ADAM19 発現における電気刺激効果の機構解明

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(1)理学療法学第 188 43 巻第 2 号 188 ∼ 189 頁（2016 年）理学療法学第 43 巻第 2 号. 平成 26 年度研究助成報告書. ADAM19 発現における電気刺激効果の機構解明深澤賢宏 1），谷本圭司 2），古川拓馬 3），大倉優之介 3），河原裕美 4），弓削類 1）. 図 1 ADAM19 プロモーターレポーターの作成. 1）. （RPMI1640：Sigma 社）に 10 ％ウシ胎児血清（fetal bovine. 2）. serum：FBS，Sigma 社），カナマイシン（Sigma 社）を添加. 3）. したものを使用した。培養条件は，5％ CO2，95％ air，37 C. 4）. とした。. 広島大学大学院医歯薬保健学研究院生体環境適応科学広島大学原爆放射線医科学研究所広島大学大学院医歯薬保健学研究科生体環境適応科学. （株）スペース・バイオ・ラボラトリーズ. 3．電気刺激実験 6）キーワード：ADAM19，プロモーター活性，神経筋接合部. 細胞を 2.0 × 105 個で 35 mm 培養皿（Nunc 社）に播種し， 24 時間後に培養皿に各々の白金線電極を培養液に接するよう. はじめに. に挿入し，電気刺激装置（SEN-2201：日本光電社）に接続し. 神経筋接合部は，運動神経から骨格筋へ活動電位を伝達し，. た。条件は矩形波，50 v，0.5 Hz で 30 分間電気刺激を行った。. 骨格筋を収縮させるのに重要な装置である。なかでも神経筋接. さらに 24 時間後に同一条件で電気刺激を行った。実験群は電. 合部形成不全は，骨格筋の萎縮を惹起することが知られてお. 気刺激を行わないコントロール群，電気刺激を行う電気刺激群. り，これに関連してサルコペニアや筋萎縮性側索硬化症の原因. とした。電気刺激 24 時間後にサンプリングを行い，Real-time. になるという報告が最近みられる 1）2）。したがって，神経筋接. RT-PCR 法にて ADAM19 発現，各プロモーターレポーターの. 合部の形成を促進することは，これらの疾患の治療に繋がる可. 活性を測定した。. 能性があり，運動療法や電気刺激などの介入効果の検討が動物. 4．Real-time RT − PCR. 実験で試みられている. 3）4）. 。なかでも電気刺激は，理学療法に. 細胞回収後，NucleoSpin®RNA（MACHEREY-NAGEL 社）. おいて多用される治療法のひとつではあるが，神経筋接合部形. を使用して total RNA を抽出した。Total RNA 量を 50 ng/. 成に対する効果の基礎的研究は希である。. µ l に調整後，ReverTra Ace®（TOYOBO LIFE SCIENCE. ADAM19 は，発生過程において末梢神経や心臓の形成に重. 社）を用いて逆転写反応して cDNA を作成した。cDNA を. 要な役割をしていることが報告されている。神経筋接合部形. 鋳型として，ADAM19 に特異的なプライマー forward 5 ′ -. 成に関しては，ADAM19 ノックアウトマウスで神経筋接合部. TGG AAG ATG GGG AAG AGT GT -3 ′ ，reverse 5 ′ - ATT. 形成不全のため呼吸不全を起こすという報告がある. 5）. 。また，. 我々は電気刺激により ADAM19 の発現が上昇し，下流のシグ. GCA GCA GGG GTT GTT AC -3′ （Universal Probe Library probe #35; cat. no. 04687680001），または ACTB（4326315E,. ナル伝達経路のニューレギュリン系を介して神経筋接合部形成. Applied Biosystems 社）と FastStart Universal Probe Master. を促進することを報告した 6）。電気刺激により ADAM19 発現. （Roche 社）を混合し，7500 Real-time PCR system（Applied. が上昇し，神経筋接合部形成を促すことがわかってきたが，電. Biosystems 社）を用いて解析した。. 気刺激による ADAM19 の発現制御機構は未だ不明である。そ. 5．プロモーター活性解析. こで今回，ADAM19 のプロモーター領域を組みこんだルシ. 5 細胞を 2.0 × 10 個で 35 mm 培養皿に播種し 18 時間後，. フェラーゼレポーターを作成し，電気刺激のプロモーター活性. pGL4.26 Adam19 promoter レポーターまたは pGL4.26 empty. への影響を解析して，ADAM19 発現制御機構の検討を行った。. ベクターを TransIT®-LT1（Mirus 社）を用いてトランスフェ. 方法. クションした。トランスフェクション効率の補正のために. 1．レポーター作成. pRL-SV40（Promega 社）を同時にトランスフェクションした。. マウス Adam19 プロモーター領域（転写開始点を +1 とした. トランスフェクションして 6 時間後に 1 回目の電気刺激を行. ときの ‒ 1787 bp から +127 bp：1914bp）を特異的プライマー. い，24 時間後に 2 回目，その 24 時間後にサンプリングを行っ. forward 5 ′ -CCA TTC ATA TGT TGG AAC CCA AGC-3 ′ ，. た。プロモーター活性の解析には Dual Luciferase Assay Kit. reverse 5′ -GAT AGC AAC GGC CCT CTC ACT G-3′ を用い. （Promega 社）を使用し，各サンプルのルシフェラーゼ発光を. てマウスゲノム DNA から PCR 法で増幅後，pGL4.26 ルシフェ. Mini Lumat LB 9505 luminometer（Berthold Technolgies 社）. ラーゼベクター（Promega 社）にサブクローニングして遺伝. にて測定し，各レポーター活性を pRL-SV40 で補正し，各実験. 子プロモーターレポーターを作製した（図 1）。塩基配列はダ. 群の比較を行った。. イレクトシークエンス法により確認した。. 6．統計解析. 2．細胞培養. 各値は平均±標準偏差とし，各群の比較には t 検定を用いて，. 培養細胞は，ヒト肝由来細胞株 HepG2 を用いた。培地は. 危険率 5％未満を有意水準とした。.

(2) ADAM19 発現制御機構の解明. 189. 激による ADMA19 遺伝子発現増加は転写レベルでの制御である可能性が示唆され，組みこんだプロモーター領域内に電気刺激に応答する配列が含まれている可能性が考えられた。今後，電気刺激に応答する特異的配列を検索するために，今回作成したレポーター領域よりも範囲を狭めた欠失変異体レポーターを用いて電気刺激に対する応答性を観察し，制御領域の絞りこみを行っていく必要がある。また，Adam19 のプロモーターはエピジェネティックに発現が抑制されているという報告があり. 7）. ，今後の研究でメチル化制御機構と電気刺激の関係を観察. していく必要もある。このように，電気刺激に応答する責任配列やその制御機構を明らかにすることで，電気刺激による神経筋接合部形成促進の分子機構解明につながり，分子標的薬物療図 2 ADAM19 遺伝子発現解析. 法などの新たな治療法開発などに役立つ可能性がある。今回は，神経筋接合部形成に重要な役割をする ADAM19 に着目して，ADAM19 発現制御機構の解明を試みたが，電気刺激は ADAM19 だけでなく，他の遺伝子の発現も制御していることが推察される。したがって今後，網羅的な解析を行うことで，電気刺激の生体に与える効果の全体像の把握に繋がることが期待される。電気刺激は，生体内に様々な変化をもたらすことで，生理的な状態を変化させる可能性が推察される。したがって，その制御系を明らかにすることは，電気刺激療法の効. 図 3 プロモーター活性解析. 果の応用範囲を広げることに繋がり理学療法の対象範囲を拡大する可能性があると思われる。文献. 結果 1．Real-time RT − PCR（図 2） ADAM19 mRNA 発現は，電気刺激群において有意に高くなっていた（P ＜ 0.05）。 2．プロモーター活性（図 3） Empty ベクターをトランスフェクションした群に比べ pGL4.26 Adam19 プロモーターをトランスフェクションした群では活性が有意に高くなっていた（P ＜ 0.01）。pGL4.26 Adam19 プロモーターをトランスフェクションした群の中でも，電気刺激群において，プロモーター活性が有意に高くなっていた（P ＜ 0.05）。考察本研究により電気刺激による ADAM19 遺伝子発現の増加が，ヒト肝由来の細胞株においてはじめて観察された。これは，以前報告した NG108-15 細胞以外でも様々な細胞において普遍的な機構である可能性を示す結果となった。また，作成した Adam19 プロモーターレポーターは強い活性を示し，サブクローニングした遺伝子領域に重要な転写調節領域が含まれている可能性が示された。さらに，Adam19 プロモーターは電気刺激に応答し，プロモーター活性が高くなったことから，電気刺. 1）Deschenes MR, Roby MA, et al.: Remodeling of the neuromuscular junction precedes sarcopenia related alterations in myoﬁbers. Exp Gerontol. 2010; 45: 389‒393. 2）Krakora D, Macrander C, et al.: Neuromuscular junction protection for the potential treatment of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol Res Int. 2012; 2012: 379657. 3）Valdez G, Tapia JC, et al.: Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010; 107: 14863‒14868. 4）Johnson AM, Connor NP: Eﬀects of electrical stimulation on neuromuscular junction morphology in the aging rat tongue. Muscle Nerve. 2011; 43: 203‒211. 5）Yumoto N, Wakatsuki S, et al.: Meltrin beta/ADAM19 interacting with EphA4 in developing neural cells participates in formation of the neuromuscular junction. PLoS One. 2008; 3: e3322. 6）Fukazawa T, Matsumoto M, et al.: Electrical stimulation accelerates neuromuscular junction formation through ADAM19/neuregulin/ErbB signaling in vitro. Neurosci Lett. 2013; 545: 29‒34. 7）Chan MW, Huang YW, et al.: Aberrant transforming growth factor beta1 signaling and SMAD4 nuclear translocation confer epigenetic repression of ADAM19 in ovarian cancer. Neoplasia. 2008; 10: 908‒919..

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