精鶏卵

金沢大 学十 全 医学 会 椎誌 第^{10 2}巻 第³ 号 ^{3 9 1 【403 (19 9 3})

受精鶏卵を用 ^{い た ヒ ト}骨軟部悪 性腫 瘍^の 転 移 巣^に対 す^る抗^がん剤 感受 性試 験

金 沢 大学 医学 部 整 形外 科 学 講 座 (^主任^:富^田勝 郎 教授)

高 木 春 草

3 91

骨 軟 部悪 性 腫 瘍^の治療 成 績^の向上^のた めには, 原 発 腫瘍^{のみ な ら}ず転 移 腫瘍^に対 す^る有 効^な治 療 方 法を開発 する必 要が ある^. 本 研 究^では骨 軟 部 悪 性腫 瘍^の転移 実 験 法な ら び^に転 移巣 治 療 実 験 法^の確 立を 目指し. 受 精鶏 卵を 用^いる腫 瘍 移 植 系(受 精 鶏卵 法) ^によ る^{ヒ ト}腫瘍 細 胸^の人^工転 移実 験 系^の有 用性^を検 討^{L た･} 僻 卵^{1 0 日 目の}受 精鶏 卵^の凍 尿 膜上の血管^に1 ×1 0憫 ^の 腫 瘍細 胞^を移 植し, 7 日後^に胎 児 肝お よ び肺を摘 出し D N A を抽 出^{し た･} 転移^{ヒ ト}腫瘍 細胞^の特 異的^且つ定 量 的^な倹 出 方法^と して_, 転 移 腫 瘍^に含^{ま れ るヒ ト D N A の}特 定 領 域せ特 異 的 D N A 増 幅 反 応(polym e r a s e chain r e a ctio n,P C R ) 法^によ り増 幅^し た後, 増 幅 D N A 断 片を^{サ ザン} プ^ロ ッ ト法^{に て}検 出^{お よ び}解析^{し た,} 本 法^{を 剛 ､て}骨軟 部 悪性 腫 瘍培 養 株^の転 移能を検 討し た 結 果, 線 維 肉 腫 細 胞 株^{で は H T‑1 0 8 0 が,} 骨 肉 腫 細 胞 株^では M N N G/^{H O S と S K}‑^{E S‑1 が高い転 移 能を 示 し た･ さ らに}

H T‑1 0 8 0 お よ び M N N G/^{H O S} を移植^{し た}鶏 卵 胎 児^{におい ては}単位 重 量 当り^の転 移細朋が肺よ り肝^の方が そ れぞれ H T^‑1 0 8 0 で

約³ 胤 M N N G/^{H O S で}約1 0倍上 回 って いた^. そ れ^に対^して, S K‑^{E S},^{1 で は肺お よ び肝にお け る転 移 細胞 数はほぼ 同程 度で,} 肺^への転移 指 向性^{が H T‑}1 08 0 や M N N G/H O S に比べ て高^{い こ}と が 示唆さ れ た^. 腫 瘍 移植7 日後^の肝お よ び肺^の阻織 学 的 所 見 で はこれ らの腫 瘍 細 胞^の転移が多 数 観 察さ れ, P C R 法^{によ る}検 出結 果^{と 一} 致し た. 転 移 巣に対する抗が ん剤^の感 受 性を検 討 す る 目的^で移植 後^{3 日 目に}抗が ん剤を凍 尿 膜上の血管 内^に投 与し た^. H T^‑1 08 0, M N N G/^{H O S お よ び S K‑E S}‑^{1 の転 移 巣はいずれ} も^アド リ^アマ イ^シン (^adria m ycin, A D M ) と^マイト ^マイシ ンC (mit o m ycinC,M M C )^に高^い感 受性を 示 L た^･ ま た^{シ ス}プラ チン

(cis^‑b^{la tin u m, C D D P}), サイク^ロ ブ ォ ス フ ァ ^マイ ド (^Cy^Clopho spha mide,C P M ) お よ び^ビンブラス チン (^vinb la s tin e, V L B ) ^に対 する転 移 巣^の感受 性^は各 細胞 株^{によ り}異な り, S K ^‑E S^‑1 は C D D P お よ び C P M に _, H T‑^{1 0 8 0 は V L B に高い感 受 性を 示 し}

た^. し か し, M N N G/^{H O S の転 移 巣は 同投 与 量のC D D P , C P M} お よ び V L B ^に対し感 受性^{を 示 さ な かった･ M N N G}/H O S 細 胞^を移 植^{し た}鶏卵 胎 児 肝^の経 時 的な組織 学 的 所 見で は, 腫 瘍細 胞は 2 時 間お よ び 8 時 間 後^でも 微 小血管 内^に存在^{L て いた が},

1 2時 間後^には腫 瘍 細胞は 血管 内 皮 細 胞 内^に侵^{入 して いた. さ らに, 2 2}時 間お よ び5 1時 間 後^では 分裂 増 殖が認め ら れ, 7 日後^で は転移 巣を多 数 形 成して いた^. 転 移 巣 形 成^の抑 制を 目的^に, 受 精 鶏 卵^{に M N N G}/^{H O S} 細 胞^を移 植し た後 早 期に M M C と V L B を投 与^{し た. M M C を}移 植²時 間 後^に投 与し た場 合^では9 1^.9% ^の肝 転移 巣抑 制 効 果を 示 し,2 4時 間と7 2時 間 後^{で ほ}各^々8 3^.2% お よ び5 1^.8% の抑 制 率を 示 し た^{. 一} 九 ^{V L B} 投 与 群^の転移 巣 抑 制 率^は移 植2 時 間 後^の投 与^では‑^2･2% ,7 2時 間後^の投 与

で は1 0.4% であった. こ のよ う^に腫 瘍 細 胞移 植 後 早 期^に有 効な抗が ん剤を投 与する^こと^によ り転 移^を抑 制す^{ること が 可}能^であ る^こと が 示 さ れ た^. 受精 鶏 卵 法^{はヒ ト}骨 軟 部悪 性 腫 瘍^の転 軌 浸 潤^の機 構 解明^のた めの転 移 実験 系と して_, ま た転 移 巣^に対 す る治 療法^の開発^にも 有用 な実 験 系^にな るものと考え ら れ た^.

Key ^{w or}ds hu m an bo ne a nd soft tis s u e tu m o r c ell, m eta Sta Sis, P^Ol_y m er a se chain r e actiont

che m o se n sitiv lt y t^eSt, Chick e m bry^o

骨 軟 部悪 性 腫 瘍^{にお け る}最 も 憂 慮^{さ れ るべ}き 予 後因子^{の 一 つ} ほ診 断 時^における転 移^の有 無^である^. し か し な が ら, 現 在^のが ん 医療ⁱこお け る転 移が ん^{の 一} 般 的な検 出 限界は直 径1c m の應 痛までと さ れ^てお り^l＼ ^{ニ の}検出 限 界^{よ り}も^{さ らに}小^さい微 小 転 移が んの検 出 法は未だ確立 さ れ ていな^い. 従^{っ て, が んで}あ る と診 断が 下 さ れ た 段階^で緻 小 転 移が ん が存 在する と仮 定し た 全身的 治療 法が施 行さ れて いる^のが現 状^であ^る. 掛^こ骨 軟 部悪 性 腫瘍 領 域^にお^{い て}は強力 かつ有 効な化 学 療 法^の支援が その治 療 成績^の向^上に大 きく貢 献^{し てい ること か ら}､^2■､5_{＼ 全 身 的 治 療}

法である が ん化学 療 法^は微 小 転 移^{が んの}治 療^に有用 な手段^にな り得る と考え る^{. 一} 九 が ん化 学 療 法は未だ完 成さ れ たも^{の で} は な く. 既 存^の抗^{が ん}剤^の投 与^のみでは完 全^に転 移^を抑制 す^る

こと ほ難しい. 転 移を阻止 し転移が ん を効 果 的に治療 する た め に は, が ん細 胞^の転移^の機 構に基づいた薬 剤ま た は治 療 法を新 たに開 発 す^る必 要^がある^{. こ}れ まで の転 移 研 究^の大部 分^は転 移 現象^の解 析^であり, 転移が んの治療^に関 する報 告は極めて少な い. これ は有用 な転 移実 験^モデル系^が確 立^{さ れ ていない ことに} 原 因^{の 一 つ}がある^. 本 研 究で は骨 軟 部悪 性 腫 瘍^の転移 実 験 系^な

平 成5 年⁴月2 0 日受 付, 平 成5 年⁵ 月17 日受 理

A b br eviati_{o n s :} A D M , adria my^cin;C D D P, Cis^‑platinu m ; C P M , Cy^Clophospha mid_{e ;} E D T A . eth_yle n edia min e^‑ tetra a c etic a cid _;

.^{H. E .,he m ato xy}l^{in a nd e o}.^{sin e ; M M C, mito myciII C ; M M P,rn姉Iix m eta11叩r Ot.e}由^{a s e};】M T T ,

3^‑(⁴,5^‑dim eth_ylthia zol^q2^‑_yl)^‑2,5^‑di_phenyltetr a z oliu m bro mide ; O D, Op tical de n sit y ; P B$^{, pho卑Phate‑buffered}

3 9 2 偽

ら びに転 移 巣 治療 実 験 系^の確立 を 目指し, 受 精 鶏 卵 法^によ るヒ

ト骨 軟 部 悪 性度 瘍 細 胞^の転移 実 験お よ び微 小転 移 巣^に対 する抗 が ん剤感受 性 試験を検 討し た.

材料 および 方 法

Ⅰ. 腫 瘍 細 胞七培 養

本 研 究^の転 移実 験に用^いた^ヒト腫 疹 細 胞株^は, 線 維 肉腫 細 胞 H T^‑1 0 8 0⁸¹[^{Am e ric a n T}y p^e Cultu r e Co11e ctio n (A T C C),

Ro ckvill,M D, U S A か ら購入] と 以下の6種^の骨 肉腫 細胞, 当 教 室^で樹 立 ^し継 代^して き^{た ヒ} ト骨 肉 腫 由 来 細 胞 (^{hu ma n}

O St_{e O}ge nic s a r c o m a Taka s e str ain, O S T)^{T l}, M N N G/^{H O S8)} (A T C C か ら購^入), M G^‑63^g)(^{A T C C} か ら購入), K H O S^‑31 2 H^川 (A T C C か ら購入),S K^‑E S‑^{11 1 )}(A T C C か ら購入), U^‑2 0 S^{1 2 }}( 住 友 製 薬 研 究 所, 大 阪よ り供 与) ^の計⁷種 類^であ^る. 組 織 培 養 液^は 1 0% (^v/^{v) 非 働 化ウシ胎 児血}清 (f^etal c alf s e r u m , F C S)(G I B^‑ C O,Gr a nd Isla nd,N Y, U S A) と 0^.3mg/^{ml グル タ ミソ}(^日水 製 薬, 東 京) ^を含 む^{R P M I‑1 64 0} 培 地 (^{ニ プロ} , 大 阪) である^. 各 細 胞は阻 織 培 養 液 中^において, 5% C O2 濃 度, 3 7 ℃ で培 養し た. 移 植 用の細胞 浮 遊 液^は以下^のよう^に調整^{し た.} 0^､0 2% ト リ プシ ソ(^{GI F C O}, D_etr oit, M ichり U S A)^‑0^.2% ^{エ チ レ}ンジア ミン

四酢 酸^{ニ ナ ト}リ ウ^ム(ethyle n ed ia min etetr a a c etic a cid, E D T A) を含^{む 0･1 5 M リ ン}酸 緩 衝 生理食 塩 液 (pho sphate^‑buffe r ed

S alin e,P B S) を用^{い て}細 胞を剥離し た後∴組織 培 養 液^を用^いて 細 胞 浮 遊液^{1 ×1 0T}個/^ml を作 製^{し た.} 移植^に用^いた腫 瘍 細 胞^の 浮 遊 液^は, ト リ^バン プル ^ー色 素 排 除 試 験法に よ り, 9 0% 以上^の 生細 胞^がある^こと を確 認^{し た.}

Ⅱ. 実 験 動 物

本研 究^で腫 瘍 移 植^の宿 主動 物と し て用いた受 精 鶏 卵 (^{プ リマ}

ス ロ _ック薩^{× ホ ワイ トレグホン}種) は後 藤 僻 卵 場 ( 岐 阜) ^{よ り}購 入 し, 加 湿し た紆 卵 器 中3 7 ℃で貯 卵さ せ た^.

Ⅲ. 腫 瘍 細 胞^の移 植 方 法

受 精 鶏 卵^の模 式 図を 図 1 ^に示し, 腫 瘍 細 胞^の移 植 方 法を以下

に記述 する^. 酵 卵1 0 日日^の鶏卵を透 光^し, 凍 尿膜^上の血管^の位 置を定^め , そ ^こを中心^に回転 式の ヤ ^ス リ を 用い て卵 殻^に 1c m x O^.5c m 程 度^の傷を付 け, ピンセ ット を 用^いて卵 殻を除 去 し た. 露 出^{し た}卵 殻 膜^に流 動^{パ ラフ} ィ ン ( M^{e r c}k, Da r m stadt,

Ge r m a ny) を滴 下し血管を見やすくし, 3 0 ゲ ^ー ジ針^の付^いた注

射 器を用^いて 1 ^×1 0⁶個 (^0.1ml) ^の腫 瘍 細 胞^を凍 尿 膜^上の血管 内

に移植した^.

Ⅳ^. 転 移 巣 治 療 実 験

抗^{が ん}剤^{によ る}治 療 実験を行なう 場 合に ほ腫 瘍 細 胞 移 植3 日

後仁即ち貯 卵1 3 日 目に, Ⅲに記述L た方 法で卵 殻^の別の部位に

窓を開け,3 0 ゲ ^ー ジの注 射 針を 用^{い て} 0^･1

,

mlの抗^{が ん}剤を投 与

し た^･ 薬 剤 濃 度^ほ臨 床 投 与 量を参考^{に し}, 鶏 卵 胎 児^の平均体 重 ( 肝 卵1 3 日 目 で 5^･1g) に換 箕して決 定し た( 表1). 抗が ん割と し てアドリ ア^マイシ ン(adria m ycin,A D M)(協 和 醸 軌 東 京), シ ス

プラ チン(^cis‑^{P土atin u m ,C D D P})(^日本 化 薬,東 京), サイ^クロフ ォ ス フ_ァ マイ ド (CyClopho spha mide, C P M)(塩 野 義 製 * , 大 阪),

ビンブラスチ ン(^vinbla stin e,V L B)( 塩 野 義 製 薬),

マイ ト^マイシ

ン C (mito mycinC, M M C ) (^三 共, 東 京), エ トポ サイ ド (etopo side, V P^‑1 6)(^{ブリス ト ル ･ マイヤ ー ズ ･ ス} クイ ブ, 束 京) を用^いた･ 移 植 後7 日 目 即 ち将 卵1 7 日 冒^に胎 児を解 剖^し,

摘 出した肝お よ び肺か ら D N A を抽 出した.

V . D N A 抽 出と鋳 型^{D r( A の}調 製

ヒ ト腫 瘍 培 養 細 胞ま た ほ鶏卵 胎 児よ り摘 出し た肝(約^0.5g) お よ び肺 (約0^･1 5g) ^{か らの D N A} 抽 出^は, 以 下^に示す 方法^で行

な った^{1 3 )}. 鶏 卵 肝及 び肺を 4ml の 0^.1 M 塩 化^ナ ト リ ウム ;

O¹2 M ^シ ョ 糖;0^･01 M E D T A;0^.3 M Tris^qH C l 緩 衝 液 (pH 8.0 )中 で破 砕^{し た.} 各 破 砕 液^ほフ ァル コ ン2 0 5 9 チ ュ

ー ブ (Be ct_{o n}

D ickin s o n, NJ^,U S A) ^に入 れ, 2 5 0plの1 0% ドデシ ル硫 酸^{ナ ト リ} ウム(s odiu m dode cyls ulfate,S D S) を加え攫 拝し,6 5 ℃の温洛 中に お^{い て}3 0分 間 加 温^{し た.} さ ら に, 6 0 0〟1 の 8 M 酢 酸カ リウ ム pH 5^･2 を加え, 控 搾 後 水 中に6 0分 間 静 置^{し た.} 氷 冷 後, 4

℃, 1 1,0 0 0rpm にお^いて 2 0分 間遠心 し, 上清を新た なチュ

ー ブ

に回収し た ^. ク^{ロ ロ} ホ ル ム 2ml, Tris^‑E D T A (^{T E}) 緩 衝 液

F i_g･1･ S_che m a of the fe rtiliz ed eg g^. Tu m o r c ells w e r e

inj^{e cted into} the cho rio alla ntoic m e m br a n e ( C A M ) ^vein of l O‑^day‑^{01d ch ick e m br}yo s with a 3 0 ga uge n e ed le thr ough the sheu m e m br a n e.

Tablel^･ Antitu m o rdr ugs a nd do s e sfo rthe che mo s e n siti vit y te st

Dr ug C linic al do s e Expe rim e ntal do s e(J 唱/^eg g)

A dria my^cin (^{A D M}) Cis^‑platin u m (^{C D D P}) Cyclopho sphomi de(C P M) Etop^{o s}i de(^{V P‑1 6}) M ito my^cin C (^{M M C}) V inb la stin e(V L B)

60 m g/ ^m2

1 0 0 m g/^{m 2}

1 2 0 0 m g/ ^m2

6 0 m g/^{m Z}

l m g/^kg O.2 m g/^kg

1 0,2 0,4 0,8 0 5,1 0,2 0 1 0 0,2 5 0,5 0 0

2 0,4 0 2 0,4 0 0.5,1 T he e xp^{e r}im e ntal do s e s w e r e det_{e r}mi n ed a c c o rding to the clinic al do s e s.

S alin e; P C R, p^Oly m e r a s e ch ai n r e a ctio n; S D S, S Odiu m dode cyl s ulfate; S S C , S al in e s odiu m citr at_{e ;} T E, Tris

E D T A _; V L B , Vinbl^as tin e ; V P^‑1 6, etOp^{O S}ide