マニュアル参考様式 Ver.1 食 品 中 の 健 康 機 能 性 成 分 の 分 析 法 マ ニ ュ ア ル 平 成 22年 3月 作 成
四 国 地 域 イ ノ ベ ー シ ョ ン 創 出 協 議 会
地 域 食 品 ･健 康 分 科 会 編
[email protected] ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― 裸 麦 の β － グ ル カ ン 作 成 者 ： 愛 媛 県 産 業 技 術 研 究 所 食 品 産 業 技 術 セ ン タ ー 主 任 研 究 員 森 本 聡 主 任 研 究 員 大 野 一 仁 １ .裸 麦 に つ い て １ ． １ 概 要 愛 媛 県 で は 、 裸 麦 の 生 産 が 盛 ん に 行 わ れ て お り そ の 生 産 量 は 日 本 一 を 誇 っ て い る 。 裸 麦 は 大 麦 の 一 種 で 、 大 麦 は ビ ー ル や し ょ う ち ゅ う の 原 料 と な る 二 条 大 麦 と 麦 茶 や 押 し 麦 （ 麦 飯 ） 、 麦 み そ の 原 料 と な る 六 条 大 麦 が あ り 、 こ の 中 で さ ら に 皮 麦 と 裸 麦 に 分 類 さ れ る 。 ま た 、 裸 麦 は 比 較 的 耐 寒 性 が 弱 い の で 、 四 国 ・ 中 国 ・ 九 州 な ど 瀬 戸 内 地 方 を 中 心 と し た 比 較 的 温 暖 で 降 水 量 の 少 な い 地 域 で の 栽 培 が 多 く 、 六 条 大 麦 の 栽 培 は 関 東 以 北 に 多 い の が 特 徴 で あ る 。 １ ． ２ 食 品 あ る い は 含 有 成 分 の 機 能 性 β － グ ル カ ン は 、 免 疫 力 や 抵 抗 力 を 高 め る 作 用 と 体 内 の が ん 細 胞 や 感 染 細 胞 を 攻 撃 し た り す る 作 用 が あ る と い わ れ て い る 。 健 康 食 品 に お い て 、 β － グ ル カ ン と い え ば 、 β -(1→ 3)-D-グ ル カ ン と い う タ イ プ の β － グ ル カ ン が 免 疫 賦 活 作 用 や ガ ン に 対 す る 予 防 効 果 、 抑 制 効 果 な ど の 効 能 が 認 め ら れ て お り 、 一 般 に β － グ ル カ ン と は こ の 種 類 を 指 し ま す 。 一 般 の 人 が 免 疫 賦 活 作 用 や 抗 が ん 作 用 を 示 す キ ノ コ 類 の 有 効 成 分 と 答 え る ほ ど 知 名 度 は 高 い 。免 疫 力 の 向 上 に よ り 、ア レ ル ギ ー 反 応 の 沈 静 化 、血 糖 値 を 下 げ る 、 血 圧 を 抑 え る 、 腸 を 刺 激 し て 便 通 を よ く す る 作 用 、 コ レ ス テ ロ ー ル 値 を 低 下 さ せ る 働 き な ど が あ る と さ れ て い る 。 ま た 、 愛 媛 県 に お い て は 県 産 裸 麦 を 主 原 料 と し て 用 い た 「 麦 み そ 」 の 生 産 が 盛 ん で あ り 、麹 歩 合 が 高 い 甘 口 の み そ と し て 特 徴 あ る も の と な っ て い る 。加 え て 愛 媛 県 で は 、 こ だ わ り の 製 法 で 醸 造 さ れ た 良 質 な 麦 み そ を 「 愛 あ る ブ ラ ン ド 産 品 」 と し て 認 定 し て い る 。 あ わ せ て 、 こ の 裸 麦 を パ ン や ケ ー キ の 原 材 料 の 一 部 と し て 用 い 、 特 色 の あ る 加 工 食 品 が 各 地 で 販 売 さ れ て い る 。マニュアル参考様式 Ver.1 裸 麦 栽 培 の 様 子 裸 麦 を 使 っ た 加 工 食 品 （ 試 作 品 ） （ 食 パ ン 、 ク ッ キ ー 、 餅 菓 子 な ど ） 写 真 １ － １ 裸 麦 お よ び 加 工 食 品 １ ． ２ ． １ β － グ ル カ ン 類 を 含 む 食 品 キ ノ コ 類 に は 、ア ガ リ ク ス 茸 、ま い た け (舞 茸 ) 、干 し 椎 茸 、し め じ 、ハ ナ ビ ラ タ ケ 、 メ シ マ コ ブ 、カ バ ノ ア ナ タ ケ な ど が あ る 。酵 母 類 に は 、パ ン 酵 母 、黒 酵 母 、オ ー ツ 麦 、 大 麦 な ど が あ る 。 海 藻 類 に は 、 フ コ イ ダ ン な ど が あ る 。 ２ ． β － グ ル カ ン に つ い て の 説 明 グ ル カ ン と は 、 D 一 グ ル コ ー ス が グ リ コ シ ド 結 合 で つ な が っ た ポ リ マ ー で あ る 。 一 つ の グ ル カ ン の 中 に 二 つ の 結 合 様 式 が 混 在 す る こ と は あ る が 、 α 型 と β 型 が 混 在 す る こ と は な く 、 そ れ ぞ れ α 一 グ ル カ ン 、 β 一 グ ル カ ン と い わ れ て い る 。 天 然 に 最 も 多 く 存 在 す る 多 糖 類 で あ る 。 ３ . 定 量 分 析 の 方 法 に つ い て 大 麦 、 小 麦 等 穀 物 中 に 含 ま れ る (1,3)(1,4)β － グ ル カ ン の 測 定 に 多 用 さ れ て い る 分 析 法 は 、 酵 素 を 用 い た McCleary 法 と 呼 ば れ 比 較 的 簡 単 に 測 定 が 可 能 で あ る 。 こ の 分 析 法 は AACC(American Association of Clinical Chemists)、EBC(European Brewing Convention)、 AOAC(Association of Official Chemists)、 RACI(Royal Australian Chemical Institute)標 準 法 等 で 認 め ら れ て い る 。
β － グ ル カ ン 量 は 試 料 を 粉 砕 し た の ち 緩 衝 液 で 懸 濁 、 リ ケ ナ ー ゼ を 反 応 さ せ て β － グ ル コ オ リ ゴ 糖 に 分 解 、 さ ら に β － グ ル コ シ ダ ー ゼ を 作 用 さ せ 生 成 し た グ ル コ ー ス 量 を 測 定 し 計 算 に よ り 算 出 さ れ る 。 酵 素 法 を 用 い る β － グ ル カ ン 量 の 測 定 方 法 に つ い て 述 べ る 。
マニュアル参考様式 Ver.1 ３ ． １ 準 備 す る 器 具 な ど １ ． 電 子 天 秤 （ 0.1mg が 精 秤 で き る も の ） ２ ． 電 子 天 秤 （ 200g 以 上 が 精 秤 で き る も の ） ３ ． 薬 さ じ ４ ． ビ ー カ ー ５ ． メ ス シ リ ン ダ ー ６ ． メ ス フ ラ ス コ ７ ． ふ る い （ 0.5mm） ８ ． ｐ Ｈ 計 ９ ．マ イ ク ロ ピ ペ ッ ト（ 5ml、1ml、0.2ml 容 量 可 変 の も の ）お よ び ピ ペ ッ ト チ ッ プ １ ０ ． コ ニ カ ル チ ュ ー ブ （ 15ml 容 、 耐 熱 性 の あ る も の ） １ １ ． 恒 温 水 槽 （ 40℃ で 保 持 可 能 、 振 と う 機 能 が あ る と ベ タ ー ） １ ２ ． 恒 温 水 槽 も し く は ガ ス コ ン ロ （ 100℃ 、 沸 騰 し た ま ま 保 持 可 能 ） １ ３ ． ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー １ ４ ． 遠 心 分 離 機 （ 1,000
g
） １ ５ ． ス ト ッ プ ウ ォ ッ チ １ ６ ． マ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー １ ７ ． ク ラ ッ シ ュ ア イ ス １ ８ ． 分 光 光 度 計 （ 510nm で の 測 定 が 可 能 な も の ） １ ９ ． キ ュ ベ ッ ト （ 光 路 長 10mm） ２ ０ ． 穀 物 粉 砕 用 ミ ル [試 薬 ] １ ． 99.5%エ タ ノ ー ル (試 薬 特 級 ) ２ ． リ ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム （ 二 水 和 物 M.W 156.01） （ 試 薬 特 級 ） ３ ． リ ン 酸 水 素 二 ナ ト リ ウ ム （ 12 水 和 物 M.W 358.14） （ 試 薬 特 級 ） ４ ． 酢 酸 (試 薬 特 級 ) ５ ． 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム （ 無 水 ） （ 試 薬 特 級 ） ６ ． 蒸 留 水７ ． β － グ ル カ ン 測 定 キ ッ ト （ MIXED LINKAGE BETA-GLUCAN ASSY KIT） (日 本 バ イ オ コ ン 株 式 会 社 製 ) （ リ ケ ナ ー ゼ 溶 液 、 β － グ ル コ シ ダ ー ゼ 溶 液 、 グ ル コ ー ス 測 定 試 薬 、 グ ル コ ー ス 試 薬 緩 衝 液 、 標 準 グ ル コ ー ス 溶 液 、 標 準 大 麦 粉 繊 維 、 標 準 オ ー ツ 麦 繊 維 ） ３ ． ２ 試 薬 の 調 製 １ ． エ タ ノ ー ル 水 溶 液 （ 50% V/V） 99.5%エ タ ノ ー ル 50ml と 蒸 留 水 50ml を 混 合 す る 。 ２ ． 20mM リ ン 酸 緩 衝 液 （ pH6.5） 20mM リ ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム 溶 液 （ 3.12g/l） と 20mM リ ン 酸 水 素 二 ナ ト リ ウ
マニュアル参考様式 Ver.1 ム 溶 液 (7.16g/L)を 約 7:3 の 割 合 で 混 合 、 pH が 6.5 と な る よ う 調 整 す る 。 ３ ． 0.2M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液 （ pH4.0） 蒸 留 水 約 900ml に 11.6ml の 酢 酸 を 加 え 混 合 、 2M 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム 溶 液 （ 8.0g/l） で pH4.0 に 調 整 し た の ち 1L に メ ス ア ッ プ す る 。 ４ ． 50mM 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液 （ pH4.0） 蒸 留 水 約 900ml に 2.9ml の 酢 酸 を 加 え 混 合 、1M 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム 溶 液（ 4.0g/l） で pH4.0 に 調 整 し た の ち 1l に メ ス ア ッ プ す る 。 ５ ． β ― グ ル カ ン 測 定 キ ッ ト （ ボ ト ル １ ） リ ケ ナ ー ゼ 試 薬 ２ を 加 え て 20ml と す る 。 100 検 体 分 と な る た め 、 当 日 必 要 で な い も の は 小 分 け に し 、 -20℃ で 凍 結 保 存 し 要 時 解 凍 し て 使 用 。 （ -20℃ で 2 年 以 上 安 定 ） 【 溶 液 １ 】 （ ボ ト ル ２ ） β － グ ル コ シ ダ ー ゼ 試 薬 ４ を 加 え て 20ml と す る 。 100 検 体 分 と な る た め 、 当 日 必 要 で な い も の は 小 分 け に し 、 -20℃ で 凍 結 保 存 し 要 時 解 凍 し て 使 用 。 （ -20℃ で 2 年 以 上 安 定 ） 【 溶 液 ２ 】 （ ボ ト ル ３ ） グ ル コ ー ス オ キ シ ダ ー ゼ ・ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 緩 衝 液 蒸 留 水 を 加 え て 1L と す る 。 ボ ト ル ４ の 酵 素 溶 解 に 使 用 。 【 溶 液 ３ 】 （ ボ ト ル ４ ） グ ル コ ー ス オ キ シ ダ ー ゼ ・ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 溶 液 ３ を 加 え 、 凍 結 乾 燥 物 を 溶 解 さ せ 1L の 酵 素 溶 液 と す る 。 （ 遮 光 ガ ラ ス 瓶 も し く は 、 ア ル ミ ニ ウ ム 箔 で 遮 光 し て 冷 蔵 保 存 、 2～ 5℃ で 3 ヶ 月 間 安 定 ） 【 溶 液 ４ 】 （ ボ ト ル ５ ） グ ル コ ー ス 標 準 液 （ 1.0mg/ml） （ ボ ト ル ６ ） 標 準 大 麦 粉 （ ボ ト ル ７ ） 標 準 オ ー ツ 麦 ３ ． ３ 分 析 用 試 料 の 前 処 理 ・ 調 整 方 法 お よ び 分 析 方 法 （ １ ） 試 料 を 粉 砕 用 ミ ル 等 を 用 い 粉 砕 し 0.5mm 以 下 に す る 。 （ ２ ） コ ニ カ ル チ ュ ー ブ に 約 100mg を 精 秤 す る 。 （ ３ ） 0.2ml の エ タ ノ ー ル 水 溶 液 （ 50% V/V） を 加 え 試 料 を 分 散 さ せ 、 さ ら に 20mM リ ン 酸 緩 衝 液 （ pH6.5） を 4.0ml 加 え し っ か り と 栓 を し て 、 ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー を 用 い て よ く 攪 拌 す る 。 （ ４ ） 直 ち に チ ュ ー ブ を 沸 騰 水 浴 中 に 入 れ 60 秒 間 保 持 し た 後 ボ ル テ ッ ク ス で 攪 拌 、 再 度 沸 騰 水 浴 中 で 2 分 間 保 持 す る 。 （ ５ ） チ ュ ー ブ を 40℃ 恒 温 水 槽 に 入 れ 保 温 し た 後 、 酵 素 溶 液 【 溶 液 １ 】 を 0.2ml 加 え ボ ル テ ッ ク ス で 混 合 。 40℃ 恒 温 水 槽 に て 1 時 間 保 持 す る 。 （ 適 宜 攪 拌 す る ） （ ６ ） 0.2M 酢 酸 緩 衝 液 （ pH4.0） を 5.0ml 加 え 混 合 し 室 温 ま で 冷 却 す る 。 （ ７ ） 遠 心 分 離 （ 1,000
g
、 10min） し 、 上 清 を 0.1ml ず つ 3 本 の コ ニ カ ル チ ュ ー ブ にマニュアル参考様式 Ver.1 分 注 す る 。 （ ８ ） β － グ ル コ シ ダ ー ゼ（ 50mM 酢 酸 緩 衝 液 、pH4.0）溶 液【 溶 液 ２ 】を 0.1ml 加 え る 。 こ の 時 、 酵 素 溶 液 を 2 本 の チ ュ ー ブ に 入 れ （ 反 応 用 ） 、 残 り の 1 本 （ ブ ラ ン ク ） に は 酢 酸 緩 衝 液 （ 試 薬 ４ ） の み を 加 え る 。 （ ９ ） 40℃ で 10 分 間 反 応 さ せ る 。 （ １ ０ ） グ ル コ ー ス オ キ シ ダ ー ゼ ・ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 混 合 試 薬 【 溶 液 ４ 】 を 3.0ml ず つ 3 本 の コ ニ カ ル チ ュ ー ブ に そ れ ぞ れ 加 え 、 40℃ で 20 分 間 反 応 さ せ る 。 （ １ １ ） 室 温 に 冷 却 し 、 1 時 間 以 内 に 分 光 光 度 計 を 用 い て 510nm の 吸 光 度 を 測 定 す る 。 （ １ ２ ） 以 下 に よ り Ｄ － グ ル コ ー ス の 検 量 線 の 作 成 を 行 う 。 ① ② ③ Ｄ － グ ル コ ー ス 標 準 液 （ 1.0mg/ml） 0.00ml 0.05ml 0.10ml 酢 酸 緩 衝 液 （ pH4.0） 0.10ml 0.05ml 0.00ml 蒸 留 水 0.10ml 0.10ml 0.10ml GOD・ POD 混 合 試 薬 【 溶 液 ４ 】 3.00ml 3.00ml 3.00ml ４ ． 分 析 例 と 定 量 分 析 結 果 ４ ． １ 分 光 光 度 計 に よ る 分 析 例 β － グ ル カ ン の 定 量 に は 標 準 溶 液 を 用 い て 作 成 し た Ｄ － グ ル コ ー ス の 検 量 線 か ら 濃 度 を 算 出 す る 。 以 下 に 典 型 的 な 検 量 線 を 示 す 。 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 20 40 60 80 100 120 グルコース濃度（μg/ml） 吸光 度OD51 0nm 図 ４ ． １ － １ Ｄ － グ ル コ ー ス の 検 量 線 ４ ． ２ 計 算 式 β － グ ル カ ン （ g/100g） ＝ Δ Ａ ×Ｆ ×94×(1/1000)×(100/Ｗ )×(162/180) ＝ Δ Ａ ×8.46×Ｆ ／ Ｗ Δ Ａ ： サ ン プ ル の 吸 光 度 － ブ ラ ン ク の 吸 光 度
マニュアル参考様式 Ver.1 Ｆ ： 100／ （ グ ル コ ー ス ス タ ン ダ ー ド の 吸 光 度 － 試 薬 ブ ラ ン ク の 吸 光 度 ） ９ ４ ： 総 液 量 Ｗ ： 試 料 の 乾 燥 重 量 （ mg） ５ ． 食 品 の 分 析 結 果 例 上 記 手 法 を 用 い て 、 大 麦 の 一 種 で あ る 「 裸 麦 」 と 裸 麦 を 原 料 と し て 用 い た 食 品 中 の β － グ ル カ ン の 定 量 分 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 を 下 記 に 示 す 。 表 ５ － １ 裸 麦 と 裸 麦 利 用 食 品 の β － グ ル カ ン 含 量 試料名 β-グルカン含量(g/100g) マンネンボシ（裸麦品種）
4.8
イチバンボシ（裸麦品種）4.2
パン※1.6
クッキー※2.5
※原料の一部に裸麦を使用 ６ ． 分 析 上 の 留 意 、 注 意 点 １ ．分 析 方 法（ ４ ）に お い て 沸 騰 水 浴 中 で 加 熱 を 行 う 際 、混 合 が 不 十 分 で あ る と「 ダ マ 」 が 生 じ る こ と で 均 一 な 溶 液 と な ら ず 、 分 析 結 果 に ば ら つ き が 生 じ る た め 、 溶 液 に 均 一 に 分 散 す る よ う に 気 を つ け る こ と 。 ２ ． 麦 を 含 む 食 品 （ パ ン な ど ） に 含 ま れ る β － グ ル カ ン を 分 析 す る 際 に は 、 油 脂 分 を 前 処 理 に よ っ て 除 く 必 要 が あ る 。 ま た 、 麦 の 含 量 が 少 な い 時 な ど 検 量 線 か ら 外 れ る 際 に は 適 宜 液 量 を 変 更 す る と 良 い 。 ７ ． そ の 他 特 に な し 。 ８ ． 定 量 法 に 関 す る 引 用 ・ 参 考 文 献１ ． McCleary,B.V.and Codd,R(1991). Measurement of (1-3)(1-4)-β -D-glucan in barley and oats:a streamlined enzymic procedure.
