教育目的組換え　ＤＮＡ　実験に関する教材開発研究

教育目的組換えDNA実験に関する教材開発研究 DevelopmentofRecombinantDNAExperimentstoUseinHighSchool 笠原恵(兵庫教育大学大学院学校教育研究科) MegumiKASAHARA(GraduateSchoolofEducation,HyogoUniversityofTeacherEducation) 西山備希(兵庫教育大学大学院学校教育研究科(院生)) YukiNISHIYAMA(GraduateSchoolofEducation,HyogoUniversityofTeacherEducation) 小河基子(兵庫教育大学附属小学校) MotokoOGAWA(AttachedElementarySchool,HyogoUniversityofTeacherEducation) 吉岡秀文(兵庫教育大学大学院学校教育研究科) HidefumiYOSHIOKA(GraduateSchoolofEducation,HyogoUniversityofTeacherEducation) 渥美茂明(兵庫教育大学大学院学校教育研究科) ShigeakiATSUMI(GraduateSchoolofEducation,HyogoUniversityofTeacherEducation) 平成14年1月告示,3月施行の文部科学省『組換えDNA実験指針』において,教育目的組換え DNA実験の項目が付け加えられ,我が国の中等教育課程において初めて組換えDNA実験が可能 になり5年になるが,実際の教育現場においては,器具や教材不足のためにあまり普及していな い。 また,実際に組換えDNA実験を行うに当たって,様々な問題点が教育現場では浮かび上がっ てきている。 本研究では,組換えDNA実験の教員研修に参加した教員を対象にアンケート調査 を行ない,その調査を参考に大腸菌からの簡易ゲノム抽出法の開発と組換えDNA実験でよく実 施される大腸菌の形質転換実験に関する教材開発を行なった。 キーワード:教育目的組換えDNA実験,大腸菌,形質転換DNA抽出, 酸性ホスファタ-ゼ遺伝子(phoN) 1.はじめに 我が国の中等教育課程において初めて組換えD NA実験が可能になって以来,『組換えDNA実験 指針』はカルタヘナ議定書の採択に伴い廃止され, 『遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物 の多様性の確保に関する法律』の制定,施行へと 変遷してきているが,教育目的組換えDNA実験 に関しての内容は踏襲されている。 このように中 等教育において組換えDNA実験が可能になった ことは,我が国の科学教育の発展において非常に 有意義であると思われる。 世界的に発展している 分子生物学分野の基礎基本の概念を,また日常生 活でもしばしば耳にする『遺伝子組換え』につい て,中等教育課程で実際に経験できる意義は大き い。しかし,残念ながら,この領域に関する教材 開発となると,現場で指導する中等教育教員では, 施設,技能の面から難しい点が多い。 また,我が 国で使われている中等教育課程用の教材は2つあ るが,どちらも分子生物学の技術と設備をもった 企業が開発したもので,アメリカの企業が出して いるGFPの教材と我が国の企業が出したLacZの 教材があるのみである。 これらは教育現場用に開 発されているが,実際の教育現場で行うと成功率 が20-30%と低い。 初めての実験で,また基礎基 本の実験でこのように不成功の割合いが高いと, 学習意欲や科学-の関心にも影響を及ぼす。 そこで教育目的組換えDNA実験が可能になっ て3年,ここで一旦,教育現場の声を聞き,組換 えDNA実験の現状および教材の問題点等を網羅 し,さらにそれを踏まえて,使いやすい教材開発 を行うことは教育現場において特に必要であると 考え,実際の教育現場の声を反映しながらの教材 開発を行った。

2.組換えDNA実験の実施に関するアンケート調 査およびその解析 本学ではサイエンスパートナーシップ(SPP) 事業として平成14年から継続して,兵庫県内の高 等学校生物教員を対象に組換えDNA実験の教員 研修を行ってきた。 この研修に参加した教員は, 中等教育課程での組換えDNA実験を意義あるも のと考えており,できればなんらかの形で授業に 反映させたいと思っている人たちである。 そこで, 過去3年間に参加した教員50名を対象として, 中等教育課程における組換えDNA実験の実施映 況,内容,問題点などについて質問紙形式により アンケートを実施した。 組換えDNA実験の研修後-年以内に実際に授 業に活用した人の割合は約20%,活用していな い人の割合は約38%だった(図1-a)。 活用 していない人の内,今後活用予定であると回答し た人は約44%だった(図1-b)これらの結 果から,組換えDNA実験の研修後に授業で活用 しようと考えている人の割合は約37%になる。 しかし,残りの約20%の人が活用しないと答え, 約43%の人から回答が得られなかった。 そこで, 実際に授業時間がとれるかどうかについて調べた ところ,授業時間がとれると回答した人の割合は 約65%だった(図l-C)。 また,実際に組換え DNA実験に費やせる時間を調べたところ,時間 がとれると回答した人の内では2時間が最も多く 約50%,3時間から4時間が約*b,時間 以上とれると回答した人は約12%だった。 これ らの結果から,組換えDNA実験の教材を開発す る場合,2時間で実施できる実験を組む必要があ ることが示唆された。 次に組換えDNA実験を活 用できないと回答した人の理由を見てみると,設 備面の問題が最も多く約31%,次に予算の問題 約19授業時間の問題約13%,そして内容 の問題という結果が得られた(図1-d)。 また, その他の理由として,指導する教員のレベル不足 の問題も挙げられていた。 これらの結果から,組 換えDNA実験についての授業での取り組みは可 能であるが,設備,予算,時間などの面から実施 できていないという実情が浮かび上がった。 教育現場で活用しやすい教材を作成するために は,実際の高等学校の設備や予算について知って おく必要がある。 そこで,各高等学校の実験設備

図1 la組換えDNA実験の教育現場-の活用状況

図1 -b組換えDNA実験の今後の活用

図1 -C組換えDNA実験を行うための授業時間の確保

図1-d組換えDNA実験を活用できない理由

6 0 5 0 4 0 3 0 ■あ る 蝣*i L 、 3 8 3 9 3 4 3 0 2 6 2 0 1 0 0 1 9 6 2 1 り 4 5 ₃ 1 7 H 1 7 9

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図1-e組換えDNA実験で使用する設備・備品の高等学校における 言一日叩. '.:'

図1 lf組換えDNA実験で使用可能な予算

についてのアンケートと組換えDNA実験に使用 できる予算について調査を行った。 組換えDNA 実験で欠かせないのがオートクレーブとインキュ ベータである。 これらのみが,「ある」と回答し た人の方が多かった(図1-e)。 これらのことか ら,最低限の設備のみで実施可能な実験系を考え る必要がある。 また予算についても年間2万円か ら3万円以下で実験できれば可能であるという結 果が得られた(図1-0, 3.大腸菌の形質転換に関する教材開発 アンケート調査の結果を参考に,実際の教育現 場で実施可能な組換えDNA実験である大腸菌の 形質転換プログラムの開発を試みた。 教育目的組 換えDNA実験で使用可能な遺伝子7種類の中の phosphatase遺伝子を用いて,教育現場で効率の 良い形質転換系を開発した。 初めての実験で,ま た基礎基本の実験でこのように不成功の割り合い が高いと,学習意欲や科学への関心にも影響を及 ぼすpUC系のベクターを使用することにより, 大腸菌内のプラスミドDNAのコピー数を多くし (200-300コピー),形質転換効率を上げた。 ま た,酸性フォスファクーゼ遺伝子は大腸菌には見 つかっておらず(Kasaharaet. al,1991),栄養培 地に基質である51プロモ41クロロ31インドリルリ ン酸(X-P)を加えるだけで,コロニーの青色呈 色反応により容易に結果を観察することができる。 形質転換実験に使用したプラスミドDNAを図2 に示す。 一般的に行われている形質転換実験は,図3に 示すように,大腸菌の膜の透過性を狂わせたコン ビテントセルにプラスミドDNAを加え,水冷後 ヒートショックを与え,培地を加えることによっ て膜を元に戻すという方法である。 形質転換実験 において,いかに効率の良い大腸菌のコンビテン トセルを作成するかが実験の成功を左右する。

ベクタ、DNA 図2形質転換実験に使用した プラスミドDNA(phoN) MCS:マルチクロ-ニングサイト pこプロモーター o:オペレータI iacZこl-ガラクトシダーゼ遺伝子(N端側) Amp':アンピシリン耐性遺伝子 市販の大腸菌のコンビテントセルはコストが高 く費用の面から教育現場では使うことができない。 そこで,ここでは,できるだけ費用がかからず容 易に調整できる塩化カルシウム法を使うことにし た。前述のアンケート結果からもわかるように, できるだけ設備を使わない実験を考える必要があ る。そのため,コンビテントセルの作成の際も大 腸菌のコロニーを植え付け用ループで採り,直接 カルシウム溶液に懸濁する方法で行うこととした。 実際には表1のように,各過程において最も効率 の良い条件を実験により確かめた(図4)0 表1実験条件の検討事項 検肘事項処理方法、処理時間 コンビテントセルの作成法 1回目の水冷の時間 42-Cでのヒートショックの時間 2回目の氷冷の時間 プラスミドDNAの濃度 プラスミドDNAの容量 植え付け用ループでとれる液量 市販のもの Cach溶液で作成 0分-30分 0分∼5分 0分-5分 1ng.-500ng 1//I-25jUl

図3大腸菌の形質転換実験の概要

6 5 4 i X 1 0

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図4-a植え付け用ループで採取できる容量

x iO 2 .5 堯 ….0.5.0 酸 0 -5 0 .

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図4-Cコンビテントセル作成時の塩化 カルシウム濃度 × 1 0 4

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0.0

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1 .、. ⊥◇ 0 .5 t= - トシ ョッ ク ( 4 2 ℃ ) の 時 間 ( m in )

図4-eヒートショックの時間

× 10 3 2 .0 重 1-5 酵 1.0 車 齢 0 .5 0

＼

㌔ 0 DNAIOOngに対する液量(μl)

図4-gコンビテントセル量に対するDNA容液量

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…

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lH H I^H ^ ^B il^ ^ 5 I^ H ^S [

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JP , / / 6 , 1 2 4 8 16 コロニーの致

図4-b形質転換に用いたコロニー数

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図4-d l回目の氷冷の時間

図4-f 2回目の水冷の時間

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1 0 2 0 1 0 0 2 0 0 5 0 0 D N A の 量 ( n ￨ / // l)

図4lh形質転換に使用するDNA濃度

マイクロピペットは一般の教育現場においては 高額なため,. 植え付け用ループでDNA溶液を取 ることとした。 そこでまず,植え付け用ループで とれる溶液量を測定した。 20人の学生で調べた ところ,1μ1から2μ1とれる人が最も多く,10 μ1を超えて取れる人は少なかった(図4-a)。 こ のことから植え付け用ループで取れる最低量(1μ 1)を使って以下の実験(a-g)を行った。 a)形質転換に使用するコロニーの数 実験の前日に大腸菌JM109株をLB寒天培地に 広げて,直径1mmから2mmの大腸菌のシング ルコロニーを作成しておく。 形質転換を行なう場 合,このシングルコロニーを植え付け用ル-プで 掻き採り,200μ1の塩化カルシウム溶液に入れ混 ぜるO図4-bに示すように,4個以上のシング ルコロニ-を取れば形質転換効率が高くなるo b)コンビテントセル作成時の塩化カルシウム濃 度大腸菌のシングルコロニーを塩化カルシウム溶 液に入れ混ぜることによりコンビテントセルを作 成する。このときの最適塩化カルシウム濃度を調 べた。図4-Cに示すように,100mMの塩化カ ルシウムが最も形質転換効率が高かった。 C)コンビテントセルにプラスミドDNAを加えた 後の水冷の時間(1回目の水冷の時間) 大腸菌のコンビテントセルにプラスミドDNA を加えて水絵をすることにより,大腸菌にプラス ミドDNAが入りやすくなる。 水冷時間10分が最 も形質転換効率が高かった(図4-d)0 水冷時間 が5分以上であれば形質転換実験に支障はないが 授業時間を考えると5分から10分が適当である と思われる。 d)42-Cでのヒートショックの時間 形質転換実験でのヒートショックの役割は,大 腸菌へのプラスミドDNAの導入効率を上げるこ とである。今回の実験ではヒートショックをしな くても形質転換を起こすことがわかった(図4-e)0 しかし,教育的意義からするとヒートショックを 行なうことが望ましいと考える。 今回の実験では ヒートショックの時間が30秒の時が最も効率が高 かった。時間が長くなると効率はどんどん落ちて 行くため,教育現場で行なう場合,この時問に十 分気をっける必要がある。 e)ヒートショック後の水冷の時間(2回目の水冷 の時間) ヒートショック後の水冷の時間は,1分が最も 形質転換効率が高かった(図4-f). しかし,こ の過程は形質転換実験の意味に影響ないと思われ るため,実際の教育現場の事情に合わせて,実験 時間を短くしたい場合は省略しても差し支えない と考える。 f)コンビテントセルに対するプラスミドDNAの 溶液量 プラスミドDNAをコンビテントセルに入れる 場合,この実験では植え付け用ループを用いる。 植え付け用ループを用いて取れる溶液量は個人差 が大きく,しかも図4-aからでもわかるよう に,5μ1以下しかとれない場合が多い。 プラス ミドDNAの溶液量のコンビテントセルに対する 割合を比較した場合,図4、gに示すように1μ1 が最も形質転換効率が高く,10μ1以上になると 効率が落ちるdこのことから植え付け用ル-プで 取る場合は,5μ1以下が望ましい。 ど)形質転換に使用するプラスミドDNAの濃度 市販のコンビテントセルは非常に形質転換効率 がよいため,使用するプラスミドDNA濃度は低 くても構わない(0.2ne/μ1-2ng/μ1,data notshown),しかし,塩化カルシウム法で作成 したコンビテントセルは市販のものと比べると効 率が低いため,用いるプラスミドDNA濃度を高 くする必要があると考え,プラスミドDNAの最 適濃度を調べた。 図4-hに示すように,最適濃 度は20ng/μ1だった。 このことから市販の コンビテントセルを用いた場合と比べると10 倍から100倍のDNA量を必要とすることにな る。この場合,形質転換実験の最後に大腸菌溶液 をLB寒天培地に広げるが,市販のコンビテント セルを使用した場合は薄めてまく必要があるが, 塩化カルシウム法で作成した場合はその操作が不 用である点は,教育現場では利点であると考えら れる。 以上の実験結果から高等学校で容易に行なうこ とができ,成功率の高い形質転換実験の方法を以 下に示す。 (実験操作) (1)植え付け用ループで,直径1mm以上のコロ ニーを4個掻き採り,100mM塩化カルシウム 溶液100μ1. に懸濁する。

(2)植え付け用ループで,プラスミドDNA溶液 (20ng/μDを取り,(1)で作成したコンビテ ントセルに入れる。 (3)水冷10分。 (4)42-Cで30秒間ヒートショックを行なう。 (5)水冷1分。 (6)200μ1のLB液体培地を加え,その内の1 00μ1を植え付け用ループを用いて抗生物質入 りLB寒天培地に広げる。 (7)37℃のインキュベ-夕で一晩培養する。 (8)翌日,コロニーの数や個数を調べる(10個 300個のコロニーが見られる)。 実際の実験 結果を図5に示す。 この実験の実験時問は実験の準備や説明の時間 を含めて50分あれば可能である。 また,試薬も 器具も特別高価なものを必要とせず,簡単な実験 操作で授業時間内に実施可能な成功率の高い実験 系であると思われる。 4.教育現場での問題点 今回開発した形質転換系は,容易で短時間に行 うことができ,成功率も高いと思われるが,いく つかの問題点も含まれる。 まず第1点は,前日ま でに大腸菌のプレートを準備する必要があること。 2点目は,直径1mm以上の大腸菌のシングルコ ロニーを作る技術を必要とすること。 この点につ いては,コdニーでなくても大腸菌が生えさえす ればよいのだが,生徒に大腸菌量を指定するため にはシングルコロニーを作る方がよいと思われる。 3点目は試薬や培地の滅菌方法やプレートの処分 方子去を習得していなければならないこと。 4点目 は実験に使用するプラスミドDNA量が多く必要 であること。 5点目は植え付け用ループを用いる 実験であるため,コロニーを掻き採る場合やプラ スミドDNA溶液を取る場合に個人差がでるため, 形質換後のコロニー数に限って均一な実験結果が 得られないことなどがあげられる。 また,注意点として,植え付け用ループを使用 する場合,底が細くなっているタイプでは底まで 植え付け用ループが入らないためDNA溶液が多 量に必要になるため,チューブの底が丸いチュー ブを使う必要がある(図6)0 蛋 ○ ∵ × 図6植え付け用ル-プとチュ-ブの形状の関係 5.おわリに 今回,教育目的組換えDNA実験で開発した実 験方法は,費用がかからず短時間の実験時問で成 功率の高いものである。 この教材が実際の教育現 場で本当に活用できるかどうかは今後の課題であ る。また,この実験系の普及に関しても考えて行 く必要がある。 謝辞本研究を遂行するにあたり,調査にご協力いた だきました高等学校の先生方に厚くお礼申し上げ ます。

参考文献

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