B型 急性 肝 炎 に お け るHBc抗
原特 異 的 リンパ 球 反応 の解 析
鈴
木
貴
博
キ ー ワ ー ド:B型 急 性 肝 炎, B型 劇 症 肝 炎,細 胞 内 サ イ トカ イ ン,フ ロ ー サ イ ト メ ト リー, HBcAg 緒 言 B型 肝 炎 ウ イ ル ス(HBV)は 世 界 中 に 多数 の 感 染 者 が 存 在 し,そ の 持 続 感 染 は慢 性 肝 炎,肝 硬 変 さ らに 肝 細 胞 癌 を併 発 す る こ とが 知 られ て い る1). 一 般 に,ウ イ ル ス感 染 症 で は生 体 側 の 免 疫 応 答 が 予 後 に 重 要 な影 響 を与 え る こ とが 報告 され て い るが, HBV感 染 に お いて も生 体 側 の 免 疫 応 答 の 強 さ に よ り感 染 後 の 経 過 が 異 な る.ウ イ ル ス 感 染 に 伴 う生 体 側 の 免 疫 応 答 の 調 節 に は,抗 原提 示 細 胞 に よ る ウ イ ル ス抗 原 の 認 識 と抗 原提 示,抗 原特 異 的 なヘ ル パ ーT(Th)細 胞 の 誘 導 さ ら に細 胞 傷 害 性Tリ ンパ 球 (CTL)の 誘 導 の過 程 が,互 い に効 率 よ く機 能 す る こ と が 重要 で あ る2). HBV自 体 は細 胞 障 害 性 の な いDNAウ イ ル ス で あ り,そ の 排 除 に は 有 効 な 免 疫 応 答,特 にCTL の機 能 が 必 要 と され て い る3)-5). ウ イ ル ス抗 原 特 異 的 なCTLの 誘 導 に は,抗 原 提 示 細 胞 と共 にTh細 胞 か らの サ イ トカ イ ンが 重 要 で あ る6),7). Th細 胞 は産 生 す るサ イ トカ イ ンの種 類 か ら2種 類 に分 け られ,イ ン ター ロ イ キ ン(IL)-2,イ ン ター フ ェ ロ ン(IFN) γ な ど を産 生 す るTh1細 胞 とIL-4, IL-5, IL-6 IL-10な ど を産 生 す るTh2細 胞 が 知 られ て い るが,特 に CTLの 誘 導 に は 抗 原 特 異 的 なTh1細 胞 の機 能 が 必 要 で あ る8),9). HBV特 異 的 なTh細 胞 の 機 能 に つ い て は,従 来 種 々 の 方 法 で検 討 さ れ て き て い る.HBV抗 原 と末 梢 血 リンパ 球 を培 養 し細 胞 増 殖 能 を評 価 す る方 法10),培養 中 に産 生 さ れ るサ イ トカ イ ン を測 定 す る方 法11),末梢 血 あ る いは 肝 組 織 中 の リ ンパ 球 をHBV抗 原 で刺 激 して ク ロー ン化 しそ の機 能 を検 討 す る 方 法12)などが 報 告 され て い るが,こ れ ら の 方 法 は いず れ も煩 雑 で 長 時 間 の培 養 な どを要 して い た. 我 々 は, HBV抗 原 と末 梢 血 リ ンパ 球 を反 応 後,細 胞 内 サ イ トカ イ ン染 色 とフ ロー サ イ トメ トリー を応 用 す る こ と で,抗 原 特 異 的 なTh細 胞 やCTLの 動 態 を測 定 す る方 法 を開 発 した13). HBV抗 原 に対 す る免 疫 反 応 で は, HBc抗 原 に 対 す る 反 応 が 最 も よ く検 出 され て い る.そ こ で 我 々 は, HBc抗 原特 異 的 なTh細 胞 及 びCTLの 動 態 を,細 胞 内 サ イ ト カ イ ン染 色 と フ ロー サ イ トメ トリー を用 い てB型 慢 性 肝 炎 例 に お い て検 討 し報 告 した13).本研 究 で は, B型 急 性 肝 炎例 に お け る抗 原 特 異 的 なTh細 胞 及 びCTLの 機 能 に つ い て,細 胞 内 サ イ トカ イ ン染 色 と フ ロ ー サ イ トメ ト リ ー に よ り検 討 し た. 対 象 と 方 法 対 象 は臨 床 的 に 診 断 され たB型 急 性 肝 炎8例, B型 劇 症 肝 炎2例 で あ る(表1). B型 急 性 肝 炎 の 診 断 はHBs 表1 対 象 患 者10例 の 背 景 (平成14年1月10日 受 理) 指導:辻 孝 夫 教 授(岡 山大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 消 化 器 ・肝 臓 ・ 感 染 症 内科 学(内 科 学 第 一)) 論 文 請 求 先:岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究科 消 化 器 ・肝 臓 ・感 染 症 内 科 学(内 科 学 第 一) 電 話:086-235-7219 FAX: 086-225-5991 E-mail:[email protected]154 鈴 木 貴 博 抗 原, HBs抗 体, HBe抗 原, HBe抗 体, HBc抗 体, IgM-HBc抗 体, HBV-DNAを 測 定 し 診 断 し た.劇 症 肝 炎 の う ち1例(F-1)は 肝 不 全 に て 入 院10日 目 に 死 亡 し た が,残 る9例 は 軽 快 し て い る. IgM-HA抗 体 及 びHCV 抗 体 は 全 例 陰 性 だ っ た.ま た, B型 肝 炎 ウ イ ル ス に 未 感 染 の 健 常 人5名 を 対 照 群 と し た.実 験 へ の 検 体 使 用 に つ い て は 文 書 に よ り同 意 を 得 て 行 っ た . recombinantHBcAg (rHBcAg)は ダ イ ナ ボ ッ ト(東 京,日 本)よ り提 供 を 受 け, SDS-PAGEに よ り95%以 上 の 純 度 を確 認 し た .抗CD28抗 体,抗CD49d抗 体 は フ ァ
ミ ン ジ ェ ン(San Diego, CA, USA)よ り, Brefeldin
Aは シ グ マ ・ア ル ド リ ッ チ ・ジ ャ パ ン(東 京,日 本)よ り,PerCP標 識 抗CD4抗 体, PerCP標 識 抗CD8抗 体,
FITC標 識 抗CD69抗 体, PE標 識 抗IFN-γ 抗 体, PE
標 識 抗IL-4抗 体 は ベ ク ト ン ・デ ィ ッ キ ン ソ ン(San Jose, CA, USA)よ り購 入 し た. rHBcAgに 対 す る コ ン ト ロ
ー ル と し て,HCV抗 原 で あ るC200, NS5, core (2 -192a . a.)を 用 い,そ れ ぞ れ10μg/mlに て 同 様 の 抗 原 刺 激 を 行 っ た. HCVのC200, NS5, core蛋 白 はAdvanced Immunochemical (Long Beach, CA, USA)よ り購 入
し た.
患 者 及 び 対 照 よ りヘ パ リ ン 採 血 を行 い, 15mlグ ラ イ ナ チ ュ ー ブ に て 全 血1mlにrHBcAg 5μg/ml,抗CD28抗
体1μg/ml,抗CD49 d抗 体1μg/mlを 添 加, 37℃, 5% CO2下 に1時 間 培 養 の 後, Brefeldin A(シ グ マ)10μg/
mlを 添 加 し,さ ら に4時 間 培 養 を 行 っ た.計5時 間 の 培
養 終 了 後, FACS lysing solution(ベ ク トン ・デ ィ ッ キ ン ソ ン)を 用 い て 溶 血 処 理 を行 い,沈 渣 をfreezing medium
(10% DMSO-2% BSA-PBS溶 液)2mlに 再 浮 遊 さ せ た 後, -70℃ に て 凍 結 保 存 し た.無 刺 激 コ ン ト ロ ー ル で は 抗 原 を 添 加 せ ず に 上 記 の 培 養 を 行 っ た.陽 性 コ ン トロ ー ル と し て はStaphylococcal Toxins B (SEB) (Toxin
Technology, Sarasota, FL, USA)を10μg/mlの 添 加 に
て 行 っ た. 保 存 検 体 は37℃ の 恒 温 槽 に て 速 や か に 溶 解 した 後, 12× 75mmフ ァ ル コ ン チ ュ ー ブ(ベ ク トン ・デ ィ ッ キ ン ソ ン) に 分 注 し て1回 洗 浄 し た 後, PerCP標 識 抗CD4抗 体 ま た は 抗CD8抗 体 に よ り暗 所 室 温15分 に て 表 面 抗 原 の 染 色 を 行 っ た.さ ら にPermeabilizing Solution(ベ ク トン ・ デ ィ ッ キ ン ソ ン)に よ り 細 胞 膜 透 過 処 理 を 行 っ て1回 洗
浄 し た 後, FITC標 識 抗CD69抗 体 及 びPE標 識 抗IFN
γ 抗 体 ま た は 抗IL-4抗 体 に よ り暗 所 室 温30分 に て 細 胞 内 抗 原 の 染 色 を 行 っ た.ア イ ソ タ イ プ コ ン トロ ー ル と し
て はFITC標 識 抗 マ ウ スIgG1抗 体, PE標 識 抗 マ ウ ス
IgG2a抗 体(ベ ク ト ン ・デ ィ ッ キ ン ソ ン)を 用 い た.染 色 終 了 後, 1回 洗 浄 し た 後1% paraformaldehyde-PBS溶 液 に よ り 固 定 し,直 ち に 解 析 し た. フ ロ ー サ イ ト メ ト リー はFACS Calibur(ベ ク トン ・ デ ィ ッ キ ン ソ ン)に て3カ ラ ー 解 析 を 行 っ た.リ ン パ 球 集 団 か らCD4ま た はCD8陽 性 細 胞 群 を ゲ ー テ ィ ン グ し, そ れ ぞ れ に つ い て 早 期 活 性 化 マ ー カ ー で あ るCD69と 細 胞 内 サ イ トカ イ ン(IFN-γ あ る い はIL-4)が 共 に 陽 性 で あ る 細 胞 群 を 「活 性 化 細 胞 」 と し た.い ず れ の 検 体 に お い て も15000以 上 の ゲ ー トカ ウ ン ト を 得 た. 抗 原 特 異 的 活 性 化 リ ン パ 球(%)は,以 下 に 従 い 算 出 し た 。 計 算 式: (AS-AIC)-(US-UIC) AS:抗 原 刺 激 に お け る 活 性 化 細 胞 率 AIC:抗 原 刺 激 に お け る ア イ ソ タ イ プ コ ン トロ ー ル US:無 刺 激 に お け る 活 性 化 細 胞 率 UIC:無 刺 激 に お け る ア イ ソ タ イ プ コ ン ト ロ ー ル 0.05%以 上 を 反 応 陽 性 と し た. 結 果 陽 性 コ ン トロ ー ル で はCD4陽 性 及 びCD8陽 性 リ ンパ 球 と も に 反 応 陽 性 だ っ た.一 方 健 常 人5例 に お い て は, HBcAg刺 激 に よ るIFN-γ 産 生 はCD4陽 性 及 びCD8 陽 性 リ ン パ 球 と も に0.01%以 下 で 全 例 反 応 陰 性 だ っ た. B型 肝 炎 例 に お け る 反 応 陽 性 例 を 図1に 示 す(症 例 F-1). CD69とIFN-γ が 共 に 陽 性 と な る 細 胞 群 はCD4 陽 性 リ ン パ 球 で は0.16%で あ っ た が, CD8陽 性 リ ン パ 球 で は0.02%で あ っ た. B型 肝 炎 症 例 全 体 で は, HBcAg特 異 的IFN-γ 産 生 は, CD4陽 性 リ ン パ 球 の み に 認 め られ, CD8陽 性 リ ン パ 球 に は 認 め ら れ な か っ た. CD4陽 性 リン 図1 HBcAg刺 激 に よ る反 応 陽 性 例(症 例F-1) CD69とIFN-γ が 共 に 陽性 とな る細 胞 群 をCD4陽 性 リ ンパ 球 の 0.16%に 認 め た.
パ 球 に お い て はIFN-γ 産 生 がB型 急 性 肝 炎8例 中3例, B型 劇 症 肝 炎2例 中1例 に 陽 性 だ っ た. HBcAg特 異 的 IFN-γ 陽 性CD4陽 性 リ ン パ 球 の 頻 度 は 全CD4陽 性 リ ン パ 球 中0.08%-0.49%で あ っ た(図2).一 方, HBcAg 特 異 的IL-4産 生 に つ い て はCD4陽 性 及 びCD8陽 性 リ ン パ 球 と も に 全 例 陰 性 だ っ た. ま た,CD4陽 性 リ ン パ 球 に お い てIFN-γ 陽 性 で あ っ た4例 に お い て, 2週 間 後 に 再 検 し た と こ ろ, 4例 と も に 反 応 は 陽 性 で あ っ た.そ の 経 過 はA-1が0.08%か ら0.09 %, A-5が0.49%か ら0.24%, A-7が0.10%か ら0.08 %, F-1が0.15%か ら0.07%と な っ て お り,若 干 の 低 下 傾 向 が み ら れ た. 2週 間 後 の 再 検 に お い て もCD8陽 性 細 胞 に はIFN-γ は 陰 性 で あ っ た. コ ン トロ ー ル のHCV抗 原 刺 激 に お い て は, C200を
A-1, A-5, A-7の3例, NS5をA-5, A-5, A-7 の3例, HCV coreをA-2, A-3, A-7, F-2の4
例 に つ い て 検 討 し た が, CD4陽 性 及 びCD8陽 性 リ ン パ 球 の い ず れ に お い て もIFN-γ, IL-4と も に 全 例 陰 性 で あ っ た.ま た 無 刺 激 群 に お け る 非 特 異 的 活 性 化 細 胞 率(US -UIC)は い ず れ の 検 体 に お い て も0 .01%以 下 だ っ た. 考 察 日本 人 の 成 人 に お い て は,免 疫 機 能 の 低 下 した 個 体 で な け れ ば, HBVは 不 顕 性 感 染 あ る いは 急 性 肝 炎 を起 こ し て排 除 され,キ ャ リア化 す るこ とは一 般 に稀 であ る14). HBV の排 除 に は抗 原特 異 的 なCTLが 重 要 な役 割 を果 た して お り,こ のCTLの 誘 導 及 び 活 性 化 に は抗 原 特 異 的 なTh 細 胞 が 必 要 で あ る3)-9).我々 の 検 討 で は, B型 急 性 肝 炎 お よび劇 症 肝 炎10例 中4例 に お い てHBc抗 原 特 異 的Th 細 胞 が 検 出 さ れ,そ の 形 質 はIFN-γ を産 生 す るTh1 細 胞 で あ っ た.一 方, IL-4を 産 生 す るTh2細 胞 は 全 く 検 出 され なか っ た.こ の こ とは, Th1細 胞 がHBV感 染 に お け る ウ イ ル ス排 除 に重 要 な役 割 を 果 た して い る こ と が 細 胞 内 サ イ トカ イ ン染 色 と フ ロ ー サ イ トメ トリー を 用 い た方 法 で も示 さ れ た. こ の 方 法 を 用 い たB型 慢 性 肝 炎 症 例 に お け る免 疫 応 答 の 検 討 で は, HBe抗 原 陽 性, HBe抗 体 陽 性 に 関 わ らず, Th1細 胞 の 機 能 は低 下 して お り,ほ とん ど検 出 さ れ な か っ た13).この こ とは, B型 慢 性 肝 炎 例 に お い て はHBV抗 原 特 異 的 なTh細 胞 の 機 能 が低 下 して お り,こ の こ とが ウ イ ル ス を排 除 で きず キ ャ リア 状 態 が 続 く理 由 の ー つ で あ る こ と を示 唆 して い る.一 方, HBs抗 体 陽性 の 既 往 感 染 例 に お い て はHBc抗 原特 異 的Th細 胞 やCTLが 高 率 に検 出 さ れ る こ とか ら,ウ イ ル ス が 排 除 で きた 個 体 で はTh細 胞 やCTLの 機 能 が 良 好 で あ る こ とが 示 され た. HBVキ ャ リア に お け るHBVの 増 殖 抑 制 に は 抗 原 特 異 的 なCTLが 重 要 で あ る こ とが 明 らか に され て い る15),16). 急 性 肝 炎 に お い て もHBV特 異 的 なCTLが 検 出 さ れ る こ とが 報 告 され て い るが,今 回の 検 討 で は 末 梢 血 中 に は HBc抗 原 特 異 的 なCD8陽 性CTLは 検 出 で きな か った. こ の 原 因 のー つ と して,急 性 肝 炎 に お い て はCTLが 肝 臓 に 集 積 して お り,末 梢 血 中 に は 少 数 しか 存 在 しな い 可 能 性 が 考 え られ る. 最 近,四 量 体 化 し たHLAと 特 定 の ペ プ チ ドを蛍 光 標 識 し た もの と リン パ球 を 反 応 させ フ ロ ー サ イ トメ ト リー で 結 合 細 胞 を検 出 す る方 法 に よ り,抗 原 ペ プ チ ド特 異 的 なCTLを 検 出 可 能 とな っ て い る17)-19).こ の 方 法 で 急 性 肝 炎 に お い て抗 原 特 異 的 なCTLの 頻 度 は0.1-1.3%で あ る こ とが 示 され て お り,末 梢 血 中 で は 非 常 に 少 数 で あ る こ とが 示 唆 され て い る17).この こ とは我 々 使 用 し た方 法 で は,少 数 の 抗 原 特 異 的 なCTLを 検 出 す るに は 感 度 が 十 分 で な い 可 能 性 を示 唆 して い る.我 々 も現 在HLA-ペ プ チ ド四 量 体 を用 い た検 討 を行 っ て お り,今 後 急 性 肝 炎 や 慢 性 肝 炎 に お け る抗 原 特 異 的 なCTLの 動 態 を明 らか に した い と考 えて い る. 何 故B型 急性 肝 炎例 とB型 慢 性 肝 炎 例 に お い てTh1 細 胞 の 反 応 に 差 が あ るか につ い て 十 分 解 明 さ れ て い な い が,慢 性 肝 炎例 や キ ャ リア に お い て はHBVに 対 して 免 疫 学 的 寛 容 状 態 で あ る こ とが 推 察 され て い る3)-5).しか し, HBVキ ャ リア に 対 してHBs抗 原 に よ る ワ クチ ン療 法 を行 う と,ウ イ ル ス に 対 す る免 疫 応 答 が 回復 し,ウ イ ル ス 量 の 低 下,排 除 が 期 待 され る こ とが ヒ ト及 び実 験 動 物 に お い て報 告 さ れ て い る20),21).この 機 序 と して,免 疫 す る 図2 HBcAg刺 激 に よ る活 性 化CD4陽 性 リン パ球 率(%) 急性 肝 炎/劇 症 肝 炎 患 者 に お け るHBcAg特 異 的IFN-γ 産 生 は, 10例 中4例 が 陽 性 だ っ た.
156 鈴 木 貴 博 ル ー トや 抗 原 の 種 類 に よ り,免 疫 学 的 寛 容 か ら離 脱 し, 免 疫 応 答 が 回 復 す る こ とが 考 え られ る.特 に,抗 原 提 示 細 胞 と して 樹 状 細 胞 の 機 能 が 免 疫 応 答 の 調 節 に 重 要 で あ る こ とが 報 告 さ れ て お り, HBVに 対 す る免 疫 応 答 が 低 下 して い る個 体 に お い て も,樹 状 細 胞 を 始 め とす る免 疫 応 答 調 節 機 構 を刺 激 す る こ とで,ウ イ ル スに 対 す る免 疫 応 答 を 回復 させ,ウ イ ル ス の 複 製 抑 制,排 除 を惹 起 で き る こ と を示 唆 して い る22). 今 後, HBV抗 原 に 対 す る樹 状 細 胞 の機 能 を明 らか にす る 必 要 が あ る と共 に,樹 状 細 胞, Th細 胞, CTLの 活 性 化 を誘 導 す る こ と で, B型 慢 性 肝 炎 例 の 治 療 応 用 を検 討 す る必 要 が あ る. 結 論 B型 急 性 肝 炎 に お い てHBcAg特 異 的Th1細 胞 が 検 出 され, HBV感 染 に お け る ウ イ ル ス排 除 にTh1細 胞 が 重 要 な役 割 を 果 た して い る こ とが 示 さ れ た. 謝 辞 稿 を終 え るに あ た り,本研 究 にお いて 直接 の ご指 導 を賜 りま した 岡 山大 学 大 学 院 医 歯学 総 合 研 究 科 消化 器 ・肝 臓 ・感 染 症 内科 学(内 科 学 第一)辻 孝 夫教 授 及び 山 本 和秀 講 師 に心 か らの 謝 意 を表 します. ま た貴 重 な症 例 を提 供 して いただ い た倉 敷 中央 病 院 消化 器 内科 池 田 弘先 生,岡 山済 生 会 総 合病 院 内科 川 口光 彦先 生 に 感 謝 い た します. 本 論 文 の 要 旨は 第37回 日本 肝 臓 学会 総 会 に て 発表 した. 参 考 文 献
1) Tiollais P, Pourcel C and Dejean A: The hepatitis B virus. Nature (1985) 317, 489-495
2) Koziel MJ: The immunopathogenesis of HBV infection. Antivir Ther (1998) 3, 13-24
3) Chizari FV and Ferrari C: Hepatitis B virus immunopath. ogenesis. Annu Rev Immunol (1995) 13, 29-60
4) Guidotti LG, Ishikawa T, Hobbs MV, Matzke B, Schreiber R and Chisari FV: Intracellular inactivation of the hepatitis B virus by cytotoxic T lymphocytes. Immu nity (1996) 4, 25-36
5) Penna A, Chisari FV, Bertoletti A, Missale G, Fowler P, Giuberti T, Fiaccadori F and Ferrari C: Cytotoxic T lymphocyte recognize an HLA-A2-restricted epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid antigen. J Exp Med (1991) 174, 1565-1570
6) Jankovic D, Liu Z and Gause WC: Th1-and Th2-cell commitment during infectious disease: asymmetry in divergent pathways. Trend Immunol (2001) 22: 450-457 7) Swain SL, Bradley LM, Croft M, Tonkonogy S, Atkins G, Weiberg AD, Duncan DD, Hedrick SM, Dutton RW
and Huston G: Helper T-cell subsets: phenotype, func tion and the role of lymphokines in regulation their devel opment. Immunol Rev (1991) 123, 115-144
8) Kalams SA and Walker BD: The critical need for CD4 help in maintaining effective cytotoxic T lymphocyte responses. J Exp Med (1998) 188, 2199-2204
9) Ferrari C, Penna A, Bertoletti A, Cavalli A, Missale G, Lamonaca V, Boni C, Valli A, Bertoni R, Urbani S and Scognamiglio P: Antiviral cell-mediated immune responses during hepatitis B and hepatitis C virus infec
tions. Recent Results Cancer Res (1998) 154, 330-336 10) Ferrari C, Penna A, Bertoletti A, Valli A, Antoni AD,
Giuberti T, Cavalli A, Petit MA and Fiaccadori F: Cellular immune response to hepatitis B virus-encoded antigens in acute and chronic hepatitis B virus infection. J
Immunol (1990) 145, 3442-3449
11) Inoue M, Kakumu S, Yoshioka K, Tsutsumi Y, Wakita T and Arao M: Hepatitis B core antigen-specific IFN-gamma production of peripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis B infection. J Immunol (1989) 142, 4006-4011
12) Lohr HF, Gerken G, Schlicht HJ, Meyer zum Buschenfel de K-H and Fleischer B: Low frequency of cytotoxic liver-infiltrating T lymphocytes specific for endogenous processed surface and core proteins in chronic hepatitis B. J Infect Dis (1993) 168, 1133-1139
13) Matsumura S, Yamamoto K, Shimada N, Okano N, Okamoto R, Suzuki T, Hakoda T, Mizuno M, Higashi T and Tsuji T: High frequency of circulating HBcAg
specific CD8 T cells in hepatitis B infection: a flow cytometric analysis. Clin Exp Immunol (2001) 124,
435-444
14) 植 村 一 幸, 清 澤 研 道: B型 急 性 肝 炎 の 治 療 と 予 後. 日 本 臨 床 (1995) 53, 1995年 増 刊 号 下 巻, 444-449
15) Shu PY, Chang C, Hwang LH and Hu CP: Proliferative and cytotoxic T-cell clones recognize endogenously synthesized HBcAg in an asymptomatic HBsAg carrier. Hepatology (1993) 18, 275-283
16) Lee HG, Lim JS, Lee KY, Choi YK, Choe IS, Chung TW and Kim K: Peptide-specific CTL induction in HBV-ser opositive PBMC by stimulation with peptides in vitro: novel epitopes identified from chronic carriers. Virus Res
(1997) 50, 185-194
17) Maini MK, Boni C, Ogg GS, King AS, Reignat S, Lee CK, Larrubia JR, Webster GJM, McMichael AJ, Ferrari C, Williams R, Vergani D and Bertoletti A: Direct ex vivo analysis of hepatitis B virus-specific CD8+ T cells associated with the control of infection. Gastroenterol
(1999) 117, 1386-1396
GS, King AS, Herberg J, Gilson R, Alisa A, Williams R, Vergani D, Naoumov NV, Ferrari C and Bertoletti A: The role of virus-specific CD8 + cells in the liver damage and viral control during persistant hepatitis B virus infec tion. J Exp Med (2000) 191, 1269-1280
19) Maini MK, Reignat S. Boni C, Ogg GS, King AS, Malacarne F, Webster GJM and Bertoletti A: T cell receptor usage of virus-specific CD8 cells and recognition of viral mutation during acute and persistent hepatitis B virus infection. Eur J Immunol (2000) 30, 3067-3078 20) Akbar SM, Abe M, Masumoto T, Horiike N and Onji
M: Mechanism of action of vaccine therapy in murine
hepatitis B virus carriers: vaccine-induced activation of antigen presenting dendritic cells. J Hepatol (1999) 30, 755-764
21) Pol S, Nalpas B, Driss F, Michel ML, Tiollais P, Denis J and Brecho C: Multicenter study group: Efficacy and limitations of a specific immunotherapy in chronic hepati tis B. J Hepatol (2001) 34, 917-921
22) Shimizu Y, Guidotti LG, Fowler P and Chisari FV: Dendritic cell immunization breaks cytotoxic T lymphocyte tolerance in hepatitis B virus transgenic mice. J Immunol (1998) 161, 4520-4529
158 鈴 木 貴 博
Flowcytometric analysis of HBcAg-specific lymphocyte reaction in acute hepatitis B
Takahiro SUZUKI
Department of Medicine and Medical Science, Okayama University Graduate School of Medicine and Dentistry
Okayama 700-8558, Japan (Director: Prof. T. Tsuji)
Antigen specific T-cell responses are important for the eradication of Hepatitis B virus (HBV) in acute infection. Flow cytometric analysis of intracellular cytokines is a simple method for studying the T-cell response at the single-cell level in a short period of time. In the present study, we invesfisated the hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell response using flow cytometry. Eight patients with acute hepatitis B and 2 patients with fulminant hepatitis B were studied. Heparinized peripheral blood was incubated with recombinant HB core antigen (HBcAg), and intracytoplasmic cytokines were analyzed by flow cytometry. HBcAg-specific interferon-gamma positive CD4 T-cells were positive in 4 of 10 patients while HBcAg-specific interferon-gamma positive CD8 T-cells and interleukin-4 positive T-cells were negative in all patients. No intracytoplasmic cytokines were demonstrated in healthy subjects
or with recombinant hepatitis C virus (HCV) antigens. HBcAg-specific CD4 T-cells could be detected by a sensitive flow cytometric analysis of the peripheral blood and the cytokine profile of these cells was Thl. These results suggest that HBcAg-specific Th1-type CD4 T-cells may play an important role in controlling viral clearance during acute HBV infection.
