Microsoft PowerPoint - 藤田保険衛生大学

質量分析セミナー

MALDI-TOF MS

autoflex III LRF

韮澤 崇

MALDI

M

atrix

A

ssisted

L

aser

D

esorption /

I

onization

MatrixとSampleの

混合結晶

H+

脱離および

イオン化（プロトン化）

LASER

LASERによる

Matrixの励起

ソフトなイオン化

多価イオンを生成しづらい

MALDIの基本原理

M+

m+

P1

G

E=

mv

2

_=Uz

t

～

m/z

1

2

t (



s)

m

M

Laser

detector

drift region

ion source

20kV

TOF-MSの基本原理

イオンの飛行速度： おおよそ数

10km/秒（マッハ100以上）

高感度測定用サンプルターゲットプレート

Principle of AnchorChip

TM

Sample Preparation

AnchorChip

Dried Droplet

Size Comparison:

Dried Droplet vs. AnchorChip

TM

2 mm

Matrix: 2,5-DHB

Peptide Mix on

AnchorChip

TM

_vs.

_{Dried Droplet}

Matrix: -HCCA Anchor Diameter: 400m

1400

1900

2400

2900

m/z

1400

1900

2400

2900

m/z

1400

1900

2400

2900

m/z

10 fmol

1400

1900

2400

2900

m/z

1 fmol

1400

1900

2400

2900

m/z

100 amol

10 amol

5 amol

In-Gel Digest: Anchorchip Preparation

同一条件による比較

•

分子量の測定

タンパク質、ＤＮＡ、低分子、合成高分子

•

タンパク質の同定

（電気泳動で分離精製）

ＰＭＦ

/ＰＦＦ

•

未知タンパク質の配列解析（トップダウン解析

ISD）

アプリケーション

分子量の測定

Matrix: SA Positive Linear mode

-globin

-globin

_{-globin：}

６

_Glu→Val

コード：

_GAG→GUG

-30

IgG 150kDa in SA matrix;

Positive Linear mode

0

2000

4000

6000

8000

In

te

n

s

.

[a

.u

.]

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

m/z

[M+H]

+

[M+2H]

2+

DNA測定例

9192

6118

0.0

0.5

1.0

1.5

4

x10

In

te

n

s

. [

a

.u

.]

5000

6000

7000

8000

9000

1000 0

m /z

DNA 20mer

DNA 30mer

DNA測定例

7694

15395

* 50mer_GP2\0_G6\1\1SLin

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

4

x10

In

te

n

s.

[a

.u

.]

21839

11026

7431

* 70mer_GP2\0_H6\1\1SLin

0.0

0.5

1.0

1.5

4

x10

In

te

ns

. [

a.u

.]

30101

10246

15120

* 99mer_GP2\0_G8\1\1SLin

1

2

3

4

x10

In

te

ns

. [

a

.u

.]

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

m/z

50mer

70mer

99mer

484.244

462.280

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

4

x10

In

te

n

s

.

[a

.u

.]

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

分子量の測定

possibly fatty acid moiety

possibly sugar moiety

分子量の測定

MS/MS スペクトル

1199.773290

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

4

x10

In

te

ns

.

[a

.u

.]

1060

1080

1100

1120

1140

1160

1 180

1200

1220

1240

m/z

元素組成解析

分子量の測定

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

a.i.

Matrix：Dithranol

複雑な多成分系からなる混合物の同定

↓

分子量

↓

構成パターン

Polymer解析

2600

2700

2800

2900

3000

3100

m/z

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

9

x10

Intens.

PPG

PPG

PPG

PPG

PPG

PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG

PS

PS

PS

PS

PS

PS

タンパク質の同定

分離精製方法の違いにより同定までのプロトコ

ルが異なる

2次元電気泳動での分離精製後のサンプルは

MALDI-TOF MSが用いられる

m1

m2

m3

m/z

切り出し

消化

抽出

調製

MALDI

ピークリスト

m1

m2

m3

データベース検索

（

biotools/Mascot）

2D-PAGE

レーザー

（＊

MascotはMatrix Science社製）

タンパク質の同定

Protein Identification

PMF

2000.0

2500.0

3000.0

3500.0

4000.0

4500.0

5000.0

2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0

～

Biotools & MASCOT～

酵素消化物スペクトルからMASCOT PMF Searchへ

Biotools

software

MASCOT

search

スポット

2 PMF

タンパク質の同定

Combined LIFT（MS/MS) Search

4つのPSD MS/MSスペクトルを

コンバインすると・・・

ウシのアルブミンがヒット・・・しかも高スコア

アミノ酸配列（候補）を算出

Kが修飾されているとすると・・・良く一致

・・・よって修飾は

N端ではなくKに存在と判定

N端が修飾されているとすると・・・Kから先が一致せず

・・・よって修飾は

N端ではなくKに存在と判定

Ion Source

Sample Target

Precursor

Ion Selector

(PCIS)

Source 2

(LIFT)

Collision

Cell

Gridless DE

MALDI Source

LID/T³

CID

ISD

未知タンパク質の配列解析

ISD ( In Source Decay) – フラグメントイオンの種類 –

C-ion series

Y-ion series

H

₂

N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH

R

₁

R

₂

R

₃

R

₄

a

₁

b

₁

c

₁

a

₂

b

₂

c

₂

a

₃

b

₃

c

₃

x

₃

y

₃

z

₃

x

₂

y

₂

z

₂

x

₁

y

₁

z

₁

ISD

C

-末端イオン

N

-末端イオン

Fohlmann et al. (1988) IJMSIP 86, 137

-C

N

H

R1

N

H

N

H

N

H

O

R2

O

O

R3

N

H

R4

O

c

i

c

i+1

c

i+2

c

i+3

N-ISD

ca. 1.5-12kD

N

H

R1

N

H

N

H

N

H

O

R2

O

O

R3

N

H

R4

O

y

i+3

y

i+2

_y

i+1

_y

i

ISD

ca. 1.5-12kD

＊

ISDではc-およびy-ionが特徴的に観測される

T

3

_{-sequencing（Terminus analysis by TOF/TOF)}

N

C

Protein Sequence

N

C

ISD fragmentation

1

4kDa

1kDa

4

c-ion

y-ion

Invisible due to matrix peaks

Invisible due to matrix peaks

T

3

_-sequencing

(ISD+LIFT)

N

N

C

C

C-terminal peptides

N-terminal peptides

ISDはintactのタンパクから直接シークエンスに関する情報を得ることができる、

優れた手法であるが、末端部分（低分子量領域）についてはマトリックス由来の

ピーク群に隠されてしまうために、情報が得られない。

T

3

_{-sequencingはそれを補うためのもので、ISDとLIFT（TOF/TOFによるMS/MS測定）}

を組み合わせた

MS/MS/MS的な測定手法である。

ISDによって生成したc-ionもしくはy-ionを選択し、そのMS/MSを行うことで末端部分

のシークエンス解析が可能になる。

未知タンパク質の配列解析

66

431

13

25

49

33295

19847

0

0

2000

4000

6000

8000

In

te

n

s

.

[a

.u

.]

50000

100000

150000

200000

250000

m/z

BSA 66kDa

未知タンパク質の配列解析

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 Abs. Int. * 1000 c A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T G C E K S 828.424 c 7 899.441 c 8 1036.498 c 9 1192.612 c 10 1339.688 c 11 1467.782 c 12 1582.816 c 13 1695.902 c 14 1752.927 c 15 1881.974 c 16 2011.008 c 17 2148.069 c 18 2295.152 c 19 2423.219 c 20 2480.255 c 21 2593.325 c 22 2692.398 c 23 2805.474 c 24 2918.552 c 25 2989.576 c 26 3136.630 c 27 3223.651 c 28 3351.694 c 29 3514.744 c 30 3627.812 c 31 3755.851 c 32 3883.905 c 33 3986.893 c 34 4083.927 c 35 4230.953 c 36 4345.987 c 37 4475.009 c 38 4612.044 c 39 4711.090 c 40 4839.162 c 41 4952.178 c 42 5051.279 c 43 5165.283 c 44 5294.316 c 45 5407.398 c 46 5508.402 c 47 5637.420 c 48 5784.453 c 49 5855.513 c 50 5984.328 c 51 6085.513 c 52 6897.785 c 60 6954.781 c 61 7057.730 c 62 7186.657 c 63 7314.788 c 64 7401.817 c 65

D T H K S E I A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T C V A D E S H A G C E K S L H

Ion 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67

c

D T H K S E

I A H R F K D L G E E H F K G L V L

I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T

C V A D E S H

A G C E K S

L H

y

D T H K S E

I A H R F K D L G E E H F K G L V L

I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T C V A D E S H A G C E K S L H

76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10

BSA 66kDa reISD

Mb 0:C2 MS Raw

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4

x10

In

te

ns

.

[a

.u

.]

Mb-K45He 0:C1 MS Raw

0

2000

4000

6000

In

te

n

s.

[a

.u

.]

15000

16000

17000

18000

19000

20000

reISDによる修飾部位解析

Protein A

Protein A+mod??

reISD !!!

reISDによる修飾部位解析

m/z 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 20 40 60 80 100 120 Abs. Int. * 1000 c N V W G K V E A D I A G H G Q E V L I R L F T G H P E T L E K F D K F K H L K T E A E M K A S E y I D N R F L E L A K T M A G Q A D A G F D G P H K S H L V H I I A D S I F E L Y K I P I K H K T A c 11 y 11 c 12 y 12 c 13 y 13 c 14 y 14 c 15 y 15 c 16 y 16 c 17 y 17 c 18 y 18 c 19 y 19 c 20 y 20 c 21 y 21 c 22 y 22 c 23 y 23 c 24 y 24 c 25 y 25 c 26 y 26 c 27 y 27 c 28 y 28 c 29 y 29 c 30 y 30 c 31 y 31 c 32 y 32 c 33 y 33 c 34 y 34 c 35 y 35 c 36 y 36 c 37 y 37 c 38 y 38 c 39 y 39 c 40 y 40 c 41 y 41 c 42 y 42 c 43 y 43 c 44 y 44 c 45 y 45 c 46 y 46 c 47 y 47 c 48 y 48 c 49 y 49 c 50 y 50 c 51 y 51 c 52 y 52 c 53 y 53 c 54 y 54 c 55 y 55 c 56 y 56 _{c 57} y 57 c 58 y 58 c 59 y 59 y 60 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Abs. Int. * 1000 c N V W G K V E A D I A G H G Q E V L I R L F T G H P E T L E K F D K* F K H L K T E A E M K A S E y I D N R F L E L A K T M A G Q A D A G F D G P H K S H L V H I I A D S I F E L Y K I P I K H K T A H S Q A L P c 11 y 11 c 12 y 12 c 13 y 13 c 14 y 14 c 15 y 15 c 16 y 16 c 17 y 17 c 18 y 18 c 19 y 19 c 20 y 20 c 21 y 21 c 22 y 22 c 23 y 23 c 24 y 24 c 25 y 25 c 26 y 26 c 27 y 27 c 28 y 28 c 29 y 29 c 30 y 30 c 31 y 31 c 32 y 32 c 33 y 33 c 34 y 34 c 35 y 35 c 36 y 36 c 37 y 37 c 38 y 38 c 39 y 39 c 40 y 40 c 41 y 41 c 42 y 42 c 43 y 43 c 44 y 44 c 45 y 45 c 46 y 46 c 47 y 47 c 48 y 48 c 49 y 49 c 50 y 50 c 51 y 51 c 52 y 52 c 53 y 53 c 54 y 54 c 55 y 55 c 56 y 56 c 57 y 57 c 58 y 58 c 59 y 59 y 60 y 61 y 62 y 63 y 64 y 65 y 66

4802.516

4917.527

_5192.656

5045.607

5320.722

K

F

H

D

K

F

Mb-ISD 0:H2 MS Raw

1

2

3

4

x10

In

te

n

s.

[a

.u

.]

4765.613

5131.926

4802.600

4880.620

4917.625

_5278.962

5356.777

F

D

Mb-K45He-ISD 0:F2 MS Raw

1

2

3

4

5

4

x10

In

te

n

s.

[a

.u

.]

4700

4800

4900

5000

5100

5200

5300

5400

AA43

AA44

AA45

AA46

AA47

AA48

AA43

AA44

AA45+Mod!!!

reISDによるＤＮＡ配列解析

98

33

27

00

30

30

46

37

24

91

20

80

34

15

49

67

52

56

372

9

4

348

1

790

40

34

11

71

94

6

589

0

322

6

14

85

96

99

3

845

55

06

50

82

97

36

23

17

71

11

258

8

65

08

22

77

₂₈

96

6

124

22

00

47

76

68

22

₉₅

03

4

486

77

30

48

51

74

41

79

79

82

83

89

03

85

96

92

15

T

A

T

G

G

T

A

T

A

G

G

T

A

T

A

C

G

C

G

T

A

T

A

T

A

T

G

G

T

A

T

A

G

G

T

A

T

A

C

G

C

G

T

A

T

A

C

C

C

C

C

C

C

C

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5

x10

In

te

n

s.

[

a

.u

.]

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

www.bruker.com

ブルカー・

ダルトニクス

株式会社

●

本社 営業部

〒221-0022横浜市神奈川区守屋町3-9

TEL: 045-440-0471

FAX: 045-453-1827

営業担当：志村 信之

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アプリケーション

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