生殖機構と生体リズム機構の共役に関する基礎的研究

December 1991

_{Jpn J Anim Reprod Vol 37 (5)}

SHIMAMURA

AWARD

LECTURE

FOR 1991—

Studies

on Relationship

of Biological

Rhythms

to Reproductive

Functions

in Animals

Noboru MURAKAMI

Department of Veterinary Physiology, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, Miyazaki 889-21

Summary. Biochemical, neural, endocrine and behavioral rhythms play a central role in many different aspects of the reproductive process in animals. These rhythms provide the basis for temporal organization of the reproductive functions of individual animals. In this paper, I introduce our results about the relationship of biological clock to reproductive function, analysis of mechanisms in biological clock, and manipulation of circadian rhythms. Main contents are as follows:

1) The ovulation is induced between 14 and 16 hr after stimulation dissociating entirely with solar

hours in light estrous rat. The effectiveness of the cervical stimulation for induction of ovulation in

light estrous rats is related to not only the duration of light estrus but also the time after transfer to

LL. 2) Both nocturnal and diurnal prolactin surges are controlled

by a circadian system. 3)

Pseudopregnancy

is induced by a single injection of progesterone

at a special time. 4) The time of

parturition

and of pre-partum

progesterone

decrease is closely associated with an endogenous

circadian system. 5) Food restriction is more potent zeitgaber than light in circadian adrenocortical

rhythms. 6) The circadian rhythms of blinded rat pups is entrained by the nursing dam. 7) Social

cues have a profound effect on the synchronization

of the free-running

period of adrenocortical

rhythm. 8) Carbachol, an acetylcholine agonist, shortens the free-running period of circadian activity

rhythm. 9) Melatonin accelerates the re-entrainment

of the circadian rhythm to shifted LD cycle. 10)

Light signals increase the acetylcholine concentration in suprachiasmatic nucleus, but not the other

control site. 11) The cAMP levels in rat suprachiasmatic

nucleus show an endogenous circadian

rhythm. 12) Long term cultured neuron from rat suprachiasmatic

nucleus retain the capacity for

circadian oscillation of vasopressin release. 13) Inhibitors of protein

synthesis phase shift the

circadian clock in chick pineal cells.

KEY WORDS: CIRCADIAN RHYTHM, OVULATION, PSEUDOPREGNANCY, PARTURITION, SUPRACHIASMATIC NUCLEUS, PINEAL

Jpn J Anim Reprod

37, 1P-11P, 1991

1991年度島村賞受賞講演論文

生殖機構 と生体 リズム機構の共役 に関する基礎的研究

村 上

昇

宮 崎 大 学 農 学 部 獣 医 学 科 家 畜 生 理 学 講 座 〒889-21宮 崎 市 学 園 木花 台西1-1

は じめ に

あ ら ゆ る生 物 に は 自己 固有 の計 時機構(い わ ゆ る生 物 時 計)が 備 わ っ て い る.こ れ は 生物 が進 化 の 過 程 で 地 球 の 自転 や 公 転 に伴 う外 部 環 境 の周 期 的現 象 に 適 応 し,生 体 機 構 の 恒 常 性 を維 持 す る た め に獲 得 した 防御 機 構 の 一 つ と考 え ら れ る.時 計 の局 在 部 位 は動 物 種 に よ って異 な るが,軟 体 動 物 の 目,は 虫 類 や鳥 類 の松 果 体,お よび ほ 乳 類 で の 視 交 叉 上 核 が 挙 げ られ る.こ れ らの 時計 は通 常, 外 部 環 境 の 周 期 的 変 動 に 同調 して種 々 の生 理 機 能 の 日内 リズ ムや 年 内 リズ ム を駆 動 して い る.こ の 中 に は生 化 学 的,内 分 泌 学 的,神 経 学 的 そ して行 動 学 的 に様 々 な リズ ム が 認 め られ,そ の一 部 は生 殖 機 構 と強 く連 結 し,個 々 の 動 物 の 性 周 期 や繁 殖 周 期 な どを支 配 して い る.こ の た め,生 殖 機 構 を理 解 す る上 で,一 日を単 位 と した,ま た 一 年 を単 位 とす る時 間軸 を取 り入 れ た機構 解 析 が必 要 に な る.一 方 で は,生 物 時 計 の人 為 的操 作 で リズ ム を変 化 させ る こ と に よ り生 殖 機 構 な ど を調 節 で きる可 能性 が存 在 す る.本 研 究 は こ の様 な観 点 か らラ ッ トを用 い て そ の 生 殖 内 分 泌 機構 を,最 も基 礎 とな る概 日 リズ ム機構 の面 か ら解 析 す る と 同時 に計 時 機構 の基 礎 解 析 か らそ の応 用 へ と発 展 させ る こ と を 目 的 と して来 た もの で,こ れ まで に得 た著 者 らの 知 見 を紹 介 した い.

ラ ッ トの 生 殖 機 構 と概 日 リズ ム機 構 との共 役

a)性 周 期 お よ び排 卵 機 構 と概 日リ ズ ム との共 役 通 常,24時 間 の 規 則 正 しい 明暗 交 代 条 件 下 で は ラ ッ ト は4日 また は5日 の 規 則 正 しい性 周 期 を繰 り返 す.こ れ は24時 間 周 期 の 明 暗 条 件 に 日内 リズ ムが 同調 して い る た め で,排 卵 前LHサ ー ジ とそ れ に続 く排 卵 は極 め て 限局 した 時 間 帯 に 起 こ る.し か し明 暗 交 代 の な い連 続 照 明 下 へ 移 す と,リ ズムの周期 は24時 間 よ り著 しく長 くな り, 行 動 な どの リズ ム は 不 明 瞭 に な る.こ の 様 な過 程 で,規 則 的 な性 周期 は 乱 れ,つ い に は連 続 発 情 と な る.そ の 結 果 自然 排 卵 は停 止 し,そ の か わ りに 兎 や 猫 に見 られ る交 尾 排 卵 機構 が 具 備 さ れ る.Fig.1は こ の よ うな 連 続 発 情 ラ ッ トの交 尾 刺 激 とそ れ に 伴 う排 卵 の 時 間 的 関 係 を示 し た もの で あ る.一 日の どの 時 刻 に 交 尾 刺 激 を加 えて も刺 み 激 す る 時刻 に 関係 な く刺 激14-16時 間 後 に一 様 に排 卵 す る こ とが判 明 した.さ らに,子 宮 頸 部刺 激 後 の 種 々 の 時 間 にLH-RH抗 血 清 の投 与 に よ る排 卵 阻止 実 験 を行 った 結 果,こ の交 尾 排 卵 は,刺 激後 か な り早 期 に神 経 反 射 的 にLH-RHの 放 出 を 招 い て 起 こ る も の と推 察 さ れ た (Table1).次 に,こ の よ う な 自然 排 卵 機 構 か ら交 尾 排

Table 1. The incidence of ovulation after a single injection of

1 ml of anti-LHRI-1 or anti-BSA at various time after cervical stimulation in the light estrous rats

Fig. 1. Incidence of ovulation after cervical stimulation

in light-estrous rats. The stimulation was applied at arbitrary solar hr (0 hr) to a group of animals having

14 to 16 days of continuous vaginal estrus. Each circle

represents an animal tested.

Fig. 2. Effectiveness of cervical stimulation for induction of

ovulation in light estrous rats. Ovulated (open circle) and not ovulated rats (closed circle) were plotted according to their career prior to the test. Line A represents the time of establishment of light estrus, so that duration of continuous estrus of each rat is induced by a distance (b) between line A and each circle. The area enclosed by lines A, B and the abscissa indicates the condition where light estrous rat did not

卵 機 構 へ の 移 行 が どの よ う に して 起 こ る のか を調 べ た も の がFig.2で あ る.そ の 結 果,連 続 発 情 日数 が 少 な く て も長 期 間 連 続 照 明 下 にい た場 合 や,連 続 照 明 下 日数 が 少 な くて も連 続 発 情 日数 が 長 い場 合 に こ の交 尾 排 卵 機構 が 獲 得 さ れ る こ と が 判 明 し た(Murakami et al.,1978). 性 周 期 の 回 帰 は こ の 様 に 光 に 同 調 し た 計 時 機 構 と性 中 枢 な ど の 上 位 中 枢 の カ ッ プ リ ン グ に よ り起 こ る も の で あ る が,生 体 か ら 切 り放 し た 卵 巣 で も黄 体 の 下 垂 体 性 刺 激 ホ ル モ ン に 対 す る 性 周 期 依 存 性 変 化 が 存 在 す る (Murakami et al.,1982; Takahashi and Murakami

1982)こ とか ら,(光)一 時 計一 視 床 下 部 一 下 垂 体 一 卵 巣 軸 の ダ イナ ミ ック な統 制 機構 に よ り制 御 さ れ て い る と 言 え る. b)黄 体 相 と概 日リ ズ ム と の共 役 ラ ッ トは交 尾 刺 激 に よ り偽 妊 娠 あ る い は妊 娠 が 誘 起 さ れ2-3週 間 の 黄 体 相 が 成 立 す る.こ の 間黄 体 か ら旺 盛 なprogesteroneの 分 泌 が 起 こ るが,こ の分 泌 を刺 激 して い る もの は下 垂 体 か ら分 泌 され る プ ロ ラ クチ ン(PRL) で あ る.こ のPRLの 分 泌 パ タ ー ン は非 常 に 特 徴 的 で, 性 周 期 中 に は見 られ な い一 日2回 の サ ー ジ を形 成 す る. そ して こ の2回 のサ ー ジ いず れ もが毎 日の 明 暗 条件 に依 存 して い る.例 え ば,Fig.3に 異 な った 明 暗 条 件 下 で の PRLサ ー ジ を示 す.明 暗 条 件 が 異 な って も常 に暗 期 後 半 と明期 後 半 の2回,即 ち 明暗 条 件 に 同調 して 出現 して お り,こ のPRLサ ー ジ は 光 を同 調 因子 と した 概 日 リズ ム 機構 に 強 く共 役 して い る と言 え る(Murakami et al, 1986).ま た,こ の 黄 体 相 の 成 立(PRLサ ー ジ の 形 成) や 黄 体 相 の 維 持(PRLサ ー ジ の 維 持)機 構 に は 末 梢 血 中 のprogesteroneの 上 位 中 枢 へ の フ ィ ー ドバ ッ ク 情 報 が 密 接 に 関 係 し,そ の 情 報 伝 達 と 反 応 に も 概 日 リ ズ ム 機 構 と の 共 役 が 推 察 さ れ て い る(Murakami et al.,1979; Takahashi et al.,1980). ラ ッ ト黄 体 相 の 成 立 は 交 尾 刺 激 の み で な く発 情 期 に 大 量 のprogesteroneの 単 一 投 与 で も起こ す こ と が 出 来 る. Table2は そ の 効 果 と 時 間 の 関 係 を 示 す が,5時 点 灯19 時 消 灯 の 明 暗 条 件 下 飼 育 で はprogesteroneを 発 情 期 の 午 前7-8時 に 投 与 す る と 最 も 効 率 良 く偽 妊 娠 が 誘 起 で き る(Murakamietal.,1980).こ のprogesterone投 与 に よ る偽 妊 娠 成 立 はprogesterone投 与 直 後 の 一 過 的 な PRLの 分 泌 とそ の 後 形 成 さ れ るPRLサ ー ジ に よ る もの と 推 測 され る(Murakami et al.,1980).す な わ ち,以 上 の結 果 は ラ ッ ト黄 体 相 の成 立 機構 お よ び維 持 機 構 に 時 間軸 を基 礎 と した上 位 中枢 の概 日 リズ ム機 構 が 関与 して い る こ と を意 味 して い る.

Fig. 3. Effect of photo period on the

secre-tion of prolactin levels in the pseudopreg-nant rats. Samples were obtained by de-capitation (A) or tail tip incision method (B, C). Lighting regimen is 14L: 10D (A, B: lights on 0500-1900, C: lights on 1700-0700)

Table 2. Effect of a single injection of progesterone on the

c)分 娩 と概 日 リズ ムの 共 役 Fig.4はSprague-Dawley(SD)ラ ッ ト及 びWistar ラ ッ トの 分 娩 時 刻 と明 暗 条 件 の 関係 を調 べ た もの で あ る, SDラ ッ トの 分 娩 は5時 点 灯19時 消 灯 の 明 暗 条 件 下 で は 妊 娠22日(精 子 確 認 を1日 と して)の 明期 に起 こ っ た. 妊 娠6日 以 後 に明 暗 条 件 を変 化 した状 態 に置 く と,分 娩 時 刻 は移 動 し,新 た な明 期 に起 こ っ た.す な わ ち,分 娩 が 単 に受 精 卵 の 着 床 か ら の 日数 に よ っ て決 ま る の で は な く光 条 件 を 同調 因子 とす る概 日 リズ ム機 構 の支 配 下 に も あ る こ とが 判 る(Murakami et al.,1987).こ の こ とは 恒 常 暗 下 に置 い た時,日 内 リズ ム が 自由継 続 し,個 々 の ラ ッ トの 周 期 の違 い か ら分 娩 時刻 に 違 い が 出 る こ と,ま たFig.5に 示 す 様 に 生 物 時 計 の 局 在 部 位 で あ る 視 交 叉 上 核 を破 壊 す る と分 娩 時刻 が 明期 の み で な く暗期 に も起 こ る こ と か ら も支 持 さ れ る(Murakami et al.,1987). 以 上 の様 に ラ ッ トの排 卵 機 構 か ら分 娩機 構 に 至 る まで これ らが 外 部 環 境,特 に明 暗 条 件 を 同調 因子 と した リズ ム 機 構 に密 接 に カ ップ リ ン グ して い る こ とは 明 らか で あ る.光 条 件 に よ る 自然 排 卵 か ら交 尾 排 卵 へ の変 化 や分 娩 時 刻 を操 作 で きる こ とは見 方 を変 え る と,光 の条 件 と言 う リズ ム の 同調 因子 を変 化 させ る こ とに よ り,リ ズ ム機 構 に連 結 した繁 殖 機構 を操 作 出 来 る 可 能性 を示 した こ と に な る.す な わ ち,繁 殖 の機構 解 明 や応 用 に お い て リズ ム機 構 の 解 析 や応 用 が 一 つ の ア プ ロ ー チ とな る わ け で あ る.そ こ で以 下 に,リ ズ ム機 構 を操 作 す る幾 つ か の 方法 を紹 介 す る.

生体時計の操作

a)同 調 因子 に よる操 作 本 来,個 々 の 動 物 が 有 す る生 物 時 計 の リズ ムの 周 期 は 24時 間 よ り多 少 ず れ た 各 自固 有 の 周 期 を持 って い る.そ の た め外 部 環 境 に 周 期 的 因 子 が 存 在 しな けれ ば,位 相 は 毎 日ず れ て 行 き 自由 継 続 リズ ム を示 す.し か し明 暗 な ど の24時 間 周 期 の 因 子 が 作 用 す る と時 計 は その 周 期 にセ ッ ト(同 調)さ れ る.こ の 様 な 因 子(同 調 因子)に は光, 温 度 や 音 な どが あ げ られ る.著 者 らは,制 限 給 餌 が 光 よ

り 強 力 な 同 調 因 子 で あ る こ と(Murakami and

Taka-Fig. 4. Incidence of time of parturition in Sprague-Dawley (a, b, c) and Wistar (d) rats kept in a lighting regimen of 14L: 10D; lights on 0500-1900 (a, d) or 1700-0700 (b). In (c), rats were kept in constant darkness. Half circle and complete

circle symbols represent the time of parturition in 1 and 2 rats, respectively. Time of birth was determined at 3-hr intervals.

Fig. 5. Time of parturition in rats with a complete

lesion of suprachiasmatic nucleus (closed circle), a partial lesion of SCN or intact (open circle) (B). The lesion of suprachiasmatic nucleus was performed on

day 13 of pregnancy, and circadian rhythm of water intake was investigated on day 19 of pregnancy to determine whether the rhythm was abolished by

hashi,1982;Takahashi and Murakami,1983; Murakami et aL,1986),母 親(Takahashi et al.,1982,1984;Sasaki et aL,1984)や 群 飼 育 に よ る 社 会 的 因 子(Takahashi and Murakami,1982,1983)も 同 調 因 子 に な り得 る こ と を 見 い だ し た.Fig.6は 明 暗 交 代 条 件 下 で 制 限 給 餌 を 行 っ た 時 の 副 腎皮 質 ホ ル モ ン リズ ム を示 した もの で あ る。 自由 給 餌 の場 合,暗 期 開 始 直前 に ピー クが あ るが,毎 日2時 間 の 制 限給 餌 を明期 に行 う と,2週 間 後 に は給 餌 直前 に ピー ク を形 成 して い る.即 ち,餌 の 来 る時刻 を予 知 して い る こ とに な り,こ の ホ ル モ ン リズ ム が 計 時 機 構 に よ り 制御 され て い る と言 え る.こ の 制 限 給 餌 に よ る副 腎 皮 質 ホ ル モ ンの 同 調 性 を利 用 し,分 娩 時 刻 を意 図 す る時 刻 に 持 っ て くる こ と も一部 の 動 物 で可 能 で あ る(Murakami θ∫謡,未 発 表).Fig.7は ラ ッ ト乳 児 の リズ ム が 母 親 の リ ズ ム に 同調 さ れ る こ と を示 す 結 果 で あ る.生 後 直 ち に眼 球 を摘 出 し,半 分 の 子 供 は産 み の 親 に半 分 の 子 供 は産 み の親 と逆 転 した リ ズ ム を持 つ 雌 ラ ッ トに保 育 させ る と, 子 供 はす べ て 保 育 さ れ た母 親 の リズ ム を受 け継 いで 離 乳 後 も継 続 した.こ の こ とは,育 母 が保 育 を通 して 子供 の リズ ム をセ ッ トす る こ と を示 して い る.Fig.8は 盲 目 ラ ッ トを個 別 ケ ー ジ で 一 匹ず つ飼 育 した時 と,同 じケ ー ジ 内 に6匹 を ま とめ て群 飼 育 した と きの成 長 過 程 で の 自由 継 続 リズ ム の頂 点位 相 の ず れ を示 した もの で あ る.個 別 ケ ー ジ の ラ ッ トで は ラ ッ ト間 の 固 々 の リズ ム の 周期 の ず れ が は っ き り分 か る が,群 飼 育 に よ り,お 互 い の 周 期 が

Fig. 6. Effect of restriction of feeding time on the

circadian adrenocortical rhythm. The rats were kept under 12L: 12D (lights on 0600-1800). The time of food presentation was restricted between 08 hr and 10 hr (middle), and between 08 hr and 16 hr (right) without change of lighting condition. In rats shown in left panel, food were given ad libitum.

Fig. 7. Two days pattern of blood corticoster-one levels in blinded pups raised by original or foster mothers. Two left panels show the blood corticosterone rhythms in blinded pups born under LD or DL and raised by original

mother. Two right panels show the blood corticosterone level in blinded pups born under DL (LD) and raised by foster mother which was kept under LD (DL), respectively.

Fig. 8. Free-running patterns of the circadian

adrenocor-tical rhythm in blinded rats housed either singly (right) or group (left). Circadian peak time is shown on the ordinate and the number of weeks after blinding is shown on the

abscissa. Each circle represents the acrophase of the rhythm in each animal at the examination week.

同調 して行 っ た こ とに よ りば らつ きが 少 な くな って い る. す な わ ち,社 会 的 な 因子 が お互 い の リズ ム の 周期 を同調 した と解 釈 さ れ る. b)薬 物 に よ る操 作 著 者 ら は 自 作 の 行 動 計 を 使 用 し て(Yokawa et al., 1986)種 々 の 薬 物 の 行 動 リ ズ ム に 及 ぼ す 効 果 を 調 べ た が, ア セ チ ル コ リ ン 系 薬 物(Murakami et al.,1986,1987; Furukawa et al.,1987)と メ ラ トニ ン(Murakami et al.,

1983)に 最 も効 果 の あ る こ と を見 い だ した.Fig.9は ア セ チ ル コ リ ンの作 動 薬 で あ る カ ル バ コー ル を 自由 継 続 リ ズ ム を示 す ラ ッ トの視 交 叉 上核 の 近傍 に投 与 した 時 の リ ズ ム の周 期 に及 ぼ す効 果 を示 して い る.い ず れ も周 期 が 投 与 前 に比 べ て著 し く短縮 した.一 方,メ ラ トニ ンは急 な 光 条件 へ の変 化 に対 し リズ ム を速 や か に 再 同調 させ た. こ の再 同調 促 進 効 果 は 行動 リズ ム の み で な く副 腎 皮 質 ホ ル モ ン リズ ム で も見 られ た.そ の結 果 を ま とめ てTable 3に 示 した.明 暗 条 件 逆転 後4日 で メ ラ トニ ンの再 同調 促 進 効 果 が顕 著 な こ とが わ か る.こ の メ ラ トニ ンの再 同 調 促 進 効 果 を利 用 した 東 西飛 行 で,時 差 ボ ケ の解 消 効 果 が す で に 臨床 的 に認 め られ て い る. 以 上 は,同 調 因子 や 薬物 を利 用 して リズ ム の位 相 や周 期 を 変化 させ る例 を示 した が,こ れ らは 単 に リズ ム学 で は な く生 物 時 計 が基 礎 とな る種 々 の生 理機 構 を間接 的 に 制御 す る分 野 に大 い に 貢 献 で きる と考 え られ る.メ ラ ト ニ ンや制 限給 餌 の応 用 が す で に繁 殖 機構 や 時差 ボ ケ解 消 へ の 一端 に応 用 され て い る .こ う して 見 る と,時 計 機 構 の 本 質 の解 明 が さ ら に重 要 な 課 題 とな って 来 る.

生物時計機構の解析

a)1n vivoで の 解 析 ほ 乳動 物 の 生 物 時 計 は視 床 下 部 に 存 在 す る約8千 の神 経 細 胞 集 団 か らな る視 交 叉 上 核 に存 在 す る.そ の 時 計機 構 を解析 す る 上 で 一 つ の 方 法 は 時 計 の 構 成 要 素 を見 つ け る こ とで あ る.視 交 叉 上 核 中 の 幾 らか の 物 質 を検 索 した 結 果,ホ ル モ ン等 の 情 報 伝 達 物 質 で あ る サ イ ク リ ッ ク AMP(cAMP)の 濃 度 に 日 内 変 動 が あ り,光 に 同 調 す る と 同 時 に 光 情 報 が な く て も時 計 自 身 の リズ ム を 反 映 す る こ と を 見 い だ し た(Murakami et al.,1983).Fig,10 は そ の 結 果 を示 す が,明 期 後 半 に ピ ー クが あ り,明 暗 条 件 を逆 転 した 条 件 下 で もや は りピ ー ク は 明期 後 半 に現 れ た.ま た 盲 目 に し た り恒 常 明 下(LL)で は ピ ー ク の 移 動 が み られ,こ の リズ ムが 内 因 性 の もの で あ る こ とが 分 か る.こ の リズ ムが 視 交 叉 上 核 特 有 の もので あ る こ と は Fig.11に 示 す 様 に腹 内 側 核 な ど のcAMPの 日内 リズ ム

Table 3. The incidence of reentrainment of circadian adrenocortical rhythm after reverse of LD cycle

Fig. 9. Free running rhythm of locomotor activity in

rats implanted with paraffin pellet (A), or pellet containing carbachol (B, C). Arrows indicate the day of implantation. Locomotor activity was recorded

が,視 交 叉 上 核 の リズ ム と全 く逆 の位 相 を持 って い る こ と か ら推 察 され る.そ の 後,こ のcAMPの リ ズ ム は 単 に時 計 か らの 出力 に す ぎな い の で は?と の 議 論 もあ った が,最 近,視 交 叉 上 核 の 活 動 電 位 の リズ ムがcAMPに よ っ て 転 移 す る こ と に よ り,cAMPが 時 計 機 構 の構 成 要 素 の 一 つ で あ る と考 え られ て い る. 次 に ア セ チ ル コ リ ンが 光情 報伝 達 に関 与 して い る こ と を 見 い だ し た(Murakami et al,1984).Fig.12は 光 照 射 後 に視 交 叉 上核 中 の ア セ チ ル コ リ ン含 量 が 増 加 す る こ と を示 した もの で あ る.こ の 場 合 も他 の 神 経 核 で は変 化 が な い こ とか ら視 交 叉 上核 中 の アセ チ ル コ リ ン と光 情 報 に密 接 な 関係 が あ る こ とが 分 か る.さ ら に,上 述 した よ う に,ア セ チ ル コ リ ン作 動 薬 で あ る カル バ コ ー ル の投 与 は リズ ム の周 期 を短 縮 した.併 せ て 考 えれ ば,ア セ チ ル コ リ ン系 が視 交 叉 上核 の 光 情 報 の 伝 達 や 発 信 に関 与 して い る可 能性 は 高 い. 通 常,時 計 機 構 の 解 析 は時 計 か ら発 せ ら れ た リズ ム を 末 端 の行 動 や ホ ル モ ンの リズ ム を指 標 に行 わ れ て い る. しか し末端 で の 発 現 リズ ム に は多 くの 修 飾 が 加 わ っ て い

Fig. 10. Twenty four hour pattern of cAMP

con-centrations of suprachiasmatic nucleus under va-rious lighting conditions. Intact rats were kept under LD (A), DL (B), LL (D) for 4, 2 or 1 weeks,

respectively. C: rats were blinded and kept under LD for 5 weeks. Each circle and vertical bar represents the mean ±S.E.M. of 6 rats. Asterisks

indicate the significant difference between the time of day (*P•ƒ0.01, **P•ƒ0.05)

Fig. 11. Twenty four hour pattern of cAMP concen-trations of ventromedial hypothalamus under va-rious lighting conditions. A, B, C, D of the figure correspond to those of Fig 10.

Fig. 12. Effect of light on the acetylcholine

concen-tration of the suprachiasmatic nucleus. The light was given 3 hr after darkness in intact (open circle) and blinded (black circle) rats. Acetylcholine

con-centration increased significantly 30 and 60 min after light on.

る こ とを考 慮 しな け れ ば な らな い.例 え ば,副 腎皮 質 ホ ル モ ンの リズ ム の発 現 は視 床 下 部 や 下 垂体 の ホ ル モ ンに よ り支 配 され て い る こ と以 外 に,甲 状 腺 ホ ル モ ンや そ の

他 の 物 質 が 複 雑 に 関 与 し て い る(Murakami and Taka-hashi,1983; Murakami et al., 1984; Murakami, 1984).

最 近,著 者 らは 光 を急 に変 化 した 時,時 計 自身 の 新 た な 光 へ の 再 同 調 は 速 や か に起 こ るが,行 動 リズ ム な ど末 端 の リズ ム の再 同調 に は か な りの時 間 を要 す る こ と を見 い だ した(Takamureβ 彦鳳,1991),時 計 機 構 解 析 を 末 端 の リズ ム を指 標 に す る場 合 注 意 を要 す る こ と を意 味 して い る.そ こ で,次 に時 計 の存 在 す る細 胞 で機 構 を解 析 す る試 み を検 討 した. b)In vitroで の 解 析 著 者 らは ほ乳 動 物 の視 交 叉 上核 の 時 計発 信 機 構 を細 胞 レベ ル で解 明 す る た め に,そ の神 経 細 胞 の培 養 を行 い, そ の 時計 自体 の リズ ム をバ ゾ プ レ ッ シ ン放 出 リズ ム で 捉 え る こ と に 成 功 し た(Murakami et aL,1991),Fig,13 は 視 交 叉 上核 神 経 細 胞 の 培 養 写 真 で あ る.神 経細 胞 は ラ ミニ ンで 被 覆 した 培 養 皿 上 で,無 血 清 培 養 され る と,神 経 回 路 網 状 の構 造 を呈 し,そ こか ら分 泌 され た バ ゾ プ レ ッ シ ン はFig.14に 示 す 様 に,概 日 リズ ム を示 した.こ の 培 養 系 で,今 後 細胞 レベ ル で の 時 計 機構 解 析 が 進 む こ とが 期待 され る. 始 め に記 した 様 に,ほ 乳 動 物 の 生 物 時 計 が 視 交 叉 上 核 に局 在 す るの に 対 し鳥 類 で は一 部 の 例 外 を除 い て 松 果 体 に存 在 す る と考 え られ て い る.さ ら に鳥 類 松 果 体 細 胞 は 光 受 容 体(photoreceptor)を 持 ち,光 情 報 は 細 胞 中 の 時 計 発 信 機 構 へ 伝 達 され そ こか ら発 す る リズ ム は メ ラ ト ニ ン分 泌 と して 現 れ る(Takahashi et al,1989),即 ち, 計 時 機 構 を解 析 す る上 で 一 つ の細 胞 内 に,光 入 力 機 構一 時 計 機 構一 出力 機 構 の す べ て を備 え た好 個 な材 料 と な る. そ こで まず,時 計 の発 信 や光 入 力 機 構 に蛋 白質 の 合 成 が 関 与 して い る か 否 か を検 討 した.Fig.15は ひ よ この 松 果 体 細 胞 の メ ラ トニ ン 分 泌 リ ズ ム を示 す(Murakami 1990,1991).暗 期 に ピ ー ク を持 ち,以 後 恒 常 暗(DD) 下 で も自 由継 続 リズ ムが 示 さ れ る.こ の状 態 で蛋 白合 成 阻害 薬anisomycinを パ ル ス 投 与 す る と リ ズ ム の 後 退 が 起 こ っ た.こ の 蛋 白合 成 阻害 薬 の効 果 は リズ ムの 位 相 に 特 異 的で,あ る時 間の 投 与 は リズ ム の前 進 を起 こ し,ま た あ る特 定 時 間 の投 与 は リ ズ ムの 後 退 を起 こ した.Fig, 16は そ の結 果 を ま とめ た位 相 反 応 曲 線 で あ る.こ の結 果 は 時計 の発 信 機 構 に新 た な蛋 白質 の合 成 が 必 要 で あ る こ とを意 味 して い る.さ ら に興 味 深 い こ と に,光 パ ル ス の効 果 と逆 転 した 関係 に あ り,光 に よ る リズ ム機 構 へ の

Fig. 13. Photomicrographs of cultured neurons pre-pared from SCN regions in 1-day-old rats. Cells were plated in 96 well dishes pre-coated with laminin. This picture was taken on day 11 of culture.

Fig. 14. Two individual samples showing circadian oscillation of vasopressin release from cultured SCN neurons. Perfusion was started after 21 days in culture. Flow rate was 0.1 ml/hr and samples were collected at 3 hr intervals.

効 果 が あ る蛋 白 を合 成 した結 果 で あ る こ とを暗 示 して い る.こ の可 能 性 は,光 に よ る リズ ム の移 動 が 光 と同 時 に 蛋 白 合 成 阻 害 薬 の 投 与 に よ り阻 止 さ れ た(Fig.17)こ とか ら証 明 され る.35S-メ チ オニ ンの蛋 白合 成 へ の取 り込 み を調 べ る と,光 照 射 に よ り,76Kダ ル ト ン と80K ダ ル ト ン蛋 白合 成 が 促 進 さ れ た こ とが 判 明 した. 以 上,概 日 リズ ム を 中心 に,そ の基 礎 か ら応 用,ま た 繁 殖 機 構 との 関係 に つ い て 著 者 らの研 究 を紹 介 した.繁 殖 機 構 も計 時機構 も共 に,進 化 の 過 程 で 生 命,種 の 維 持 に不 可 欠 な もの で あ る.最 近 で は分 子 生 物 学 的 技 術 の進 歩 と相 ま って 多 くの 問 題 が 解 明 され て き たが,未 解 明 な 部 分 も まだ まだ 多 い.今 回 の 研 究 の 一 部 で もが 将 来 の発 展 の役 に立 て れ ば幸 い で あ る.

謝

辞

本 研 究 に対 し島 村 賞 の 栄 誉 を与 えて 下 さ っ た 日本 家 畜 繁 殖 学 会 に 深 く感 謝 申 し上 げ ます.ま た推 薦 の労 を取 っ て下 さ った 江 藤 禎 一,高 橋 迫 雄 教 授 に深 謝 致 します.本 研 究 は東 京 大 学 家 畜 生 理 学 講 座,東 京 神 経 科 学 総 合 研 究 所,及 び宮 崎 大 学 の 多 くの 先 生 方 や卒 業 生 の御 協 力 と御

Fig. 15. Protein synthesis inhibitor, ani-somycin, pulses phase shifts the circadian rhythm of melatonin release in chick

pineal cells. A: individual record of 4 cultures exposed to a 6-hr anisomycin beginning at CT 3. B: individual control culture. C ensemble averages of the 2

groups shown in A and B.

Fig. 16. Comparison of the phase response curves for 6 hour pulses of anisomycin, 6 hour pulses of light, 4 hr pulses of light or dark.

Fig. 17. Effects of anisomycin on the light-induced phase

shift in chick pineal cells. A: Six hr pulses of anisomycin together with light were started at CT18 (L: light pulse only, A: anisomycin pulse only, L+A: light and anisomy pulses). Anisomycin blocked the phase advance effect induced by light. B: Six hr pulse of anisomycin was started 3 hr before light pulses. Anisomycin was given between CT 15 and CT21. Light pulse was given between CT18 and CT21. L: light only, A: anisomycin only, A-L: light pulses followed on aisomycin. Dimetylanisomycin

援 助 の 上 にで き あが っ た もので,深 甚 の謝 意 を 表 し ます. 特 に,研 究 へ の 興 味 を与 え,最 初 に こ の道 へ の 紹介 を下 さ った 元 宮 崎 大 広 江 一 正 教 授,研 究 へ の 強烈 な情 熱 とイ ンパ ク トと を与 えて 下 さ っ た東 大 の高 橋 迫 雄 教 授,鈴 木 善祐,本 間 運 隆 両 東 大 名 誉 教 授,生 体 リズ ム研 究 の御 指 導 を頂 い た 国 立 神 経 セ ンタ ー の高 橋 清 久 部 長 そ して現 在, 御 指 導 並 び に共 同研 究 を して頂 い て い る宮 崎 大 学 の江 藤 禎 一教 授 に この 場 を借 りて,深 謝 の意 を表 しま す.最 後 に,勇 気 と支 持 を与 え続 け て くれ る妻 の和 代 と家 族 に感 謝 し ます 。

文

献

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