を 用 い て10℃ で 測 定 す る場 合 が 記 され て い る.水 和 試 料 は,密 閉 した赤 外 セル 中 に置 いた グ リセ リン/水 混 合 溶 液 に よ っ て,セ ル 中 の 相 対 湿 度 を コン トロー ル し,軽 く乾 燥 さ せ た試 料 を適 度 に水 和 させ る こ と に よ り得 る10).グ リセ リン と水 の 割 合 を 変 え る こ とに よ り,試 料 の 水 和 量 を 変 化 させ る こ とが で きる.こ の よ う な 水 和 試 料 を 用 い る こ とに よ り,バ ル ク の水 の吸 収 バ ン ドを 抑 え,そ こ に重 な る蛋 白質 や蛋 白 質 内 水分 子 の バン ドの 測 定 が可 能 にな る.ま た,差 ス ペ ク トル 測定 で は試 料 の変 動 を極 力 抑 え るの が 望 ま しい.水 和 試 料 は,常 温 に近 い生 理 的 条 件 下 で 測 定 した い と き に試 料 の安 定 性 を 向 上 さ せ, ベ ー ス ラ イン の 歪 み を減 らす の に 適 して い る.ク ラ イ オ ス タ ッ トを用 いて 溶 液 試 料 を 凍 結 す る こ とに よっ て も,同 じ 目的 を達 す る こ とが で き る.低 温 測定 は,特 定 の反 応 中間 状 態 を選 択 的 に観 測 す るた め も重 要 で あ り,ま た 中 間状 態 の 寿 命 を 長 く し,そ れ に よ って 差 スペ ク トル のS/Nの 向 上 を図 る こ とが で き る. 試 料 へ の 光 照 射 に は,目 的 に 応 じて,定 常 光 や パ ル ス レ ーザ ー 光 を用 い る.試 料 室 の 光 照射 用 の 窓 に は電 磁 シ ャ ッ タ ー を 設 置 す る.光 照 射 及 び シ ャ ッ タ ー の 開 閉 は, FTIR分 光 計 か ら のTTLト リガ を 用 い て コ ン ト ロ ー ル し,ス ペ ク トル 測 定 と同 期 させ る.光 応答 性 蛋 白質 の測 定 で特 に注 意 が 必 要 な の は,干 渉 計 か ら試 料 室 に漏 れ 出 る He-Neレ ーザ ー の 赤 色 光 を,Ge基 板 の 多 層 膜 干 渉 フ ィル タ ー な どで カ ッ トす る こ とで あ る.ま た,尖 頭 値 の高 いパ ル ス光 を用 い る際 には,そ の 反 射 光 が 検 出 器 の素 子 を傷 め る こ とが あ る の で,試 料 と検 出器 の 間 に もGeフ ィル タ ー を置 く. ATR法 と光 誘 起 差 ス ペ ク トル 法 の 組 み 合 わ せ も可 能 で あ る.こ の 場 合,ATR結 晶上 に 試 料 を吸 着 さ せ,緩 衝 液 を交 換 す る こ とに よ り,同 一 試 料 を 用 い て様 々な 条件 の測

定 が可 能 に な る11).ATR結 晶 にSiやGeな ど,可 視 光 を 透 過 しな い 材 質 の もの を用 い れ ば,He-Neレ ー ザ ー か ら の可 視 光 を カ ッ トす るた め の フ ィル タ ー は不 要 で あ る. 2.2  解 析 法 得 られ たFTIRス ペ ク トル に お け るバ ン ドの 帰 属 法 は,振 動 ス ペ ク トル に共 通 で あ る.経 験 的 な グ ル ー プ 振 動12)に よ り大 ま か な 帰 属 は 可 能 で あ る が,そ れ を 確 認 す る た め に は,様 々 な 安 定 同 位 体 置 換 が 必 要 とな る.例 え ば,重 水 に よる 解 離 性 プ ロ トン のD置 換,蛋 白質 全 体 の 15N_{,13C,34S置 換13-16),各 ア ミ ノ酸 の 選 択 的 同 位 体 置 換} (例 え ば,[4-13C]Tyrや[15N]Hisな ど)17-19)など が一 般 に用 い られ る.部 位 特 異 的変 異 導 入 に よ る ア ミ ノ酸 改 変 も 有 効 な 手 段 で あ る が20),変 異 に よ る二 次 効 果 が ス ペ ク ト ル 上 に現 れ る可 能 性 が高 い の で,ス ペ ク トル の 解 釈 の 際 に は 十 分 に 注 意 す る必要 が あ る.最 近 は,密 度 汎 関 数 法 な ど に よ る量 子化 学 計 算 を,研 究 室 の ワー クス テー シ ョン な ど を 用 い て 手軽 に行 え る よ うに な っ た.バ ン ドの 振 動 数 か ら 正 しい構 造 情 報 を得 る た め の解 析 基 準 を,様 々な 構 造 や 相 互 作 用状 態 を仮 定 したモ デル 化 合 物 の 振 動 計 算 と,入 手 可 能 な実 測 デ ー タ か ら作 成 す る こ とが で き る21-23).ま た, 同 じ試 料 で共 鳴 ラ マ ン スペ ク トル の 測 定 が 可 能 で あ る場 合 に は,そ の結 果 をFTIRス ペ ク トル と比 較 す る こ とに よ り,色 素 と蛋 白質 のバ ン ドを あ る程 度 区 別 す る こ とが 可能 で あ る. 3.  光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル 法 の 応 用 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル 法 の 応 用 例 と して,筆 者 ら の 研 究 の 中 か らい くつ か 取 り上 げ る.こ こで 紹 介 す る の は,光 化 学 系II蛋 白質 に お け る光 合 成 酸 素発 生反 応,シ ア ノ バ ク テ リア が 持 つ 青 色 光 受 容蛋 白質PixD,及 び ア ミ ド 合 成 酵 素 で あ る光 応 答 性 ニ ト リル ヒ ドラ ター ゼ の3つ で あ る.い ず れ もFTIR差 ス ペ ク トル 法 の 特 徴 と有 用 性 を 示 す の に適 した系 で あ る. 3.1  光 合 成 酸 素 発 生 酵 素 機構 植 物 や シ ア ノバ ク テ リア は,光 合 成過 程 に お い て水 を分 解 し,酸 素 を発 生 す る.こ の 光 合 成 酸 素 発生 は,地 球 大 気 の21%を 占 め る酸 素 の 供 給 源 で あ り,我 々人 間 を 含 め た 酸 素 呼 吸生 命 の 生 存 を支 えて い る.し か しな が ら,こ の最 も基 本 的 な生 命 現 象 の 一 つ で あ る酸 素発 生反 応 の分 子 メ カ ニ ズ ム は,未 だ ほ とん ど解 明 され て い な い.触 媒 部 位 で あ る マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー の 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル は 1992年 に筆 者 ら が初 め て 報 告 し24),2001年 に は す べ て の 光 誘 起 中 間 状 態 遷 移 のFTIR差 ス ペ ク トル が 測 定 さ れ た25,26).これ ま で,こ のFTIR法 を用 い て配 位 子 や 水 分 子 の 構 造 ・反 応 に 関 す る 様 々 な 情 報 が 得 ら れ て き た5,9,27-29).その 中 には,最 近 報 告 され た3.0-3.5A分 解 能 のX線 結 晶 構 造30,31)によ っ て 再 確 認 さ れ た も の も あ る が,逆 に矛 盾 す る点 もあ り,現 在 も筆 者 らを含 め い くつ か の グ ル ー プ で詳 細 な解 析 が続 け られ て い る.ま た,蛋 白質 中 の 水 分 子 の反 応 や水 素 結 合 相 互 作 用 の 変 化 を,分 子 レベ ル で 直 接 的 に検 出 で き る こ とは,FTIR差 ス ペ ク トル 法 の 利 点 の 一 つ で あ る.ロ ドプ シソ や バ ク テ リオ ロ ドプ シ ン な ど,プ ロ トン移 動 を起 こす他 の光 応答 性 蛋 白質 に おい て も, FTIR法 に よ る水 分 子 の研 究 が活 発 に行 わ れ て い る32,33). 3.1.1  光 化 学 系IIに お け る酸 素 発 生 反応 光 合成 は,太 陽光 エネ ル ギ ー を用 い て 二 酸 化炭 素 を 同化 し,糖 を合 成 す る プ ロ セ ス であ り,地 球 上 で 行 わ れ る最 大 規 模 の生 体 エ ネル ギ ー変 換 系 で あ る.植 物 や シ ア ノバ ク テ リア が 営 む酸 素 発 生 型 光 合 成 で は,二 酸 化炭 素 を 還 元 す る た め の末 端 電 子 供 与 体 と して 水 分 子 を用 い て お り,そ の酸 化 反 応 の副 産 物 と して酸 素 が 放 出 され る.光 合 成 電 子伝 達 系 の酸 化 側 末 端 に位 置 し,こ の 酸 素 発 生 反 応 を担 うの が光 化 学 系IIで あ る.光 化 学 系IIは30種 類 もの 蛋 白質 サ ブ ユ ニ ッ トと,ク ロ ロ フ ィル,カ ロ テ ノ イ ド,プ ラ ス トキ ノ ン,フ ェオ フ ィチン,鉄,マ ン ガ ソ な ど,様 々な 色 素 と金 属 イ オ ン よ りな る蛋 白質 複 合 体 で あ る34).反 応 中 心 に お

ける色素配置を図3Aに 示す.ク ロロフィルの最低励起

一

重項状態から初発電荷分離が起こると,フ ェオフィチソ

(Pheo)と ク ロ ロ フ ィ ル 二 量 体(P680)問 で 電 荷 分 離 状 態(Pheo-P680+)が 形 成 さ れ,電 子 は,第 一 キ ノ ソ 電 子 受 容 体QA,第 二 キ ノ ソ 電 子 受 容 体QBへ と 順 次 渡 さ れ る.一 方,P680上 の 正 孔 は チ ロ シ ン 残 基Yz(D1-Tyr161) を 経 由 し て,い わ ゆ る マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー に 渡 さ れ,そ こ で 水 の 酸 化 反 応 が 行 わ れ る. マ ソ ガ ン ク ラ ス タ ー は4つ の マ ソ ガ ソ イ オ ソ と1つ の カ ル シ ウ ム イ オ ソ よ りな る 金 属 ク ラ ス タ ー で あ り,近 傍 の ア ミ ノ 酸 側 鎖 と と も に,触 媒 部 位 と し て の 酸 素 発 生 中 心 を 構 成 す る(図3B).現 在 ま で に 得 ら れ て い る 分 解 能(3.0-3.5A)のX線 結 晶 構 造30,31)で は,金 属 原 子 同 士 の 位 置 関 係 や 結 合 構 造(μ-オ キ ソ 架 橋 な ど)を 正 確 に 示 す こ と は で き て い な い.ま た,X線 照 射 に よ る 傷 害 に よ りMnの 酸 化 数 が 変 化 し,本 来 の 構 造 を 保 っ て い な い と の 報 告 も あ る35,36).基 質 水 分 子 の 位 置 も 全 く不 明 で あ る. 酸 素 発 生 反 応 はS状 態 と 呼 ば れ る5つ の 中 間 状 態(Si, i=0-4)の 光 駆 動 サ イ ク ル(S状 態 サ イ ク ル)に よ っ て 行 わ れ,2分 子 の 水 が4電 子 酸 化 さ れ,一 分 子 の 酸 素 と4つ の プ ロ トソ に 分 解 さ れ る37,38).暗 中 で 安 定 なS1状 態 に 閃 光 を 連 続 的 に 照 射 す る と,閃 光 ご と にS2,S3,S4へ と順 次 遷 移 す る.S4状 態 は 実 体 が 未 だ 不 明 な 過 渡 的 状 態 で あ り,酸 素 を 放 出 し てSo状 態 へ と緩 和 す る.4閃 光 目 でSo はS1へ と遷 移 し,サ イ ク ル が 完 了 す る(図3C).こ の 過 程 に お い て 基 質 で あ る 水 分 子 が ど こ で サ イ ク ル に 挿 入 さ れ る の か,ま た プ ロ トン が ど の ス テ ッ プ で 放 出 さ れ る の か な ど,反 応 の 基 本 的 な 事 柄 に 関 し て も最 終 的 な 結 論 が 得 られ て い な い.

野 口:フ ー リエ変 換 赤 外 差 スペ ク トル 法:蛋 白質 の 活 性部 位構 造 と分子 メカニ ズ ム解 析 279

A

B

_C

図3  光 化 学系IIの 電 子 伝 達 系 と酸 素 発 生 中 心

光 化 学 系II反 応 中 心 の 色 素 配 置(A)と 酸 素 発 生 マ ソ ガ ソ ク ラ ス タ ー の 構 造(B).好 熱 性 シ ア ノ バ ク テ リ アTher-mosynechococcus elongatusの 光 化 学 系II蛋 白 質 複 合 体 のX線 結 晶 構 造(PDBentry2AXT)31)よ り作 成.(C)酸 素 発 生 反 応 に お け るS状 態 サ イ ク ル.Sl状 態 が 暗 中 で 最 も 安 定 で あ り,4閃 光 で 一 周 す る. 3.1.2 S状 態 サ イ ク ル の 閃 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル 図3Aに 示 さ れ る よ う に 光 化 学 系IIに は 多 く電 子 伝 達 成 分 が 存 在 し,こ れ ら の 反 応 は,そ れ ぞ れ の 活 性 部 位 に お け る 蛋 白 質 との 相 互 作 用 に よ っ て 制 御 さ れ て い る.そ れ ら の 分 子 機 構 を 知 る た め に は,各 活 性 部 位 に お け る 反 応 の FTIR差 ス ペ ク トル を 測 定 す る 必 要 が あ る.現 在 で は,試 料 形 態(膜 標 品,コ ア 複 合 体,反 応 中 心 複 合 体 な ど)や, 特 定 の コ フ ァ ク タ ー の 欠 失 処 理,酸 化 還 元 電 位,電 子 伝 達 ドナ ー ・ア ク セ プ タ ー の 添 加,温 度 な ど,様 々 な 条 件 を 変 え る こ と に よ り,光 化 学 系IIに お け る 各 コ フ ァ ク タ ー の 反 応 の み を 表 すFTIR差 ス ペ ク ト ル を 取 り 分 け る 手 法 が 確 立 し て い る5).

図4Aに,光 化 学 系II蛋 白 質 の 水 和 試 料 にNd:YAG レ ー ザ ー か ら の 閃 光(532nm:∼7ns)を 照 射 す る こ と に よ っ て 得 た,S状 態 サ イ ク ル のFTIR差 ス ペ ク トル を 示 す10).フ ェ リ シ ア ン 化 物 イ オ ン に よ っ て,キ ノ ン 電 子 受 容 体 か ら電 子 を 蛋 白 質 の 外 に 引 き抜 く こ と に よ り,酸 素 発 生 中 心 の み に 由 来 す る スペ ク トル を 得 る こ と が で き る.1, 2,3,4閃 光 目 の ス ペ ク トル は,基 本 的 に,そ れ ぞ れS1→ S2,S2→S3,S3→So,So→S1遷 移 の 際 の 構 造 変 化 を 表 し て い る.ど の ス ペ ク トル に も,カ ル ボ キ シ ル 基 の 逆 対 称 伸 縮 振 動(1600-1500cm-1),及 び 対 称 伸 縮 振 動(1450-1350 cm-1)の 領 域 に 複 数 の 顕 著 な バ ン ドが 現 れ て い る.特 に, 後 者 の 領 域 の バ ン ドは15N置 換 で 全 く変 化 せ ず,13C置 換 に よ っ て す べ て 低 波 数 シ フ トを 示 し た こ と か ら,こ れ ら は 基 本 的 に す べ て カ ル ボ キ シ ル 基 の 振 動 で あ る と帰 属 さ れ て い る14,15).1760-1700cm-1のCOOH基 のC=0伸 縮 振 動 の 領 域23)に は 顕 著 な バ ン ドが 観 測 さ れ な い こ と か ら,こ れ ら の バ ソ ドは カ ル ボ キ シ ル 基 の プ ロ トン 化 反 応 に よ っ て 現 れ て い る の で は な く,脱 プ ロ トン 化 し た 状 態 で,配 位 子 と し て,ま た は 水 素 結 合 を 通 し て マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー と相 互 作 用 し,反 応 に 関 与 し て い る と考 え られ る.ま た,ア ミ ドI領 域(1700-1600cm-1)に も 多 数 の バ ン ドが 観 測 さ れ,蛋 白 質 の 二 次 構 造 が 酸 素 発 生 反 応 の 過 程 で 大 き く変 化 す る こ と が 分 か る. そ れ ぞ れ の バ ン ドに 対 応 し て,別 の 遷 移 に お い て,ほ ぼ

A

B

図4  酸 素 発 生 中 心 の 閃 光 誘 起FTIR差 スペ ク トル A:1800-1200cm-1領 域;B=3800-2200cm-1領 域.1(a),2(b),3(c),4(d)閃 光 目 の ス ペ ク ト ル は,そ れ ぞ れS状 態 サ イ ク ル のS1→S2,S2→S3,S3→ S0,S0→S1遷 移 の 際 の 構 造 変 化 を 示 す. 同 じ振 動 数 の バ ン ドが逆 の 符号 で現 れ て お り,マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー の 配 位 子 及 び そ の 近 傍 の 構 造 がS状 態 サ イ クル の 中 で 周 期 的 変化 を す る こ とが 明瞭 に表 され てい る.酵 素 反 応 に お い て 蛋 白 質 は 触 媒 と し て の 役 割 を 果 た し,そ の 構 造 変 化 は 反 応 サ イ ク ル が 一 周 す る こ と に よ り,元 の 状 態 に 戻 る.図4Aの ス ペ ク トル は,酸 素 発 生 反 応 と い う酵 素 反 応 の 際 の 蛋 白 質 骨 格 や 個 々 の ア ミ ノ 酸 側 鎖 の 動 き を,中 間 状 態 ご と に 原 子 ・分 子 レベ ル で 追 跡 で き る こ とを 表 し て い る.つ ま り,こ の ス ペ ク トル を 読 み 解 く こ と に よ り,酸 素 発 生 反 応 の 反 応 プ ロ セ ス 全 体 を 詳 細 に 知 る こ とが で き る は ず で あ る. カ ル ボ キ シ ル 基 の 対 称 伸 縮 振 動 領 域 に お け る 対 応 す る ピ ー ク の 数 か ら,5,6個 の カ ル ボ キ シ ル 基 が マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー と相 互 作 用 し て い る と考 え られ る.こ れ は 最 近 の X線 結 晶 構 造30,31)で予 想 さ れ た マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー の カ ル ボ キ シ ル 配 位 子 の 数 と一 致 す る(図3B).し か し な が ら, 配 位 子 の 候 補 に 部 位 特 異 的 変 異 を 施 し て もFTIRス ペ ク トル が 変 化 し な い と報 告 さ れ て い る も の が 多 く,FTIRス ペ ク トル とX線 結 晶 解 析 の 結 果 に は 明 ら か な 矛 盾 点 が 見 ら れ る20).カ ル ボ キ シ ル 基 の 各 バ ン ドの 特 定 の ア ミ ノ 酸 側 鎖 へ の 帰 属 が,今 後 の 大 き な 課 題 で あ る. Ca2+イ オ ン が 酸 素 発 生 反 応 に 必 要 で あ る こ と は 以 前 か ら知 ら れ て お り,こ れ を 除 去 す る こ と に よ り,S2以 降 の 遷 移 が 阻 害 さ れ る37).X線 結 晶 解 析 の モ デ ル の お い て も, Ca原 子 がMn原 子 の 近 傍 に 位 置 し て い る30，31).Ca2+除 去 に よ っ て,S1→S2遷 移 のFTIR差 ス ペ ク ト ル は 大 き く変 化 し た39,40).ま た,酸 素 発 生 能 が 保 た れ るCa2+か らSr2+ へ の 置 換 に よ っ て,各S状 態 遷 移 の ス ペ ク ト ル に お け る,い く つ か の カ ル ボ キ シ ル 基 の 伸 縮 振 動 バ ン ドが 明 ら か な シ フ ト を 示 し た41).こ れ ら の 結 果 は,Ca2+がMnィ オ ン と強 く相 互 作 用 し て お り,そ の 除 去 や 他 の 金 属 イ オ ン へ 置 換 に よ り,マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー の 配 位 構 造 が 変 化 す る こ と を 示 し て い る. ヒ ス チ ジ ン の イ ミ ダ ゾ ー ル 基 は1100cm-1付 近 にCN伸 縮 振 動 の バ ン ド を 示 し,プ ロ ト ン 化 構 造 の マ ー カ ー と な る21).イ ミ ダ ゾ ー ル 基 の 窒 素 を15Nに 同 位 体 置 換 し た 試 料 のFTIRス ペ ク ト ル か ら,S2/S1差 ス ペ ク トル 中 の1114 cm-1の ピ ー ク は ヒ ス チ ジ ン 側 鎖 に 由 来 す る こ と が 示 さ れ,そ の ピ ー ク 位 置 と重 水 素 置 換 の 結 果 か ら,こ の ヒ ス チ ジ ン はNπ-H(イ ミ ダ ゾ ー ル 環 中 で 側 鎖 に 近 い 窒 素 が Nπ,遠 い 窒 素 がNτ)構 造 を 取 り,Nτ がMnイ オ ン と 相 互 作 用 す る こ と が 推 測 さ れ た17).ま た,2900-2500cm-1 に は,ヒ ス チ ジ ン のNH伸 縮 振 動 由 来 の フ ェ ル ミ 共 鳴 ピ ー ク が 現 れ,Nπ-Hは 強 い 水 素 結 合 を 形 成 し て い る こ と が わ か る.X線 結 晶 構 造 で は,D1-H332のNτ がMnと 配 位 で き る 距 離 に 存 在 し(図3B),ま た,そ のNπ はD1-Glu329の 骨 格C-0と 水 素 結 合 可 能 な 距 離 に 位 置 し て い る.こ れ ら は,FTIRの 結 果 と 一 致 す る.一 方,D1-H337も マ ン ガ ソ ク ラ ス タ ー の 近 傍 に 存 在 し て お り,マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー と何 ら か の 相 互 作 用 して い る 可 能 性 が 考 え ら れ る.

野 口:フ ー リエ 変 換 赤 外 差 ス ペ ク トル法:蛋 白質 の活 性 部 位 構 造 と分 子 メ カニ ズ ム 解 析 281 炭 酸 水素 イオ ン(HCO-3)が 酸 素 発 生 反 応 に 関与 して い る こ とを 示 唆 す る実 験 結 果 が,こ こ10年 程 の 間 に 次 々 と 報 告 され,そ れ が マ ン ガン ク ラス ター の 配 位 子 の 一 つ で あ るい う説 が提 唱 さ れ て い た42).実 際,3.5A分 解 能 の結 晶 構造 で は,炭 酸 水 素 イ オ ン を配 位 子 とした マ ン ガ ン ク ラス ター の モ デル が 報 告 され た30).こ の 真 偽 を 確 か め る た め に,筆 者 らは,12C-炭 酸 水 素 イ オ ン と13C-炭 酸 水 素 イ オ ン を 加 え た 光 化 学 系II蛋 白 質 を 用 い てS状 態 サ イ クル の FTIRス ペ ク トル を測 定 し た43).し か しな が ら,マ ン ガ ン ク ラス ター に 由来 す るバ ン ドに 同位 体 置 換 に よ る変 化 は 全 く観 測 され ず,炭 酸 水 素 イ オ ン は酸 素 発 生 反 応 にお い て 何 らか の 役 割 を果 た して い る もの の,マ ン ガ ン グ ラス ター と 構 造 的 な 相 互作 用 を して い な い こ とが示 され た. 3.1.3  水 分 子 の 反 応 の 検 出 水 分 解反 応 の メ カ ニ ズ ム を解 明す るた め には,基 質 水 分 子 や そ れ を 含 む 水素 結 合 ネ ッ トワー クの 構 造 と反 応 を 知 る 必 要 が あ る.図4Bに,S状 態 サ イ クル のFTIRス ペ ク ト ル の 高 波 数 領 域 を示 す44).こ こ に は 水 素 が 関 与 す る振 動 モ ー ドが現 れ る.3800-3000cm-1に は 水 分 子 のOH伸 縮 振 動 が存 在 し,ま た3000-2200cm-1に 観 測 さ れ る 幅 の 広 いバ ン ドは 水 素 結 合 ネ ッ トワ ー ク に 由 来 す る45).こ の バ ン ドの 存 在 は,極 性 プ ロ トン を含 む水 素 結 合 ネ ッ トワー ク の 変 化 が マ ン ガ ン ク ラ ス タ ー の周 りで起 こ る こ とを示 して い る.弱 い水 素 結 合 を形 成 す る水 分 子 は,OH伸 縮 振 動 領 域 の 高 波 数 側(3700-3500cm-1)に 比 較 的 シ ャー プ な バ ン ドを示 す た め,解 析 が容 易 で あ る.一 方,強 い水 素 結 合 を形 成 す る こ とに よ り,バ ン ド幅 は大 き く広 が り,低 波 数 シ フ トして3300cm-1付 近 の 蛋 白質 骨 格 の ア ミ ドA(NH 伸 縮)領 域 と重 な るた め,解 析 は よ り困難 とな る. 弱 い 水 素 結 合 のOH領 域 に お い て,一 閃 光 目の ス ペ ク トル(S1→S2)に は3617/3588cm-1に 微 分 形 のバ ン ドが 現 れ,2(S2→S3),3(S3→So),4(So→S1)閃 光 目の ス ペ ク トル で は,そ れ ぞ れ,3634,3621,3612cm-1に 負 の バ ン ドが 現 れ た(図4B)44).こ れ らの バ ン ドは す べ てH2180 置 換 に よ り低 波 数 シ フ トを示 す こ とか ら,蛋 白質 由来 の バ ン ドで は な く,水 分 子 のOH伸 縮 振 動 に 帰 属 さ れ た.一 閃 光 で の 正 負 の バ ン ドは,水 分 子 の水 素 結 合 構 造 の 変 化 を 表 して い る.H20/D201:1溶 液 中 で 同様 の 測 定 を行 い, 水 分 子 中 の2つ のOH振 動 を デ カ ップ ル させ た 際 の シ フ ト値 か ら,そ の カ ッ プ リン グ 強 度 を見 積 も っ た.そ の 結 果,こ の 水 分 子 は,強 く水 素 結 合 を す るOHと 弱 く水 素 結 合 をす るOHよ りな る非 対 称 的 な 水素 結 合 構 造 を持 ち, S1→S2遷 移 に よ りそ の 水 素 結 合 構 造 が さ らに 非 対 称 化 す る こ とが示 さ れ た46).2,3,4閃 光 目の 負 の バ ン ドは,S2 →S3,S3→So,及 びSo→S1遷 移 に お い て,水 分 子 か らの プ ロ トン 解 離,ま た は 弱 い 水素 結 合 か ら強 い水 素 結 合 へ の 変 換 が起 こ る こ とを 示 して い る. 水 素 結 合 に よ るバ ン ド幅 の広 が りに よっ て検 出 が 困難 に な るOH伸 縮 振 動 に 対 し,1640cm-1付 近 に 現 れ る 水 の 変 角 振 動 は,そ の よ う な 著 し い バ ン ド幅 の 広 が り を 示 さ な い た め,バ ン ド の 同 定 が 可 能 で あ れ ば,水 分 子 の 反 応 解 析 に 非 常 に 有 益 で あ る.し か し な が ら,こ の 領 域 に は,強 度 が 大 き く,ま た 試 料 や 測 定 条 件 の 僅 か な 違 い に 敏 感 で あ る ア ミ ドIバ ン ド が 多 数 存 在 し て い る た め,蛋 白 質 反 応 に 関 与 す る 水 分 子 のHOH変 角 振 動 の 同 定 に 関 し て は,こ れ ま で 成 功 例 が 報 告 さ れ て い な か っ た.筆 者 ら は,最 近,重 水 置 換 し た 光 化 学 系II蛋 白 質 を 用 い て,水 分 解 反 応 に 関 与 す るD20分 子 のDOD変 角 振 動 バ ン ド を 検 出 し た47).D20 変 角 振 動 は1210cm-1付 近 に バ ン ドを 示 し,他 の 蛋 白 質 の バ ン ド とほ とん ど 重 な ら な い た め,D2180中 で の ス ペ ク ト ル との 二 重 差 ス ペ ク トル を 計 算 す る こ と に よ り,DODバ ソ ド の み の 抽 出 が 可 能 で あ る.S状 態 サ イ ク ル の 際 の DODバ ン ドの 変 化 を 解 析 す る こ と に よ り,ど の 遷 移 に お い て も,少 な く と も2分 子 の 水 分 子 が,脱 プ ロ トン 化 し て い な い 構 造 で 反 応 に 関 与 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た.ま た,基 質 水 分 子 は,S2→S3及 びS3→So遷 移 に お い て,蛋 白質 中 の 分 子 内 水 ク ラ ス タ ー か ら酸 素 発 生 中 心 に 取 り込 ま れ る こ と が 示 唆 さ れ た.こ の 結 果 は,こ れ ら の 遷 移 が 他 の 遷 移 に 比 べ て 水 和 量 の 減 少 に 対 し て 敏 感 で あ り,よ り顕 著 な 効 率 の 低 下 を 示 す と い う 実 験 結 果10)と 一 致 し て い る. 基 質 水 分 子 か ら の プ ロ トン 放 出 が 起 こ る 遷 移 を 同 定 す る 一 つ の 方 法 は ,各S状 態 遷 移 のpH依 存 性 を 調 べ る こ とで あ る.こ の 際,各S状 態 遷 移 に 特 有 のFTIR差 ス ペ ク ト ル の 複 雑 な バ ン ドパ タ ー ン を,そ れ ら を 表 す 「指 紋 」 と し て 利 用 す る こ と に よ り,pHを 変 化 さ せ た 際 の 遷 移 効 率 を 求 め る こ と が で き る.標 準pH(pH6.0)に お け る4つ の 差 ス ペ ク トル を 標 準 ス ペ ク トル と し,様 々 なpHで 得 ら れ た 閃 光 誘 起 ス ペ ク トル を,こ れ ら の 標 準 ス ペ ク トル の 線 形 結 合 で フ ィ ッ テ ィ ン グ す る こ と に よ っ て,各 遷 移 の 遷 移 効 率 を 見 積 も っ た48).そ の 結 果,S1→S2遷 移 は 広 いpH範 囲 に お い てpH依 存 性 を 示 さ ず,一 方,S2→S3,S3→So, So→S1遷 移 で は ど れ も 低pH領 域 で の 阻 害 が 観 測 さ れ た (pKaは そ れ ぞ れ3.6±0.2,4.2±0.3,4.7±0.5).こ の 結 果 は,S1→S2遷 移 で は プ ロ トン 放 出 は 起 こ ら ず,そ れ 以 外 の3つ の 遷 移 に お い て,基 質 か ら プ ロ トソ が 放 出 さ れ る こ とを 示 し て い る. 3.2  青 色 光 受 容 蛋 白 質PixDに よ る シ グ ナ ル 伝 達 多 くの 生 物 は,光 を エ ネ ル ギ ー と して で は な く,シ グ ナ ル と し て 用 い る こ と に よ り,生 命 活 動 に 必 要 な 様 々 な 制 御 を 行 っ て い る.青 色 光 を シ グ ナ ル と し て 利 用 す る た め の 光 受 容 蛋 白 質 に は,色 素 と し て フ ラ ビ ン を 結 合 し た も の が 多 く存 在 し,そ の 光 受 容 部 の ド メ イ ン 構 造 はPHR(pho-tolyase homology region),LOV(light,oxygen,and

voltage),及 びBLUF(blue light sensing using FAD)ド メ イ ン の3つ に 分 類 さ れ る.そ れ ら は,そ れ ぞ れ 異 な っ

A

B

図5  青 色 光 受 容 蛋 白質PixDの フ ラ ビ ン結 合部 位 の構 造

A:Thermosynechococcus elongatus由 来 のPixDの X線 結 晶 構 造(PDB entry 1XOP)51)に よ る モ デ ル. B:Tyr8が 水 素 結 合 供 与 体(a)及 び 受 容 体(b)と し て 働 く場 合 の 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ-ク の 構 造. た フ ラ ビ ン の 初 期 光 反 応 の メ カ ニ ズ ム を 持 つ こ とが 知 ら れ て い る49). シ ア ノ バ ク テ リ ア が 持 つ 青 色 光 受 容BLUF蛋 白 質 で あ るPixD(positivephototaxisfactorD)は,走 光 性 の 制 御 に 関 わ り,そ の シ グ ナ ル 伝 達 カ ス ケ ー ドの 一 端 を 担 う50). PixDは,光 を 吸 収 す る と,フ ラ ビ ン の 電 子 吸 収 バ ン ドが 10nmほ ど長 波 長 シ フ トを 示 す 中 間 状 態(明 状 態 ま た は シ グ ナ ル 状 態)に 移 行 し,そ れ に 伴 う 蛋 白 質 の 構 造 変 化 が シ グ ナ ル と し て 伝 達 さ れ る.好 熱 性 シ ア ノ バ ク テ リ アTher-mosynechococcus elontatusのPixDのX線 結 晶 構 造51)に よ る と(図5A),フ ラ ビ ン の 周 辺 に は グ ル タ ミ ン や ア ス パ ラ ギ ン,チ ロ シ ン な ど の ア ミ ノ酸 残 基 が 存 在 し,水 素 結 合 ネ ッ トワ ー ク を 形 成 し て い る.こ れ らの ア ミ ノ酸 残 基 の う ち,Tyr8やGln50に 部 位 特 異 的 変 異 を 施 す と,正 常 な 光 反 応 が 阻 害 さ れ る こ と か ら,こ れ らの ア ミ ノ 酸 側 鎖 の 水 素 結 合 相 互 作 用 がPixDの 光 反 応 と シ グ ナ ル 伝 達 機 構 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る と考 え ら れ た51,52).特 に,時 間 分 解 吸 収 の 結 果 か ら,フ ラ ビ ン の 最 初 の 光 反 応 は,Tyr8か ら の 電 子 移 動 と そ れ に 共 役 し た フ ラ ビ ンN5へ の プ ロ トン 移 動 で あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る53).よ っ て,Tyr8か ら Gln50を 経 由 し て フ ラ ビ ン に 至 る 水 素 結 合 ネ ッ トワ ー ク の 構 造 と そ の 変 化 を 明 ら か に す る こ と が,PixDの 光 反 応 の 分 子 機 構 を 理 解 す る 上 で の 鍵 と な る. し か し な が ら,こ れ ま で に 報 告 さ れ たX線 結 晶 構 造51) で は 水 素 原 子 は 検 出 さ れ て お ら ず,ま た,Gln50の ア ミ ド 基 のNと0の 区 別 も 実 は 明 ら か で な い.そ の た め,Tyr8 が 水 素 結 合 ドナ ー で あ る コ ン フ ォ メ ー シ ョン(図5Ba)と 水 素 結 合 ア ク セ プ タ ー で あ る コ ン フ ォ メ ー シ ョ ソ(図 5Bb)の 区 別 は つ か ず,フ ラ ビ ン の 光 反 応 に よ る 水 素 結 合 構 造 の 変 化 を 解 析 す る こ と が で き な い.一 方,こ の よ う な 水 素 結 合 構 造 の 違 い は 分 子 振 動 に 鋭 敏 に 反 映 す る た め, FTIR法 を 用 い る こ と に よ り,こ れ ら の 区 別 を 容 易 に つ け る こ とが で き る.以 下 に 述 べ る,FTIR差 ス ペ ク トル 法 に よ るPixDに お け るTyr側 鎖 の 水 素 結 合 構 造 の 研 究 は,本 手 法 が 蛋 白 質 の 活 性 部 位 に お け る ア ミ ノ 酸 側 鎖 の 水 素 結 合 構 造 決 定 に 極 め て 有 効 で あ る こ と を 示 す 恰 好 の 例 で あ る. ま た,シ ス テ イ ン 側 鎖 の チ オ ー ル 基S-Hは,他 の 蛋 白 質 の バ ン ド と重 複 し な い2600-2520cm-1の 領 域 に 伸 縮 振 動 バ ン ドを 示 し,そ の 反 応 を 容 易 に 調 べ る こ と が で き る.後 に 述 べ る 研 究 例 で は,PixDの フ ラ ビ ン 近 傍 に シ ス テ イ ン 残 基 を 導 入 し,光 照 射 に よ る フ ラ ビ ン との 反 応 を 解 析 した. 3.2.1  チ ロ シ ン 側 鎖 の 水 素 結 合 構 造

PixDの 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル を 図6Aaに 示 す.負 の 強 度 を 持 つ ピ ー ク が 反 応 前 の 暗 状 態 を,正 の ピ ー ク が 光 反 応 後 の 明 状 態 を 示 す.こ の ス ペ ク トル で 最 も 顕 著 な バ ン ドは,フ ラ ビ ソ のC4=0伸 縮 振 動 に 帰 属 さ れ る1713cm-1 の ピ ー ク の15cm-1の 低 波 数 シ フ ト で あ る.こ れ は BLUFド メ イ ン を 持 つ 蛋 白 質 に 共 通 の 特 徴 で あ り,C4=O 近 傍 の 水 素 結 合 構 造 の 再 配 置 が,フ ラ ビ ン 部 位 で の 光 変 換 反 応 の 主 な メ カ ニ ズ ム で あ る こ と を 示 し て い る54). 筆 者 ら は,PixDの 光 反 応 に お け るTyr8の 相 互 作 用 変 化 を 詳 細 に 調 べ る た め,ま ず,こ の ス ペ ク トル 中 に 含 ま れ るTyr8の バ ン ド,特 に,水 酸 基 の 水 素 結 合 構 造 に 敏 感 で あ るCO伸 縮 振 動(ソCO),及 びCOH変 角 振 動(δCOH) バ ン ドを 抽 出 し た55).そ の た め,蛋 白 質 中 の チ ロ シ ン 残 基 を,4位 の 炭 素 を13Cで ラ ベ ル し た チ ロ シ ン([4-13C] Tyr:図6A挿 入 図)で 置 換 し たPixD試 料 を 作 製 し た.

[4-13C]Tyr置 換 し たPixDのFTIRス ペ ク トル(図6Ab) は,予 想 通 り,チ ロ シ ソ のvCO/δCOH(1300-1200cm-1) とvCC(∼1510cm-1)の 領 域 の み に 変 化 を 示 し た.[4-13C]Tyr置 換PixDと 未 置 換PixDの 二 重 差 ス ペ ク ト ル (図6Ac)を 計 算 す る と,Tyr以 外 の バ ン ドは す べ て キ ャ ン セ ル さ れ,目 的 の 振 動 モ ー ドの み を 抽 出 す る こ と が で き た. vCO/δCOH領 域 の ス ペ ク トル(図6B実 線)に は 暗 状 態 及 び 明 状 態 のvCOと δCOH,及 び そ れ ら の13Cシ フ ト し た も の の 計8つ の バ ン ドが 含 ま れ て い る.さ ら にD2O 中 で 同 様 な 測 定 を 行 い(図6B点 線),δCOHを こ の 領 域 か ら 除 去 し てvCOの み を 残 す こ と に よ っ て,ス ペ ク トル を よ り単 純 化 す る こ と が で き る.こ れ ら の ス ペ ク トル を Gaussianバ ン ド で フ ィ ッ テ ィ ン グ し,そ れ ぞ れ の バ ン ド

野 口:フ ー リエ 変 換 赤 外 差 スペ ク トル法:蛋 白 質の 活 性 部 位 構 造 と分 子 メカニ ズム 解 析 283

A

B C

図6 PixDの 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル

A:非 置 換PixD(a)と[4-13C]Tyr置 換PixD(b) の 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク ト ル,及 び そ れ ら の 二 重 差 ス ペ ク ト ル(c:(a-b)×2).B:二 重 差 ス ペ ク ト ル のCO伸 縮/OH変 角 振 動 領 域 の 拡 大 図.実 線:H20 中;点 線:D20中.C:野 生 型PixD(a)とI66C変 異 PixD(b)の 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク ト ル のS-H伸 縮 振 動 領 域. の 振 動 数 を 同 定 し た(表1). こ れ ら のvCO/δCOH振 動 数 か ら チ ロ シ ン の 水 素 結 合 構 造 を 決 定 す る た め,筆 者 ら は,チ ロ シ ン 側 鎖 の モ デ ル 化 合 物 で あ るp-creso1のFTIR測 定 と,p-creso1の 様 々 な 水 素 結 合 複 合 体 に つ い て の 密 度 汎 関 数 法 計 算 に よ り,チ ロ シ ン のvCO/δCOH振 動 数 と 各 水 素 結 合 構 造(水 素 結 合 ド ナ ー,ア ク セ プ タ ー,ド ナ ー ・ア ク セ プ タ ー)と の 相 関 を 求 め た22).そ の 相 関 を 解 析 基 準 と し て 用 い,PixDの Tyr8の 振 動 数 を 解 釈 す る と,暗 状 態,及 び 明 状 態 の い ず れ に お い て も,Tyr8は 水 素 結 合 ド ナ ー 構 造(図5Ba)を 持 ち,暗 状 態 か ら 明 状 態 へ の 遷 移 に 伴 い,そ の 水 素 結 合 強 度 が 増 加 す る こ と が 示 さ れ た55). BLUFド メ イ ン の 光 反 応 の 機 構 と し て,Glnの ア ミ ド基 表1  PixDの 光 反 応 に 関 与 す るTyr8の 暗 状 態 及 び 明 状 態 に お け るvCO及 び δCOH振 動 数(cm-1) が 回 転 す る こ と に よ り,Tyrは 水 素 結 合 ア ク セ プ タ ー 構 造 か ら ド ナ ー 構 造 に 変 化 し,ア ミ ドNH2が フ ラ ビ ン のC4= 0と 新 た な 水 素 結 合 を 形 成 す る(つ ま り,図5Bに お け る 構 造bか ら 構 造aへ の 変 換),と い う説 が 提 唱 さ れ て い た56).し か し,PixDのFTIR解 析 の 結 果 は,TyrのOH とGlnのC=0と の 水 素 結 合 構 造 は 保 た れ た ま ま,Glnの NH2基 の 水 素 結 合 が フ ラ ビ ン のN5か らC4=0へ と移 行 す る,と い う 光 変 換 機 構 を 意 味 し て い る.フ ラ ビ ン か ら Tyrへ と伝 達 さ れ た 水 素 結 合 ネ ッ トワ ー ク の 変 化 が 蛋 白 質 の 構 造 変 化 を 引 き 起 こ し,共 役 蛋 白 質 で あ るPixEの 脱 離 を 誘 発 し て い る と 考 え ら れ る.こ の よ う に,X線 結 晶 構 造 で は 調 べ る こ と の で き な い 蛋 白 質 活 性 部 位 に お け る ア ミ ノ 酸 側 鎖 の 水 素 結 合 構 造 や そ の 強 度 変 化 を,FTIR差 ス ペ ク トル 法 に よ っ て 明 ら か に す る こ と が で き る. 3.2.2  シ ス テ イ ン 導 入 に よ る チ オ.ル 基 の 光 反 応 の 検 出 BLUFド メ イ ン の 光 反 応 が フ ラ ビ ン 周 辺 の 水 素 結 合 ネ ッ トワ ー ク の 変 化 を 誘 発 す る の に 対 し,フ ォ ト ト ロ ピ ン な ど が 持 つLOVド メ イ ン で は,光 吸 収 に よ っ て,近 傍 に 存 在 す る シ ス テ イ ン 側 鎖 の チ オ ー ル 基 が フ ラ ビ ン のC4a炭 素 と 共 有 結 合 を 形 成 す る こ と が 知 ら れ て い る57).Iwataら58) が 測 定 し た フ ォ ト ト ロ ピ ン の 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク ト ル に は,2570cm-1付 近 に 負 のS-Hバ ン ド が 現 れ,こ れ が 光 反 応 に よ る フ ラ ビ ン ーCys結 合 の 形 成 の 確 実 な 証 拠 と な っ た. 筆 者 ら は,PixDの フ ラ ビ ン 結 合 部 位 に お い て,LOVド メ イ ン のCys残 基 と 同 等 な 位 置 関 係 に あ るIle66残 基 を Cysに 改 変 す る こ と に よ り,LOVと 同 様 な 光 反 応 が 起 こ る か ど う か を,FTIR差 ス ペ ク トル 法 を 用 い て 調 べ た59). そ の 結 果,LOVと 同 様 なSH基 の 負 の バ ン ド が2554 cm-1に 現 れ た(図6C).他 の モ ー ドの 倍 音,及 び 結 合 音 の 可 能 性 を 排 除 す る た め,D20中 で の 測 定 に よ っ て,SD 伸 縮 振 動 が1857cm-1に 現 れ る こ と を 確 か め た.1800-1000cm-1に 現 れ る フ ラ ビ ン の バ ン ド も,本 来 のTePixD の も の と は 著 し く異 な っ て お り,逆 にLOVの も の と似 通 っ て い た.こ れ ら の 結 果 か ら,BLUFド メ イ ン の ア ミ ノ 酸 残 基 を 改 変 す る こ と に よ り,LOVド メ イ ン に 特 有 な 光

反 応 で あ る フ ラ ビ ン ーCys結 合 の 形 成 を 再 現 で き る こ と が 示 さ れ た.こ の こ とは,フ ラ ビ ン を 持 つ 青 色 光 受 容 蛋 白 質 の 反 応 形 式 は,蛋 白 質 の ド メ イ ン 構 造 に よ っ て 決 ま る の で は な く,む し ろ,フ ラ ビ ン 近 傍 に 存 在 し,反 応 の 鍵 と な る ア ミ ノ 酸 側 鎖 の 配 置 と相 互 作 用 に よ っ て 決 定 さ れ る こ と を 示 し て い る.こ の 結 果 は,天 然 の 蛋 白 質 ド メ イ ン を 利 用 し て 新 規 な 機 能 を 持 つ 蛋 白 質 を 創 成 す る た め の 蛋 白 質 工 学 に お い て,重 要 な 知 見 を 与 え る も の で あ る. 3.3  二 ト リ ル ヒ ドラ タ-ゼ:一 酸 化 窒 素 と 光 に よ る 反 応 制 御 機 構 ニ ト リル ヒ ド ラ タ ー ゼ(NHase)は,Rhodococcusな ど の 細 菌 が 持 つ,ニ ト リ ル か ら ア ミ ドを 合 成 す る 酵 素 で あ る60,61).本 酵 素 は ア ク リ ル ア ミ ド化 合 物 の 合 成 に 工 業 的 に 利 用 さ れ て お り,そ の 年 間 生 産 量 は6000ト ン を 越 え る61).反 応 は ニ ト リル へ の 水 分 子 の 付 加 反 応 で 表 わ さ れ る. R-CN+H20→R-CONH2 NHaseに は 活 性 中 心 に 非 へ ム 鉄(Fe3+)持 つ も の と, Fe3+の 代 わ り にCo3+を 持 つ も の と が あ り,い ず れ も 一 次 配 列 の 相 同 性 は 高 い.Fe3+結 合 型NHaseは,暗 中 に お い て は 不 活 性 型 で あ り,光 照 射 に よ っ て 活 性 型 に 変 換 す る,と い う光 活 性 化 現 象 を 示 す こ とが 知 ら れ て い た が,そ の メ カ ニ ズ ム は 全 く不 明 で あ っ た.筆 者 ら はX線 結 晶 構 造 の 解 明 に 先 駆 け てFTIR差 ス ペ ク トル 法 に よ る 解 析 を 行 い,光 活 性 化 反 応 の 鍵 と な る コ フ ァ ク タ ー と し て 一 酸 化 窒 素(NO)の 存 在 を 明 ら か に し た13).こ の 研 究 は,振 動 分 光 法 に よ る コ フ ァ ク タ ー の 同 定 に よ っ て,X線 結 晶 解 析 に お け る 電 子 密 度 の 解 釈 が 可 能 に な っ た 典 型 的 な 例 とい え る. 3.3.1  非 ヘ ム 鉄 に 結 合 す るNOの 発 見 と 光 活 性 化 機 構 図7AにFe3+結 合 型NHaseの 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル を 示 す13).通 常,蛋 白 質 や 有 機 化 合 物 のFTIRス ペ ク トル で は,1800cm-1か ら シ ス テ イ ン のS-H伸 縮 が 現 れ る ∼2550cm-1ま で の 領 域 に は 基 本 音 の バ ン ド は 現 れ な い.し か し,NHaseのFTIRス ペ ク ト ル に は,1855 cm-1に,倍 音 や 結 合 音 と は 考 え ら れ な い 程,強 度 の 大 き な 負 の バ ン ドが 観 測 さ れ た.基 質 と な る ニ ト リル 化 合 物 の ア ナ ロ グ で あ る シ ア ン 化 物 イ オ ン のCN伸 縮 振 動(2200-2000cm-1)と は 振 動 数 が 大 き く異 な っ て お り,NOや COな ど の 分 子 がFe3+の 配 位 子 と し て 結 合 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た.そ こ で,15Nで 蛋 白 質 全 体 を ラ ベ ル し た NHaseに つ い て 同 様 な 測 定 を 行 っ た と こ ろ,こ の ピ ー ク は35cm-1の 低 波 数 シ フ トを 示 し た(図7B).こ の シ フ ト 値 は,計 算 に よ るNOの15N置 換 に よ る予 想 シ フ ト値 と一 致 し て い た.こ う し て,NHaseの 暗 中 不 活 性 型 に は 一 酸 化 窒 素NOが 結 合 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た13).さ ら に,単 離 し た 蛋 白 質 で は,一 度 光 活 性 化 し た 後 は,再 び A 図7 NHaseの 光 誘 起FTIR差 ス ペ ク トル A:2000-900cm.1領 域.B:NO伸 縮 振 動 領 域. 実 線:非 置 換 体;点 線:15N置 換 体.C:SO伸 縮 振 動 領 域.実 線:非 置 換 体;点 線:34S置 換 体. 不 活 性 型 に 戻 る こ とは で き な い が(細 胞 中 で は 可 能), NOガ ス を添 加 す る こ とに よ り不 活 性 型 に戻 る こ とが示 さ れ,NOの 光 解 離 が 光 活 性 化 の メ カニ ズ ム で あ る こ とが判 明 した(図8A)62,63).尚,1869cm-1の 小 さな正 のバ ン ド は,光 解 離 の 際 に 一部 のNOが 蛋 白質 ポ ケ ッ トに 残 っ て しま った もの で あ り62),ま た,1847cm-1の 肩 は,熱 平 衡 に あ る 不 活 性 型 の 別 の コ ン フ ォ メ ー シ ョン に 由来 す る こ と64)がわ か って い る. FTIRに よ りNOの 存 在 が 明 ら か に な っ た 数 年 後 に, NHaseのX線 結 晶 解 析 の 結 果 が 報 告 さ れ た65).予 想 通 り,不 活 性 状 態 に お い て鉄 原 子 の 上 部 に2原 子 分 子 由 来 と考 え られ る電 子 密 度 が存 在 して お り,NOが 鉄 に 結 合 し て い る こ とが確 認 さ れ た(図8B).NOが 光 解 離 す る こ と に よ り,基 質 が鉄 中 心 に結 合 で き る空 間 がで き,酵 素 活 性 が 現 れ る と考 え られ る.筆 者 ら がNHaseに 結 合 す るNO を 発 見 した1995年 頃 は さな が らNOブ ー ム で あ り,NOが 様 々な 生 物 種 に 存在 し,血 管 拡 張 や 神 経 伝 達 な どの シ グ ナ ル として 広 く利 用 さ れ て い る こ とが 明 らか に な って きた 時 期 で あ っ た.ま た,in Ｖitro系に お け るへ ム 蛋 白 質 のNO の 光 解 離 現 象 な どは よ く知 られ て い る.し か し,細 胞 内 に

お い てNOの 光 解 離 に よ っ て 実 際 に 活 性 制 御 を 行 う蛋 白 質 の 存 在 は,未 だFe3+結 合 型NHase以 外 に は 見 つ か っ て お らず,極 め て 特 異 な 生 体 制 御 機 構 で あ る と言 え る.

野 口:フ ー リエ変 換赤 外 差 ス ペ ク トル 法:蛋 白質 の活 性 部 位 構 造 と分 子 メ カ ニズ ム 解 析 285

A

B

図8 NHaseの 光 活 性 化 メ カニ ズ ム(A)と 不 活 性 型NHase の 非 へ ム 鉄 中 心 のX線 結 晶 構 造(PDBentry 2AHJ)65)(B)

光 吸 収 に よ りNOが 非 へ ム 鉄 よ り解 離 し,活 性 型 とな る.細 胞 中 で はNO合 成 酵 素(NOS)に よ りNO が 供 給 さ れ,再 び不 活 性 型 に戻 る.単 離 蛋 白質 で は, 光 活 性 化 は 不 可 逆 で あ る が,NOの 添 加 に よ り不 活 性 型 に戻 る. NHaseの 光 活 性 化 機 構 の解 明 は,FTIR法 が 蛋 白質 の 反 応 機 構 研 究 に極 め て有 効 で あ る こ とを示 して い る. 3.3.2  シ ス テ イ ン修 飾 ア ミノ酸 の プ ロ トン化構 造 NHaseが 変 わ り種 の 蛋 白 質 で あ る こ とは,NOの 結 合 に限 らな い.鉄 中心 の配 位 子 と して,シ ス テ イン の 修 飾 ア ミ ノ酸 で あ る シ ス テ イ ン ス ル フ ィン 酸(Cys-SO2H)及 び シ ス テ イン ス ル フ ェン 酸(Cys-SOH)が 結 合 して い る. これ らの 修 飾 ア ミ ノ酸 の 存 在 は質 量 分 析 に よ っ て 示 唆 さ れ,結 晶 構 造 で 確 認 さ れ た(図8B)65).た だ,こ れ らの 手法 で 明 らか とな らな いの は,実 際 の 活 性 部 位 に お い て こ れ らの ア ミノ酸 が プ ロ トン 化 して い るの か,そ れ と も脱 プ ロ トン化 して い る の か とい う点 で あ る.こ れ らの 修 飾 ア ミ ノ酸 が ア ミ ド合 成 機 構 に直 接 的 に関 与 して い る こ とが示 唆 され て お り,そ の プ ロ トン 化 構 造 を 明 らか にす る こ とは, メカ ニ ズ ム解 明 に とっ て不 可 欠 で あ る.プ ロ トン 化 構 造 は 振 動 ス ペ ク トル に鋭 敏 に反 映 す る た め,こ の 問題 をFTIR ス ペ ク トル の解 析 に よ り解 決 す る こ とが で き る. シ ス テ イソ ス ル フ ィン 酸(Cys-SOOH)及 び シ ス テ イ ン ス ル フ ェン酸 の バ ン ドを 同定 す るた め,34Sで ラベ ル し たNHaseを 調 製 し,そ のFTIR差 ス ペ ク トル を 測 定 した (図7C)16).34S置 換 に よ り,1150-1120cm-1と1040-1010cm-1に 現 れ る強 度 の 強 い バ ン ド,及 び910cm-1付 近 の比 較 的 弱 いバ ン ドが低 波 数 シ フ トを す る こ とが示 さ れ た.D20中 に お い て もバ ン ドが 保 持 され る とい う実 験 結 果 とモ デ ル 化 合 物 の 密 度 汎 関 数 法 計 算 とか ら,強 い1140 cm-1及 び1030cm-1付 近 の バ ン ドは そ れ ぞ れCys-S0-2 の逆 対 称 伸 縮 と対 称 伸 縮 振 動 に,ま た,後 者 の910cm-1 付 近 の バ ン ドはCys-SO-のSO伸 縮 振 動 に帰 属 され た. この よ うに,FTIR法 に よ って,こ れ らの シ ス テ イ ン修 飾 ア ミノ酸 が脱 プ ロ トン 化 した 状 態 で 存在 して い る こ とが示 さ れ た. 4.  お わ り に 上 の応 用 例 で述 べ た よ うに,FTIR差 ス ペ ク トル に は蛋 白質 の 構 造 ・反 応 に関 す る様 々な 情報 が含 ま れ て い る.酵 素 反 応 の分 子 メ カ ニ ズ ム を理 解 す るた め には,FTIR法 を 含 め た 振 動 分 光 法 に よ る解 析 が 必 須 で あ る.今 後,X線 結 晶解 析 に よ って 大 ま か な 位 置情 報 を取 得 した後,振 動 分 光 法 に よ り,よ り正 確 な 化 学 結 合 ・相 互 作 用 情 報 を 獲 得 し,さ らに酵 素 反 応 の 現 場 を 追跡 す る,と い っ た研 究 手 法 が 「構 造 生 物 学 」 に お け る生命 機 構 研 究 の オ ー ソ ド ック ス な 流 れ に な る と思 わ れ る.ま た,NHaseの 例 で 見 た よ う に,蛋 白質 に含 ま れ る コフ ァク タ ー の種 類 や 反 応 中間 体 の 構 造 を 振 動 分 光 法 で あ らか じ め 調 べ て お く こ とは,X線 結 晶 解 析 の 電 子 密 度 の正 しい帰 属 に有 効 で あ る. 一 方_{,FTIR差 スペ ク トル 法 が,よ り広 く,一 般 的 に利} 用 され る よ うに な る た め に は,い くつ かの 問 題 点 を克 服 す る必 要 が あ る よ うに 思 う.ま ず第 一 に,如 何 に活 性 部 位 の FTIRス ペ ク トル を 得 る か とい う問 題 で あ る.FTIR差 ス ペ ク トル を測 定 す る た め に は,反 応,基 質 の 結 合 等 に よ り 蛋 白質 に何 らか の変 化 を誘 起 させ る必 要 が あ る.様 々な 光 応 答 性 蛋 白 質 がFTIR解 析 の 対 象 とな り,精 密 な 解 析 が な され て い る理 由は こ こに あ る.ATR法 に よ る緩 衝 液 交 換 に よっ て,光 に も電 位 シ フ トに も応 答 しな い 蛋 白質 の反 応 を 調 べ る こ とが で き る が8,66),未 だ 応 用 例 は 多 くは な く,さ らな る方 法 論 の確 立 とよ り多 くの 蛋 白質 へ の 応用 が 望 ま れ る. 第 二 に,得 られ たFTIRス ペ ク トル か ら,構 造 ・反 応 に 関 す る正 しい知 見 を導 き 出す た め の 解 析 基 準 の 問題 で あ る.振 動 スペ ク トル の解 析 は,ス ペ ク トル を プ ロ グ ラ ム に の せ れ ば 自動 的 に構 造 が 出て くる,と い った類 の もの で は な い.個 々 の振 動 モ ー ドには,そ れ ぞ れ の個 性 が あ り,他

の モ ー ドとの カ ップ リン グな どに よ って 複 雑 な 挙動 を示 す 場 合 が あ る.同 位 体 置 換 な どを用 い て 正 し くバ ン ドを 帰属 し,そ の振 動 モ ー ド と分 子 構 造 ・相 互 作 用 との 相 関 を よ く 理 解 しな け れ ば,正 しい情 報 を得 る こ とは で きな い.そ の よ うな解 析 基 準 の作 成 プ ロ セ ス に とって の 明 るい材 料 は, 近 年 の密 度 汎 関数 法 な どの量 子 化 学 計 算 の 発 展 で あ る.あ る程 度 の大 きさ の分 子 な らば,水 素 結 合 を 形 成 す る複 合体 に つ い て も,か な り正 確 に基 準 振 動 モ ー ドの 挙動 を再 現 す る こ とが で き る22,23).今後,FTIR差 ス ペ ク トル 法 を含 め た 振 動 分 光 法 が,構 造 生 物 学 の 中 でX線 結 晶解 析 と真 に 相 補 的 な位 置 関係 を 占 め る た め に は,量 子 化 学 計 算 を駆 使 した 解 析法 を よ り体 系 化 し,明 確 な解 析 基 準 を確 立 して い く必 要 が あ るだ ろ う. 参 考 文 献 1) 吉川信也: 生物物理45, 63 (2005).

2) D. M. Byler and H. Susi: Biopolymers 25, 469 (1986). 3) R. Vogel and F. Siebert: Biopolymers 72, 133 (2003). 4) W. Mantele: Anoxygenic Photosynthetic Bacteria, eds. R. E.

Blankenship, M. T. Madigan and C. E. Bauer (Kluwer Aca-demic Publishers, Dordrecht, 1995) p. 627.

5) T. Noguchi and C. Berthomieu: Photosystem II: The Light-Driven Water: Plastoquinone Oxidoreductase, eds. T. Wydrzynski and K. Satoh (Springer, Dordrecht, The Netherlands, 2005) p. 367.

6) W. Mantele: Trends Biochem. Sci. 18, 197 (1993). 7) R. Vogel and F. Siebert: Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 518

(2000).

8) C. Zscherp and A. Barth: Biochemistry 40, 1875 (2001). 9) T. Noguchi: Photosynth. Res. 91, 59 (2007).

10) T. Noguchi and M. Sugiura: Biochemistry 41, 2322 (2002). 11) T. Okubo and T. Noguchi: Spectrochim. Acta A 66, 863

(2007).

12) G. Socrates: Infrared characteristic group frequencies (John Wiley & Sons, Chichester, 1994).

13) T. Noguchi, J. Honda, T. Nagamune, H. Sasabe, Y. Inoue, and I. Endo: FEBS Lett. 358, 9 (1995).

14) T. Noguchi and M. Sugiura: Biochemistry 42, 6035 (2003). 15) Y. Kimura, N. Mizusawa, A. Ishii, T. Yamanari, and T. Ono:

Biochemistry 42, 13170 (2003).

16) T. Noguchi, M. Nojiri, K. Takei, M. Odaka, and N. Kamiya: Biochemistry 42, 11642 (2003).

17) T. Noguchi, Y. Inoue, and X.-S. Tang: Biochemistry 38, 10187 (1999).

18) Y. Kimura, N. Mizusawa, A. Ishii, and T. Ono: Biochemistry 44, 16072 (2005).

19) T. Noguchi, Y. Inoue, and X.-S. Tang: Biochemistry 36, 14705 (1997).

20) R. J. Debus: Coord. Chem. Rev. 252, 244 (2008).

21) K. Hasegawa, T. Ono, and T. Noguchi: J. Phys. Chem. B 104, 4253 (2000).

22) R. Takahashi and T. Noguchi: J. Phys. Chem. B 111, 13833 (2007).

23) K. Takei, R. Takahashi, and T. Noguchi: J. Phys. Chem. B 112, 6725 (2008).

24) T. Noguchi, T. Ono, and Y. Inoue: Biochemistry 31, 5953

(1992).

25) T. Noguchi and M. Sugiura: Biochemistry 40, 1497 (2001). 26) W. Hillier and G. T. Babcock: Biochemistry 40, 1503

(2001).

27) H.-A. Chu, W. Hillier, N. A. Law, and G. T. Babcock: Biochim. Biophys. Acta 1503, 69 (2001).

28) T. Noguchi: Coord. Chem. Rev. 252, 336 (2008). 29) T. Noguchi: Phil. Trans. R. Soc. B 363, 1189 (2008). 30) K. N. Ferreira, T. M. Iverson, K. Maghlaoui, J. Barber, and

S. Iwata: Science 19, 1831 (2004).

31) B. Loll, J. Kern, W. Saenger, A. Zouni, and J. Biesiadka: Nature 438, 1040 (2005).

32) H. Kandori: Biochim. Biophys. Acta 1460, 177 (2000).

33) 前 田 章 夫, 神 山 勉: 蛋 白 質 ・核 酸 ・酵 素52, 1314 (2007).

34) Photosystem II: The Light-Driven Water: Plastoquinone Ox-idoreductase, eds. T. Wydrzynski and K. Satoh (Springer, Dordrecht, The Netherlands, 2005).

35) J. Yano, J. Kern, K. D. Irrgang, M. J. Latimer, U. Ber-gmann, P. Glatzel, Y. Pushkar, J. Biesiadka, B. Loll, K. Sauer, J. Messinger, A. Zouni, and V. K. Yachandra: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 12047 (2005).

36) M. Grabolle, M. Haumann, C. Muller, P. Liebisch, and H. Dau: J. Biol. Chem. 281, 4580 (2006).

37) R. J. Debus: Biochim. Biophys. Acta 1102, 269 (1992). 38) W. Hillier and J. Messinger: Photosystem II: The

Light-Driven Water: Plastoquinone Oxidoreductase, eds. T. Wydrzynski and K. Satoh (Springer, Dordrecht, The Netherlands, 2005) p. 567.

39) T. Noguchi, T. Ono, and Y. Inoue: Biochim. Biophys. Acta 1232, 59 (1995).

40) Y. Taguchi and T. Noguchi: Biochim. Biophys. Acta 1767, 535 (2007).

41) H. Suzuki, Y. Taguchi, M. Sugiura, A. Boussac, and T. Noguchi: Biochemistry 45, 13454 (2006).

42) J. J. S. Van Rensen, and V. V. Klimov: Photosystem II: The Light-Driven Water: Plastoquinone Oxidoreductase, eds. T. Wydrzynski and K. Satoh (Springer, Dordrecht, The Netherlands, 2005). p. 329.

43) C. Aoyama, H. Suzuki, M. Sugiura, and T. Noguchi: Bioche-mistry 47, 2760 (2008).

44) T. Noguchi and M. Sugiura: Biochemistry 41, 15706 (2002). 45) G. Zundel: J. Mol. Struct. 177, 43 (1988).

46) T. Noguchi and M. Sugiura: Biochemistry 39, 10943 (2000). 47) H. Suzuki, M. Sugiura, and T. Noguchi: Biochemistry 47,

11024-11030 (2008).

48) H. Suzuki, M. Sugiura, and T. Noguchi: Biochemistry 44, 1708 (2005).

49) M. A. Van der Horst and K. J. Hellingwerf: Acc. Chem. Res. 37, 13 (2004).

50) K. Okajima, S. Yoshihara, Y. Fukushima, X. Geng, M. Katayama, S. Higashi, M. Watanabe, S. Sato, S. Tabata, Y. Shibata, S. Itoh, and M. Ikeuchi: J. Biochem. 137, 741

(2005).

51) A. Kita, K. Okajima, Y. Morimoto, M. Ikeuchi, and K. Miki: J. Mol. Biol. 349, 1 (2005).

52) K. Okajima, Y. Fukushima, H. Suzuki, A. Kita, Y. Ochiai, M. Katayama, Y. Shibata, K. Miki, T. Noguchi, S. Itoh, and M. Ikeuchi: J. Mol. Biol. 363, 10 (2006).

口: フ ー リエ 変 換 赤 外 差 スペ ク トル法: 蛋 白質 の 活 性 部 位 構 造 と分子 メカ ニ ズ ム解 析 287

53) M. Gauden, I. H. M. van Stokkum, J. M. Key, D. C. Luhrs, R. van Grondelle, P. Hegemann, and J. T. M. Kennis: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10895 (2006).

54) S. Masuda, K. Hasegawa, A. Ishii, and T. Ono: Biochemistry 43, 5304 (2004).

55) R. Takahashi, K. Okajima, H. Suzuki, H. Nakamura, M. Ikeuchi, and T. Noguchi: Biochemistry 46, 6459 (2007). 56) S. Anderson, V. Dragnea, S. Masuda, J. Ybe, K. Moffat, and

C. Bauer: Biochemistry 44, 7998 (2005).

57) D. Matsuoka, T. Iwata, K. Zikihara, H. Kandori, and S. Tokutomi: Photochem. Photobiol. 83, 122 (2007).

58) T. Iwata, S. Tokutomi, and H. Kandori: J. Am. Chem. Soc. 124, 11840 (2002).

59) H. Suzuki, K. Okajima, M. Ikeuchi, and T. Noguchi: J. Am. Chem. Soc. 130, 12884-12885 (2008).

60) M. Kobayashi and S. Shimizu: Nature Biotechnol. 16, 733 (1998).

61) M. Kobayashi, T. Nagasawa, and H. Yamada: Trends Biotechnol. 10, 402 (1992).

62) T. Noguchi, M. Hoshino, M. Tsujimura, M. Odaka, Y. In-oue, and I. Endo: Biochemistry 35, 16777 (1996).

63) M. Odaka, K. Fujii, M. Hoshino, T. Noguchi, M. Tsujimura, S. Nagashima, M. Yohda, T. Nagamune, Y. Inoue, and I. Endo: J. Am. Chem. Soc. 119, 3785 (1997).

64) H. Suzuki, M. Nojiri, N. Kamiya, and T. Noguchi: J. Biochem. 136, 115 (2004).

65) S. Nagashima, M. Nakasako, N. Dohmae, M. Tsujimura, K. Tokio, M. Odaka, M. Yohda, N. Kamiya, and I. Endo: Na-ture Struct. Biol. 5, 347 (1998).

66) P. R. Rich and M. Iwaki: Mol. Biosys. 3, 398 (2007).

PROFILE 野 口 巧 筑 波 大 学 大 学 院 数理 物 質 科 学 研究 科 准教 授 理 学 博 士 [略 歴] 1991年 東 京 大 学 大 学 院 理学 系 研 究 科 博士 課 程 化 学専 攻 修 了, 1991年 理 化 学 研 究 所 研 究 員, 2001年 筑 波 大 学 助 教 授, 2007年 同 准教 授,[専 門] 生 体 系 の 分 子 分 光 学, 光 合成 の 生物 物 理 学 http://www.ims.tsukuba.ac.jp/noguchUab/home.html