様式甲－３
指 導 教 授 氏 名 指 導 役 割
印 研究の総括的指導
印 印
学 位 論 文 要 旨
岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 薬 学 総 合 研 究 科
専 攻 分 野 歯 周 病 態 学 分 野 身 分 大 学 院 生 氏 名 磯 島 大 地
論 文 題 名 歯 周 炎 罹 患 の 有 無 に よ る ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 病 変 の 細 菌 叢 の メ タ ゲ ノ ム 解 析
【緒言】
ヒ ト の 口 腔 内 や 腸 内 に は 様 々 な 細 菌 が 共 生 し て お り ， そ れ ら 細 菌 叢 全 体 は マ イ ク ロ バ イ オ ー ム と 呼 ば れ て い る 。 歯 周 炎 は ， 歯 周 病 原 細 菌 が 歯 周 組 織 に 感 染 し 発 症 す る 感 染 症 で あ る が ， 単 一 菌 種 に よ る 感 染 で は な く 常 在 菌 を 含 む マ イ ク ロ バ イ オ ー ム の バ ラ ン ス の 崩 壊 か ら 発 症 ・ 進 展 す る と 考 え ら れ て い る 。 ま た ， 歯 周 炎 は 末 梢 臓 器 に 影 響 を 及 ぼ す 軽 微 慢 性 炎 症 と い う 側 面 も 有 し て い る た め ， 糖 尿 病 ， 動 脈 硬 化 ， 心 臓 弁 疾 患 な ど 様 々 な 全 身 疾 患 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ て き て い る 。
ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 症 は ， 様 々 な 原 因 に よ っ て 血 管 内 壁 に ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク が 沈 着 す る 循 環 器 疾 患 で あ る 。 ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 症 と 歯 周 炎 と の 関 連 は ， 疫 学 的 分 析 や ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク 内 に 歯 周 病 原 細 菌 が 検 出 さ れ た こ と か ら ， 相 関 関 係 が 示 唆 さ れ て い る が ， 両 疾 患 の 発 症 に は ， 喫 煙 や 糖 尿 病 な ど 共 通 交 絡 因 子 が 多 数 存 在 す る た め ， 発 症 メ カ ニ ズ ム に 関 す る 決 定 的 な 因 果 関 係 は 明 ら か に な っ て い な い 。
そ こ で ， 両 疾 患 の 関 連 性 を 細 菌 学 的 に 探 求 す る た め に 次 世 代 シ ー ク エ ン サ ー を 使 用 し た マ イ ク ロ バ イ オ ー ム 解 析 に 着 眼 し た 。マ イ ク ロ バ イ オ ー ム 解 析 は ，近 年 ，16S rRNA 遺 伝 子 を 用 い た 網 羅 的 な 細 菌 群 集 解 析 手 法 に よ っ て 難 培 養 性 で 検 出 が 困 難 で あ っ た 細 菌 に 関 し て も 解 析 す る こ と が 可 能 と な っ た 。 そ こ で 本 研 究 で は ， ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 症 を 有 す る 患 者 の 歯 周 炎 の 罹 患 状 態 を 把 握 し た 上 で ， 口 腔 内 お よ び ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク 内 の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム を 次 世 代 シ ー ケ ン サ ー で 網 羅 的 に 解 析 し ， 両 疾 患 の 関 連 性 を 細 菌 学 的 に 検 討 す る こ と を 目 的 と し た 。
【材料と方法】
1． 患者選別：2016年4月から11月までの期間，脳神経センター大田記念病院を受診した内頚動脈 狭窄症患者で頸動脈血栓内膜剥離術（CEA：carotid endarterectomy）を受ける患者17人から，
現在歯数10歯以上である12人を被験者とした。被験者から歯周病学会ガイドライン（歯周治療 の指針2015）に基づいて，中等度から重度群歯周炎群（Periodontitis群：4名）と非歯周炎群
（Control群：4名）を抽出した。
2． サンプル採取： 抽 出 し た 被 験 者 か ら ，以 下 の 通 り サ ン プ ル を 採 取 し ，−40 ˚Cで 冷 凍 し ， 冷 凍 状 態 で 岡 山 大 学 歯 周 病 態 学 分 野 に 輸 送 し た 後 ，−80 ˚Cで 保 管 し た 。
ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク ：CEA施 行 時 に 外 科 的 に 摘 出
歯 周 ポ ケ ッ ト プ ラ ー ク：歯 周 ポ ケ ッ ト 値 の 最 深 部 に ペ ー パ ー ポ イ ン ト（United Dental Manufactures） を 挿 入 し 採 取
舌 表 面 唾 液 ： 舌 表 面 か らForensic Swab（Sarsted AG & Co） を 用 い て ス ワ ブ 法 に て 採 取
3． 細菌DNAの抽出： 各 種 サ ン プ ル か らQIAamp DNA Microbiome Kit（Qiagen） を 使 用 し ，細 菌DNAを 抽 出 し た 。な お ，ホ モ ジ ナ イ ズ の 方 法 は シ リ カ 入 り チ ュ ー ブ で あ るLysing Matrix Bに 菌 液 を 加 え ，Fast Prep 24（ と も にMP Biomedicals） で 振 盪 さ せ た 。 ま た ， 抽 出 し たDNAは−80 ˚Cで 保 管 し た 。
様式甲－３ 4． 次世代シークエンス（メタゲノム）解析： 上 記 ⒊ で 得 ら れ た 細 菌DNAか ら ，16S rRNA
遺 伝 子 中 の 特 定 領 域（1352 bp）をpolymerase chain reaction（PCR）法 で 増 幅 し た 。 そ の 後 ，V3-4領 域 （460 bp） で 次 世 代 シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 い ， 各 種 サ ン プ ル の 塩 基 配 列 を 解 読 し た 。 得 ら れ た デ ー タ をCLC Genomics Workbench（CLC bio） で デ ー タ ベ ー ス に 照 合 し ，統 計 分 析 ソ フ ト を 使 用 し 組 成 分 析 ，主 成 分 分 析 ，ク ラ ス タ ー 分 析 ， 共 起 ネ ッ ト ワ ー ク 分 析 を 実 施 し た 。
5． 血清IgG抗体価検査：−80 ˚Cに て 凍 結 保 存 し た 血 清 を 酵 素 抗 体 法（ELISA）法 に よ っ て 歯 周 病 原 細 菌12菌 株 に 対 す る 血 清IgG抗 体 価 の 測 定 を 行 っ た 。
6． 全身状態と歯周炎罹患状態の評価方法：CEAの 術 前 検 査 結 果 で 両 群 間 の 特 徴 や 交 絡 因 子 と な り 得 る 全 身 状 態 の 検 査 値 を 評 価 し た 。ま た ，歯 周 組 織 検 査 と 歯 周 病 原 細 菌 に 対 す る 血 清IgG抗 体 価 検 査 か ら ，両 群 の 現 在 歯 数 と 歯 周 炎 罹 患 状 態 を 評 価 し た 。 7． 統計解析：統 計 解 析 は ，Mann-Whitney U Testを 用 い て 行 い ，統 計 学 的 有 意 水 準 は
5 %未 満 と し た 。
【結果】
1． 対 象 被 験 者 の 特 徴 と 歯 周 炎 罹 患 状 態：Control群 とPeriodontitis群 間 の 特 徴 や 全 身 状 態 で 交 絡 因 子 と な り 得 る 因 子 は な か っ た 。ま た ，平 均 歯 周 ポ ケ ッ ト 深 さ に は 両 群 間 に 有 意 な 差 が あ っ た 。 Control群 と 比 較 し て Periodontitis群 で は ， Aggregatibacter actinomycetemcomitans 3菌 株 ，Capnocytophaga ochracea 1菌 株 ， Porphyromonas gingivalis 1菌 株 の 血 清IgG抗 体 価 値 が 有 意 に 高 か っ た 。
2． マイクロバイオーム組成分析：Control群 と 比 較 し ，Periodontitis群 の 口腔内では病 原 細 菌 の 割 合 が 増 加 し ，常 在 細 菌 が 減 少 す る 傾 向 が あ り ，そ の 傾 向 は 歯 周 ポ ケ ッ ト プ ラ ー ク の ほ う が 顕 著 で あ っ た 。 ま た ，Periodontitis群 に お い て ， 舌 表 面 唾 液 で は Filifactor属 ，歯 周 ポ ケ ッ ト プ ラ ー ク で はDesulfobulbus属 と い っ た 歯 周 炎 関 連 細 菌 の 割 合 が 有 意 に 高 か っ た 。一 方 ，ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム は 口 腔 内 の も の と は 全 く 異 な り ， 口 腔 内 細 菌 は ほ と ん ど 存 在 し な か っ た
3． マイクロバイオーム主成分分析とクラスター分析：主 成 分 分 析 の 結 果 か ら ，Control群 と Periodontitis群 の 舌 表 面 唾 液 の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム は 類 似 し て お り ，Control群 の 歯 周 ポ ケ ッ ト プ ラ ー ク の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム も 両 群 の 舌 表 面 唾 液 の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム と 類 似 し て い た 。一 方 で ，Periodontitis群 の 歯 周 ポ ケ ッ ト プ ラ ー ク の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム はControl群 と 比 較 し ，総 じ て 異 な る 傾 向 を 示 し た 。ま た ，両 分 析 結 果 と も ，ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム は ，口 腔 内 の も の と 全 く 異 な っ て い た 。し か し ，ク ラ ス タ ー 分 析 に お い て ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム 組 成 は ，Control群 とPeriodontitis群 間 で 変 化 す る 傾 向 が 観 察 さ れ た 。 4． アテローム性プラークマイクロバイオームの共起ネットワーク分析：ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー
ク に お い て 共 起 ネ ッ ト ワ ー ク 分 析 を 行 っ た と こ ろ ，相 関 関 係 を 形 成 し て い る 中 心 細 菌 は 両 群 間 で 類 似 し て い た 。し か し ，Control群 と 比 較 し て ，Periodontitis群 で は ， Cutibacterium acnesを 中 心 し た 相 関 関 係 に お い て 変 化 が 見 ら れ た 。
【 考 察 】
本研究において，歯周炎罹患にかかわらずア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク に 存 在 す る 口 腔 内 細 菌 の 割 合 は 著 し く 低 く ， ま た ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク と 口 腔 内 の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム の 組 成 は 大 き く 異 な っ て い た 。これら結果から，歯周病原細菌が血行性にアテローム性プラークに到達 し，形成に影響した可能性は低いと考える。一方で，歯周炎罹患の有無でアテローム性プラーク内の C. acnesの 相 関 関 係 に 変 化 が 生 じ て い た 。C. acnesは ， 近 年 ， 感 染 性 心 内 膜 炎 や 敗 血 症 の 起 炎 菌 と な っ た 報 告 も あ る 。ま た ，動 物 モ デ ル に お い てC. acnesの 加 熱 死 菌 を 投 与 す る こ と で 生 じ る リ ポ 多 糖（lipopolysaccharide：LPS）感 受 性 の 亢 進 は ，interleukin-12（IL- 12）やinterferon gamma（IFNγ）に よ るToll-like receptor 4（TLR4）発 現 増 強 に 起 因 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。し た が っ て ，歯 周 病 原 細 菌 のLPSが ，血 行 性 伝 播 や ，微 小 慢 性 炎 症 に よ る 影 響 でC. acnesを 介 し ，動 脈 硬 化 症 の 病 態 悪 化 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
【結論】
ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 症 の 発 症 に は ， 血 行 性 に 体 内 に 侵 入 し た 口 腔 内 細 菌 が 直 接 影 響 を 及 ぼ す の で は な く ， 歯 周 炎 感 染 が ア テ ロ ー ム 性 プ ラ ー ク の マ イ ク ロ バ イ オ ー ム に お い て 細 菌 の 生 態 系 構 成 を 変 化 さ せ て 間 接 的 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
