入力に誘導された神経電気活動パターンに顕れる
神経回路網内部状態の安定性
The stability of the internal states appearing in the electrical activity patterns evoked
by inputs in a cultured neuronal network.
○松井 嘉德
1，伊東 嗣功
1，箕嶋 渉
1，工藤 卓
1○Yoshinori Matsui
1, Hidekatsu Ito
1,
Wataru Minoshima
1,
Suguru N. Kudoh
1 1関西学院大学
1
Kwansei Gakuin University
Abstract: The rat hippocampal dissociated culture system is effective as the minimum system possessing the principle bases of brain information processing. Rat hippocampal neuronal cells were cultured on a dish with 64 planer microelectrodes and they recomposed a complex network. In this research, we analyzed stability of neuronal electrical activity pattern evoked by input stimulation in a reconstructed network on a culture dish. In this system, spontaneous activity without any inputs is observed approximately 10 days in vitro. We calculated distances between each spike pattern after electrical stimulation and the template generated from spike patterns, averaged along time axis or along trial axis. The difference between activity pattern within 5 ms-width-time-window and averaged spike pattern template began to reduce immediately after the input and gradually recovered to the stable level. In addition, evoked spike patterns were reproducible, and it tended that spatiotemporal pattern of the electrical activity periodically changed in the domain of being considered to be spontaneous activity. These results suggest that the internal states of the neural network being applied inputs was changed. It is considered that the network activity sustained the internal state of the neuronal network by reflexive and reverberative re-entry of the activity for several seconds and the state corresponding to the short-term memory was formed.
１. はじめに
記憶・行動・意思決定など脳で行われる高次情報 処理は，多くの神経細胞により構成される回路が担 っている[1]．脳情報処理は，神経細胞間の相互作 用に起因する複雑なネットワーク・ダイナミクスに よって実現されるものであるが，これらの詳細なメ カニズムは未だ解明されていない．加えて，in vivo 系でそのまま複雑な構造の脳の神経回路から電気活 動パターンを解析することは困難である．従って， 脳の本質的な機能を持つ自己組織化小規模ネットワ ークは神経電気活動パターンやダイナミクスを解析 するのに有効である．分散培養された神経細胞は軸 索を伸ばし，培養皿上で互いにシナプスを形成して ネットワークを再構築する．このIn vitro の系にお いてもシナプス可塑性に関する報告が多く行われて いる［2-4］．神経細胞はシナプスを介して情報を伝 達するが, その伝達効率は神経活動に依存して調節 される. この神経活動に依存した伝達効率，すなわ ち神経間結合荷重の変化はシナプス可塑性と呼ばれ, 記憶や学習の基盤になっている[2]．神経細胞集団は 必要な処理に応じて同期的に相互作用し，この集合 体が並列的に処理を行っている．神経細胞間の相互 作用はネットワーク全体の活動パターンを生成し， シナプス可塑性もこの影響を受ける．従って，神経 電気活動をネットワークレベルで解析することが， 脳機能の解明に重要である． 近年，分散培養系におけるネットワーク・ダイナ ミクスの解析が進められている[5-7]．培養した神経 細胞の回路網においては自発活動と呼ばれる、外部 からの入力無しで自律的に発生する活動が観察され る．自発活動の多くは，感覚器官からの入力などの 情報伝達に対してはノイズとみなされてきたが，近 年の研究によりこれらは脳の情報伝達に積極的に貢 献していることが示唆され[8]，背景活動とみなされてきた自発活動がネットワーク・ダイナミクスの状 態を形成している可能性が示されている ．また，神 経回路網において，特定の電極への電流刺激に対す る誘発応答のパターンは類似し，ほぼ再現可能であ る．他方，異なる電極への電流刺激による誘発活動 パターンは互いに異なり，パターンが分離する場合 があることから，培養神経回路網は独立したネット ワークを内包し，複数のパターンを表現することが 可能であることが示唆されている．自発活動はネッ トワークの内在的な状態に影響を与えると考えられ るので，自発活動が誘発応答パターンに影響を及ぼ すことは十分考えられる．つまり，自発活動の時空 間パターンがネットワーク・ダイナミクス，すなわ ち系の内部状態を構成し，入力応答特性を制御して いるという仮説が立てられる．本研究ではネットワ ーク・ダイナミクスにおける誘発応答の安定性を解 析し，自発活動との関係性を見出すことを目的とし た．
２. 実験手法
本研究における全ての動物実験は「関西学院大学 動物実験管理規程」に従い，関西学院大学動物実験 委員会の承認のもとに行った．本研究では，胚令18 日のウィスターラット胎児の脳から得られた神経細 胞を用いた．胎児から脳をとりだした後，海馬領域 を切り出して細断し，10 分間のトリプシン処理に より細胞を解離した．細胞外電位を計測するため， 細胞は 64 個の微小平面電極を備えた特殊な培養皿 （MED プローブ，アルファメッドサイエンティフ ィック）で培養した．電極間距離は 450 μm のも のを用いた．MED プローブの中心に設置された微 小平面電極上に細胞が集中するように，内径7 mm のクローニングリングを設置した．リング内部へ細 胞を播種して一晩静置し，翌日にリングを除去した． 培養密度は7800 個/mm2（30 万個/プローブ）とし た．培地はDMEM/F12（25%HEPES, グルタミン 含有，ライフテクノロジーズ）をベースとし以下の 栄養分を添加した． インスリン（シグマ） 5 µg/ml ペニシリン（ライフテクノロジーズ） 100 µg/ml 及び 100 unit/ml ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズ） 5% ウマ血清（ライフテクノロジーズ） 5%培養24－30 日（Days In Vitro, DIV 24-30）の培 養神経回路網を電気生理学的実験に使用した．神経 回路網の構築過程における活動の安定性を解析する ため，神経自発活動パターンが完全に定常化する前 の培養神経回路網を使用した．神経回路網の電気活 動 の 測 定 に は 細 胞 外 電 位 多 点 計 測 シ ス テ ム （MED64 システム，アルファメッドサイエンティ フィック）を用いた．このシステムは，細胞外電位 を多数の点から同時に測定することが可能であり， 神経回路網における電気活動の時空間的な変化が解 析可能である．計測した電位はサンプリング周波数 10 kHz、量子化 bit 数 12 bit で A/D 変換し，計測パ ソコンのハードディスクに保存した．電位多点計測 に用いるMED プローブの培養リング中央部の外側 に4 個の参照電極が囲むように配置されており，こ の4 カ所の電位を基準として，64 個の微小電極にお ける細胞外電位を計測した．細胞外電位計測は，培 地を細胞外記録溶液（Rec. Sol.）および Mg2+不含細
胞外記録溶液（Mg2+-free Rec. Sol.）にそれぞれ液
置換して行った．細胞外記録溶液（Rec. Sol.）の組 成を以下に示す． NaCl 130 mM KCl 3 mM CaCl2 2 mM HEPES 10 mM MgCl2 1 mM Glu co se 10 m M また，Mg2+不含溶液（Rec. Out.）の組成を以下に示 す． NaCl 130 mM KCl 3 mM CaCl2 2 mM HEPES 10 mM
液置換すると，浸透圧の変動や機械的なショック によりグリア細胞からATP が放出される．この ATP により自発性電気活動の頻度が減少し，回復するま でに約 20 分程度の時間を要することが過去の研究 により確認されている[11]．そのため，液置換後 20 分間静置した後，計測を行った．誘発応答の解析に おいては，概ね振幅10 µA，時間幅 100 µs の矩形波 を用いた双極定電流刺激を行い，応答誘発電位を刺 激毎に 60 秒間記録した．電気刺激は 60 秒おきに 印加し，各刺激の計測時間（60 秒）を 1 スィープ として 50 スィープずつ計測した．細胞外電位スパ イクの計数解析には，本研究室で LabVIEW（日本 ナショナルインスツルメンツ）を用いて開発された SPR（Spike Recorder）を用いた．計測した細胞外 電位に対し，指定した閾値を超えた振幅・幅を持つ スパイクを活動電位として検出した．活動電位が 精々１つしか発生しないと考えられる時間幅であ る，5 ms の時間窓でスパイクが検出された場合を 1， 検出されなかった場合を0 で表現した特徴ベクトル を生成した．それぞれの電極における活動電位スパ イク数を各スィープで合計し，64 電極から得られ た各スィープのスパイク数の平均を閾値として，こ れを超えるスパイク頻度が確認された場合，電極に おける活動を1，それ以外を 0 として各スィープに おける活動の空間パターンの代表例を作成した．こ れ を 時 間 軸 集 約 活 動 パ タ ー ン （Time Overlaid Spatial Pattern, TOSP）と定義した．TOSP と各 5 ms の時間窓の活動パターンとの差分を計算し，各 時間窓毎に全スィープで平均した．スィープ番号を sw，電極番号を ch，時間窓 t におけるスパイク数を nch,tsw とすると，スパイク数の計測時間全域の合計 Stchswは以下のように表される． 𝑆𝑡𝑐ℎ𝑠𝑤=∑12×10𝑡=1 𝑛𝑐ℎ,𝑡𝑠𝑤 (１) また，スィープsw における TOSP の閾値Thswを以 下のように定義した． Thsw=641 × ∑64𝑐ℎ=1Stchsw (２) 時間軸集約活動パターンTOSPchswは TOSPchsw={1 (Stch sw≥ 𝑇h 𝑠𝑤) 0 (Stchsw< 𝑇h𝑠𝑤) (３) また TOSP との差分値の合計𝐷𝑇tswを以下のように 定義した． 𝐷𝑇tsw=∑64 | 𝑐ℎ=1 nch,tsw − TOSP𝑐ℎ𝑠𝑤| (４) これらより，TOSP との差分値の合計を全スィープ で平均した値mD𝑇tを算出する． mD𝑇t = 1 50∑ 𝐷𝑇t sw 50 𝑠𝑤=1 (５) また，各時間窓毎のスパイク頻度を各電極毎に全 スィープで合計し，この合計値の全電極における平 均値を閾値としてこれを超えるスパイク頻度が観察 された場合，この電極における活動を1 とし，それ 以外を0 として，ある時間窓において全スィープで 観察された活動の空間パターンの代表例を作成した． これをスィープ集約活動パターン（Sweep Overlaid Spatial Pattern, SOSP）と定義した．TOSP と各 5 ms の時間窓の活動パターンとの差分を計算し，各 時間窓毎に全スィープで平均した．電極ch，時間窓 t におけるスパイク数の全スィープにおける合計 Sstchは以下のように算出される． Sstch= ∑50𝑠𝑤=1nch,tsw (６) SOSP の閾値Thtは Tht=641∑64𝑐ℎ=1Sstch (７) スィープ集約活動パターンSOSPtchは次のように算 出される． SOSPtch= {1(Sst ch≥ Th t) 0(Sstch< Tht) (８)
図1. 空間領域限定解析の詳細 さらにSOSP との差分値の合計𝐷𝑆tswは以下のように 求められる． 𝐷𝑆tsw=∑64 | 𝑐ℎ=1 nch,tsw − SOSPtch| (９) これらより，SOSP との差分値の合計を全スィープ で平均 した値mDStを算出する． mDst=1 50∑ Dst sw 50 𝑠𝑤=1 (１０) mD𝑇tは，各スィープで発現した活動パターンを時間 軸方向に平均したテンプレートとの差分であり，そ のスィープで生じた活動の相対的な時間変動を示す． mDStはある時刻の電気活動をスィープ間で平均した テンプレートとの差分を示しており，電流刺激によ り発現したパターンのある時間ドメインが，スィー プごとにどの程度再現性良く発現するかを示す． 更に，刺激情報の広がりを観察するために，テン プレート作成範囲に関して刺激点を中心とした 3× 3，5×5，7×7 のリング状に空間領域を限定して解 析を行った（図1 参照）．
３. 結果・考察
細胞外記録溶液（Rec. Sol.）下及び Mg2+不含溶液（Mg2+-free Rec. Sol.）下における，TOSP との差
分値平均の時間変動mD𝑇tを算出した（図2 参照）． mD𝑇tは刺激直後に急激に増加し，刺激後 5 ms～20 ms 間で急激に減少し，その後同じような差異数で 推移した．mD𝑇tは，計測時間60 s 全体において平均 図2. 記録溶液下におけるmDTtの推移 的であった空間パターンとの差分であるので，自発 活動によって定常的に存在した活動パターンが計測 時間全域では支配的であり，特に刺激直後5 ms～20 ms 内において自発活動パターンと異なる活動パタ ーンが出現していたことが示唆された． 同様に，SOSP との差分値平均の時間変動mDstを 算出した（図3 参照）．mDstはスィープ間での再現性 を示し，その値が小さければその時間領域での活動 が繰り返し出現していることを示す．刺激後100 ms まではmDstの値が小さいことから，この期間におい て各スィープで再現性が高いことが示唆された．刺 激後50 ms から急激にmDstの値が増加しており，こ の時間帯において自発性電気活動が優位的になって いると予想される．また，mDstの値が小さい100 ms 程度の領域が繰り返し出現しており，再現性の高い 活動が繰り返し発現していることが示唆された．神 経回路網において刺激伝搬が反響的に回帰し，再び 類似の活動パターンが発現したと考えられる．Mg2+ 不含溶液下では，シナプス伝達が増強され，自発活 動頻度が上昇する．自発活動が増加しても，mD𝑇tの 図3. 記録溶液下におけるmDStの推移
図4. 細胞外記録溶液下における空間領域限定 解析によるmDTtの推移 変化は通常の記録外液とほぼ同じ傾向を示したが， 自発活動が支配的になったためにテンプレートが自 発活動に近いものになり，差分値がやや低くなる傾 向が認められた．mDstは，自発活動が増加した状態 の方がある時間区間での再現性がむしろ明確になっ ていることを示した． 更に，テンプレート作成範囲に関して刺激点を中 心とした3×3，5×5，7×7 のリング状に空間領域 を限定し，TOSP 及び SOSP 解析を行った（図 4-7 参照）．TOSP 解析においては，5×5 に限定した場 合に100 ms 周期で mDStの値が大きいドメインが 観察された．TOSP テンプレートは計測時間全域か ら生成しているため，自発活動に近い活動パターン がテンプレートに類似していることが想定され，し たがって，100 ms 周期のドメインでは，自発活動 と異なる特異的なパターンが反響的に顕れている可 能性が高い．この特異的反響パターンが，5×5 エリ 図5. Mg2+不含溶液下における空間領域限定解析 によるmDTtの推移 図6. 細胞外記録溶液下における空間領域限定解 析によるmDStの推移 アの解析において顕著であるので，電極間距離が 450 μm であることを考えると，刺激点から約半径 900 μm のエリアにおいて，反響的な信号が生成さ れている可能性がある．SOSP 解析においても，5 ×5 に限定した場合において 100 ms 周期の再現性 が高い時間領域が強く出現していることは，この結 果と一致性がある．ただし，SOSP 解析において最 もmDStの値が低い，すなわち再現性が高いのは3× 3 エリアにおいてであった．従って，刺激点からお よそ半径 500 μm の範囲において特にスィープ間 で活誘発動パターンの再現性がよく，刺激によって 同じパターンが出現していることが示唆され，この ことから，刺激によって生成されたパターンは刺激 点から近いほどスィープ間の再現性が良く，離れる に従って，パターンに揺らぎが生じることを示唆す る．3×3 のエリアとそれ以外のエリアで大きな差が 生じていることから，神経間の伝達に伴うパターン 図7. Mg2+不含溶液下における空間領域限定解 析によるmDStの推移
の揺らぎが 5×5 における反響的な活動によって生 成されている可能性がある．今後さらに検証する必 要がある．
４. 結論
TOSP 解析において，培養神経回路網に電流刺激 を印加後5 ms～20 ms において特異的な活動パタ ーンが発現した．Mg2+不含溶液下における解析では， 自発活動がテンプレート作成時間において主要的で あることから，全体的に差異数が減少した． また，SOSP 解析において再現性が高い特定の活 動パターンが特に約100 ms 周期で繰り返し出現し た．加えて，空間領域を限定してテンプレートを作 成した解析から，刺激点を中心としておおよそ半径 900 μm の範囲においてフィードバック入力によ る反響的な活動が生成され，刺激によって同じパタ ーンが繰り返し出現していることが示唆された．ま た，この距離以上刺激展から離れたエリアでは活動 パターンの再現性が急激に低下したことから，反響 的な活動がパターンの揺らぎを生成している可能性 がある． これらの結果は，刺激による誘発応答と２次的に 影響された自発活動は分離した独立の現象ではなく， 互いに影響しあっていることを強く示唆する．８. 謝辞
本研究は，科学研究費補助金 基盤研究(B) 課題番 号 24300091，および文部科学省私立大学戦略的研究 基盤形成支援事業（平成 26 年〜平成 30 年，事業番 号：S1411038）の支援を受けて行われた．参考文献
[1] Hebb D.O: The Organization of Behavior., A Neuropsychological Theory, 1949
[2] Hochner, B., Klein, M., Schacher, S. and Kandel, E. R: Action-potential duration and the modulation of transmitter release from the sensory neurons of Aplysia in presynaptic facilitation and behavioral sensitization., Proc Natl Acad Sci USA, Vol.83, 8410-4, 1986 [3] Segal, M.: Synaptic transmission between
cultured rat hippocampal neurons is enhanced by activation of protein kinase-C, Neurosci Lett, Vol.101, pp.169-74, 1989
[4] Corner, M. A.: Reciprocity of structure-function relations in developing neural networks: the Odyssey of a self-organizing brain through research fads, fallacies and prospects., Prog Brain Res, Vo.102, pp.3-31, 1994
[5] D. A. Wagenaar, S. M. Potter, ZC. Chao, and DJ. Bakkum: Effects of random external background stimulation on network synaptic stability after tetanization: a modeling study., Neuroinformatics, Vol.3, pp. 263-280, 2005 [6] S. Marom, D. Eytan: Dynamics and effective
topology underlying synchronization in networks of cortical neurons., Journal of Neuroscience, Vol.26, pp. 8465-8476, 2006 [7] S. M. Potter and T. B. DeMarse: A new
approach to neural cell culture for long-term studies, Journal of Neuroscience Methods, Vol.110, pp. 17-24, 2001
[8] K. Wiesenfeld, F. Moss: Stochastic resonance and the benefits of noise: from ice ages to crayfish and SQUIDs, Nature, No.373 pp.33-36, 1995 連絡先 松井 嘉德 E-mail:fuw01319@kwansei.ac.jp 工藤 卓（C.A.） snkudoh@kwansei.ac.jp
