スイゼンジノリ由来高分子多糖サクランの医薬分野への応用

(1)

崇城大学学位論文

スイゼンジノリ由来高分子多糖サクランの医薬分野への応用

令和２年度

後藤美和

(2)

崇城大学学位論文

スイゼンジノリ由来高分子多糖サクランの医薬分野への応用

March 2021 後藤美和

Application of sacran, a sulfated polysaccharide, to the medical and pharmaceutical fields

Miwa Goto

(3)

Application of sacran, a sulfated polysaccharide, to the medical and pharmaceutical fields

Miwa Goto

Sacran, a polysaccharide that is extracted from the Japanese indigenous cyanobacterium Aphanothece sacrum, has an extremely high molecular weight (Mw: 1.6 × 10

⁷

) with a high content of anionic sugars such as sulfated muramic acid and a low content of cationic sugars. It is a new type of sulfated polysaccharide and is thought to be a sufficiently safe and water-soluble biomaterial that can be used in pharmaceutical applications. In fact, sacran has various physiological activities such as wound healing etc. However, our knowledge concerning the medical uses of sacran is currently limited.

Therefore, the potential for the application of sacran to the medical and pharmaceutical fields including an oral form was investigated.

1) Renoprotective and antioxidant activity of sacran in chronic kidney disease (CKD) model rats

This study was examined the potential health benefits of sacran on kidney injury, oxidative stress and gut microbiota, compared to a group treated with AST-120 or a non-treatment group in 5/6 nephrectomy rats. Sacran (10, 20 and 40 mg/day), or AST-120 (40 mg/day) as an oral absorbent were orally administered to 5/6 nephrectomy rats for 4 weeks. As a result, sacran was observed to decrease the extent of renal biochemical parameters and oxidative stress in plasma and kidney injury with the increment of TGF-β

1

in a concentration dependent manner, compared with the non-treatment group.

These effects are similar to those observed for an AST-120 treatment. At the

genus level, only sacran administration caused a significant increase in the

useful genus of Lactobacillus, compared with a similar treatment with the

non-treatment group. It was concluded that sacran administration has the

(4)

potential to reduce the absorption of indole into the blood and to improve several gut microbiotas, in the gastrointestinal tract, thereby inhibiting the subsequent development of oxidative stress and renal markers in the systematic circulation on CKD.

2) Sacran suppresses the absorption of lipids and modulates the intestinal flora in non-alcoholic steatohepatitis (NASH) model rats

The objective of this study was to investigate the effects of administering

sacran on liver biology, gut microbiota, oxidative stress, and inflammation,

compared with that for surface-deacetylated chitin nanofiber (SDACNFs) or

a non-treatment group on stroke-prone spontaneously hypertensive

(SHRSP5/Dmcr) rats that develop fibrotic steatohepatitis with histological

similarities to that of NASH. As a result, sacran administration was observed

to decrease the extent of oxidative stress and hepatic biochemical parameters

in the plasma and hepatic injury with the levels of TGF-β

1

and TNF-α, being

increased, compared with the non-treatment group. This effect was found to

be similar to that for treatment with SDACNFs. At the genus level, the

administration of sacran and SDACNFs caused a significant decrease in the

harmful Prevotella genus, and a significant increase in the useful Blautia

genus, compared with the non-treatment group. It is noteworthy that this

effect of sacran is higher than that of SDACNFs. It was concluded that sacran

administration has the potential to reduce the absorption of lipids into the

blood and to improve several gut microbiotas, in the gastrointestinal tract,

thereby inhibiting the subsequent development of oxidative stress and

hepatic markers in the systematic circulation on NASH.

(5)

3) Preparation and evaluation of sacran/ SDACNFs pellets for use as an extended-release excipient

The use of sacran as an extended-release excipient for tetrahydrocurcumin (THC), a model drug that is used to treat wounds via its radical scavenging ability was examined. The THC used in the study was complexed with 2- hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CyD), which increases its water solubility. The values for the radical scavenging activity of the THC/HP-β- CyD complex (molar ratio of 1:1) were significantly higher than the corresponding values for SDACNFs or sacran alone. The rate of release of THC from the sacran/SDACNFs pellets containing the THC/HP-β-CyD complex decreased with increasing sacran content in the pellet, suggesting that sacran/SDACNF (1:1) and sacran alone pellets could function as extended-release excipients for THC. The findings reported here suggest that this can be attributed to the ability of the sacran component to retain fluids, thus extending the effects of the drug. In view of the above experimental outcomes, i.e. wound healing efficacy, fluid absorption, retention and the extended drug release of the system indicates that this preparation, in the appropriate ratios, has the potential for use as a controlled-release drug in wound healing.

In conclusion, sacran or their interpolymer complex could be used for several

clinical applications because of their safety and multifunction.

(6)

本論文で使用した略語一覧

AD Atopic dermatitis

アトピー性皮膚炎

ALT Alanine aminotransferase

アラニンアミノ基転移酵素

AST Aspartate aminotransferase

アスパラギン酸アミノ基転移酵素

BG Blood glucose

血糖

BUN Blood urea nitrogen

尿素窒素

CKD Chronic kidney disease

慢性腎臓病

CRE Creatinine

クレアチニン

CVD Cardiovascular diseases

心血管系疾患

CyD Cyclodextrin

シクロデキストリン

ESKD End-stage kidney disease

末期腎不全

HFC High-fat and -cholesterol

高脂肪-高コレステロール

HP-β-CyD 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin

ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン

IP Inorganic phosphorus

無機リン

IS Indoxyl sulfate

インドキシル硫酸

NASH Nonalcoholic steatohepatitis

非アルコール性脂肪肝炎

NAFL Nonalcoholic fatty liver

非アルコール性脂肪肝

NAFLD Nonalcoholic fatty liver disease

非アルコール性脂肪性肝疾患

PAO Potential antioxidant

抗酸化能

ROS Reactive oxygen species

活性酸素種

SDACNFs Surface-deacetylated chitin nanofibers

表面脱アセチル化キチンナノファイバー

TC Total cholesterol

総コレステロール

TG Triglyceride

中性脂肪

THC Tetrahydrocurcumin

テトラヒドロクルクミン

(7)

本論文は，学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである．

1) Sacran, a high-molecular weight polysaccharide inhibits renal injury and oxidative stress in chronic renal failure model rats, J. Nutri. Bio., 4, 267-275 (2018).

M. Goto, D. Iohara, S. Kaneko, T. Higashi, K. Motoyama, T. Maruyama, K. Uekama, F.

Hirayama, M. Otagiri and M. Anraku.

2) Preparation and evaluation of freeze dried surface-deacetylated chitin nanofiber/sacran pellets for use as an extended-release excipient, Int. J. Biol. Macromol., 124, 888-894 (2019).

M. Goto, S. Ifuku, K. Azuma, H. Arima, S. Kaneko, D. Iohara, F. Hirayama and M. Anraku.

3) Effects of surface-deacetylated chitin nanofibers on non-alcoholic steatohepatitis model rats and their gut microbiota, Int. J. Biol. Macromol ., 164, 659-666 (2020).

M. Goto, D. Iohara, A. Michihara, S. Ifuku, K. Azuma, D. Kadowaki, T. Maruyama, M.

Otagiri, F. Hirayama and M. Anraku.

4) Sacran, a sulfated polysaccharide, suppresses the absorption of lipids and modulates the intestinal flora in non-alcoholic steatohepatitis model rats, Life Sci ., 268, 118991 (2021).

M. Goto, K. Azuma, H. Arima, S. Kaneko, T. Higashi, K. Motoyama, A. Michihara, T.

Shimizu, D. Kadowaki, T. Maruyama, M. Otagiri, D. Iohara, F. Hirayama and M. Anraku.

(8)

緒言 ... 1

第１章慢性腎臓病モデルラットにおけるサクランの腎不全進行，酸化ストレスの抑制及び腸内細菌叢に関する検討 ... 5

第１節序 ... 5

第２節

In vitro

におけるサクランのインドール吸着能評価 ... 7

第３節サクラン自由摂取による至適投与量の検討... 7

第４節サクランの腎保護及び抗酸化効果 ... 9

第５節サクランの腸内細菌叢への影響 ... 10

第６節サクランを投与したラットの腎組織の観察... 10

第７節考察... 13

第８節小括... 16

第２章非アルコール性脂肪肝炎モデルラットにおけるサクランの肝炎進行，酸化ストレスの抑制及び腸内細菌叢に関する検討 ...17

第１節序 ... 17

第２節サクラン経口投与による至適投与量の検討... 19

第３節サクランの体重・臓器重量に対する影響 ... 20

第４節サクランの肝保護及び抗酸化効果 ... 21

第５節サクランの腸内細菌叢への影響 ... 22

第６節サクランの肝組織に対する影響 ... 22

第７節考察... 25

第８節小括... 27

第３章サクラン/SDACNFs 貼付剤の創傷治癒に関する検討 ...28

第１節序 ... 28

第２節 THC/HP-β-CyD含有サクラン/SDACNFs 貼付剤の調製... 30

第３節サクラン/SDACNFs 貼付剤の吸水性・保水性評価... 31

(9)

第４節サクラン/SDACNFs 貼付剤の徐放性評価 ... 34

第５節サクラン/SDACNFs 貼付剤の創傷治癒効果 ... 36

第６節考察... 37

第７節小括... 40

総括 ... 41

実験の部 ... 45

参考文献 ... 55

謝辞 ... 65

(10)

1

緒言

スイゼンジノリは江戸時代から食用として用いられており，細川藩(熊本)では「清水苔」，秋月藩(福岡)では「寿泉苔」の名称で使用され，江戸幕府へも献上されていた高級食材である^1,2)．

1872

年にオランダの植物学者スリンガーにより日本固有の淡水性藍藻として『日本藻類図鑑』の中で初めて学術的に紹介され，スイゼンジノリ(学名：

Aphanothece sacrum (Sur.) Okada)と命名され

た^1,2)．

スイゼンジノリは阿蘇山(熊本)の岩盤からの湧水が流れ込む河川がある地域に生息していたが，

高度経済成長期における水質汚染など河川の環境変化が原因で徐々にその生育環境は狭まり，現在は熊本県と福岡県の一部でのみ生育が確認されている．1997年には絶滅危惧種

IA

類に分類され，人の手を借りずに自然の状態で生育することは極めて困難な状況である．そのため，スイゼンジノリの養殖技術の研究開発が進み，近年では安定供給が可能になりつつあり，単に食用ではなく，機能性食品としての利用が期待されている^1,2)．さらに最近，スイゼンジノリの寒天質(Fig.

1a)の細胞外マトリックスから新規多糖類サクランが抽出され(Fig. 1b)，その構造及び機能が明ら

かにされつつあり，天然物由来であることから安全で副作用のない機能性素材としての活用も期待されている^1-3)．

Fig. 1 Macroscopic view of Aphanothece sacrum . Insert: ECM is present between cells in

microscopic image (a). Macroscopic view of sacran (the fibers formed) by precipitation of an

aqueous eluate into isopropanol (b)

⁴⁾．

(11)

2

サクランは平均分子量

1,600～2,900

万，分子鎖長

10 μm

以上の化学的には容易に切断されにくい，比較的強固な構造を持つ高分子多糖である ³⁾．サクランの構成単糖は，新規単糖である硫酸化ムラミン酸をはじめ

11

種類と非常に多く，官能基に硫酸基(糖残基あたり

12 mol%)，カルボ

キシル基(糖残基あたり

27 mol%)，わずかにアミド基を含んでいる．また，サクランは原核生物

由来であるにもかかわらず，動物由来多糖類グリコサミノグリカンと類似した官能基を持つアニオン性の硫酸化多糖である(Fig. 2)^3-4)．

Fig. 2 Structure of sacran

^3-4)

.

サクランの物性の大きな特徴として，乾燥重量に対する

6,100

倍もの保水力が報告され，その保水力は実にヒアルロン酸の約

5~6

倍とも言われている ⁴⁾．また，生理食塩水のような塩添加時でもヒアルロン酸に比べて約

10

倍という高い保水力を有している⁴⁾．これはサクランが極めて大きな分子量を持つだけでなく，サクラン分子を構成している硫酸化ムラミン酸をはじめとした多数の単糖による高い水溶性が起因しているものと考えられる．また，サクランのアニオン性硫酸化多糖の性質を活かしてカチオン性重金属イオンとの静電相互作用によるハイドロゲルの形成が報告されており，その吸着作用を利用してレアメタルの回収への応用が期待されている ^4-6,8)．さらなる応用例として，サクランを含有した繊維が開発され(サクラン・レーヨン混紡繊維"サク・レ

TM

")，合成繊維からなる肌着の着用で痒みの出る高齢者，肌の弱い方，乳幼児をターゲットにした

肌に優しいルームウエアとして製品化されている ⁹⁾．また，肌の保護効果を期待して，サクランとポリオール類を共存させた化粧品の製品化も進んでいる¹⁰⁾．このようにサクランを用いた様々な製品の研究開発が進んでいる．

一方で，サクランの構成分子である硫酸化多糖を含む多くの多糖類が様々な生理活性を有することが報告されている．例えばコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸は変形性膝関節症や関節リウ

(12)

3

マチ，シェーグレン症候群の炎症性疾患に用いる医薬品であり，抗炎症作用をもつことが示唆さ

れている^{11, 12)}．またフコイダンは抗炎症作用だけではなく，抗がん・抗腫瘍作用，免疫調節作用

など様々な生物学的・薬理学的活性を有しており，近年フコイダン関連の栄養補助食品や機能性食品が注目されている ^{13, 14)}．これら硫酸化多糖類はいずれもグルコサミノグリカンであり，サクランも類似した構造を持つことから，抗炎症作用をはじめとした同様の効果が期待されている

15, 16)．事実，Ngatuらは，サクランのマウスへの経皮適用がアレルギー性皮膚炎の皮膚病変の発

症を優位に抑制し，皮膚バリアを改善し

Th

2サイトカイン産生をダウンレギュレーションすることにより，ひっかき行動の回数を減少させ，マウスの免疫グロブリン

E

と好酸球浸潤の抑制につながることを明らかにしている¹⁷⁾．また

Fukushima

らは，アトピー性皮膚炎の患者を対象にサクラン溶液を塗布した結果，炎症性サイトカインおよびケモカイン

mRNA

の産生抑制によるアトピー性皮膚炎の改善効果を確認している¹⁸⁾．このように外用剤としての応用は多数報告されているものの，サクラン摂取による臨床応用についての知見はほとんど見当たらない．そこで本研究ではサクランの経口摂取をはじめとした医薬への応用を最終目的として検討を行った．

検討を行うにあたり，近年腸内細菌叢の構成が健康に密接に関係していることが解明され始めており¹⁹⁾，腸内環境の適正化による疾病予防に注目が集まっていることにも着目した．腸内環境の適正化は，1965 年

Werner Kollath

によって抗生物質に対比される言葉として提唱され ²⁰⁾，

2001

年の国連食料農業機関/世界保健機関合同専門家会議にて「適正な量を摂取したときに宿主に有用な作用を示す生菌」と定義された ²¹⁾プロバイオティクス効果と，1994 年に

Gibson

と

Roberfroid

により「大腸の有用菌の増殖を選択的に促進し，宿主の健康を増進する難消化性食品」

と提唱された²²⁾プレバイオティクス効果がこれに寄与している．プレバイオティクスの主な種類はオリゴ糖，食物繊維などであるが ²²⁾

, Lynch

らは硫酸化多糖であるフコイダンをブタに与えることで大腸の近位及び遠位側の脂肪酸が増加したことからフコイダンがプレバイオティクス効果を持つと報告した²³⁾．また

Huang

らは海藻より抽出した硫酸化多糖

Gracilaria Lemaneiformis

のメタボリックシンドロームモデルマウスに対する脂質抑制効果及び腸内細菌叢の改善効果を報告している²⁴⁾．このことより，同じ硫酸化多糖であるサクランもプレバイオティクス効果を持つ可能性が期待できると考えた．

(13)

4

そこで，第

1

章及び

2

章では腸内細菌叢と病態の改善の関連が報告されている慢性腎臓病

（

chronic kidney disease : CKD）及び非アルコール性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis:

NASH)に着目して検討を行った．第 1

章では，CKDにおける尿毒症物質の一つであるインドキ

シル硫酸(indoxyl sulfate: IS)に着目し，その前駆体であるインドールのサクランへの吸着能，

CKD

モデルラットにおけるサクランの腎保護効果及び酸化ストレス抑制効果について，尿毒症吸着剤であるクレメジン^🄬

(AST-120)との比較を行い，サクランのプレバイオティクス効果も併せて

検討を行った．第

2

章では，NASHモデルラットにおけるサクランの肝炎進行及び酸化ストレスの抑制効果について，脂質吸着作用 ²⁵⁾，腎保護作用 ²⁶⁾，創傷治癒促進作用²⁷⁾，抗酸化作用 ²⁸⁾など多面的効果が認められ，特定保健用食品や創傷被覆材として活用されている天然多糖類キトサンより生成した表面脱アセチル化キチンナノファイバー(surface deacetylated chitin nanofibers:

SDACNFs)との比較を行い，CKD

と同様にサクランのプレバイオティクス効果も併せて検討を

行った．第

3

章では，前章で用いた

SDACNFs

がカチオン性高分子²⁹⁾，サクランがアニオン性高分子^3-4)であることに着目し，天然の多糖類を組み合わせることによる静電相互作用を利用した製剤素材への応用について検討すべく，サクラン/SDACNFs貼付剤の創傷治癒に関する検討を行った．以下に本研究で得られた知見を詳述する．

(14)

5

第１章慢性腎臓病モデルラットにおけるサクランの腎不全進行，酸化ストレスの抑制及び腸内細菌叢に関する検討

第１節序

本邦において腎疾患は国民の健康に重大な影響を及ぼしている．慢性腎臓病（

chronic kidney

disease: CKD）は腎障害や腎機能の低下が不可逆的に進行する疾患であるが，CKD

が進行する

と末期腎不全（end-stage kidney disease: ESKD）に至り，透析療法や腎移植術のような腎代替療法が必要となる ³⁰⁾．2019 年における死因別死亡総数のうち，腎不全は全死因の上位から

8

番目に位置し，2018年末における維持透析患者数は約

34

万人と増加を続けている³¹⁾．高額な医療費や透析療法の長期化に伴う合併症にかかる医療費など，医療経済的にも透析導入をいかに遅らせるかが重要な課題となっている³⁰⁾．また，

CKD

の死亡原因で，心不全・脳血管障害・心筋梗塞を併せた心血管系疾患(cardiovascular diseases: CVD)は全体の

3

分の

1

を占めており， CKDの合併が

CVD

には深く関与しているといわれている^30-32)．

CKD

患者の生命予後に大きな悪影響を及ぼす因子として尿毒症物質が挙げられる．尿毒症物質は腎機能障害の進行により体内に蓄積し，かつ

CKD

患者に生じる様々な尿毒症症状に悪影響を及ぼす化合物と定義されている³³⁾．

IS

は代表的な尿毒症物質の一つであり，腸内細菌叢の大腸菌などにより食事由来のトリプトファンから生成されるインドールが消化管吸収され，肝臓で水酸化，次いで硫酸抱合を受けることにより生成される^{34, 35)}．

IS

は血中で大部分がアルブミンと結合した状態で存在しており，代謝を受けずに腎臓から排泄される．そのため腎機能の低下により血中に高濃度に蓄積するようになり，透析患者では血中濃度が正常時の

40～60

倍近くまで増加することがある ^36-39)．この

IS

の蓄積は尿細管上皮細胞においてフリーラジカルの産生亢進を誘発し，さらに血管内のストレス亢進にも関与することが知られている⁴⁰⁾．したがって，消化管内でインドールを吸着し，糞中に排出することが腎不全進行及び酸化ストレスを軽減させる重要な治療方針の一つと考えられている(Fig. 3)．

(15)

6 Fig. 3 Production and excretion pathway of indoxyl sulfate and its relation to CKD and CVD

^32-

39)

.

経口球形吸着炭製剤であるクレメジン^®

(AST-120)

は消化管で

IS

の前駆物質であるインドールを吸着して糞中に排泄することにより血漿中

IS

濃度を低下させ，CKD患者における「尿毒症症状の改善及び透析導入の遅延」を目的に，

1991

年に承認発売が開始された薬剤である⁴¹⁾．しかしながら，AST-120は服用のしづらさや便秘等消化器症状の副作用の影響により，コンプライアンスを確保しづらい薬剤である．高タンパク結合性である

IS

は通常の血液透析では効果的に除去できず，透析導入後も高濃度を示すにもかかわらず，維持透析治療導入後の患者に対する

AST-120

の使用は保険適応外であり，通常保険診療では使用できないという問題点もある．

これまでに，サクランと同様の硫酸化多糖であるフコイダンが血漿クレアチニン値と血漿尿素窒素を下げることで腎保護効果を示すことが示唆されている⁴²⁾．また，フコイダンのような藻類多糖類がプレバイオティクスとして最近利用されつつある⁴³⁾．そして近年，腎臓病の病態において，腸内細菌叢を含む腸内環境の変化が報告されており，腸内細菌叢のバランス制御が

CKD

の進展予防に重要であることが示唆されている⁴⁴⁾．そこで，本章ではサクランの

in vitro

における

IS

前駆体インドールの吸着に加え，

5/6

腎臓摘出ラットに対する腎保護効果について

in vivo

における検討を行い，併せてサクランのプレバイオティクス作用についても検討した．

(16)

7

第２節

In vitro

におけるサクランのインドール吸着能評価

In vitro

におけるサクランのインドール吸着能について，

AST-120

と比較検討を行った．

24

時

間後におけるインドール吸着を比較した結果，

AST-120

と比較して低い吸着能を示した (Fig. 4)．

また

Langmuir

の吸着等温式から算出したサクランの最大吸着量(qm

)は AST-120

の約

22％であ

った(サクラン最大吸着量

q

m

: 29 mg/g, AST-120

最大吸着量

q

m

: 130 mg/g)．

Fig. 4 Adsorption ability of sacran and AST-120 against indole after 24hr. Results are shown for sacran (white circle), AST-120 (black circle). For each group, n=3. Values are expressed as the mean

± SEM.

p **<0.01, compared to AST-120 group. (student’s t-test)

第３節サクラン自由摂取による至適投与量の検討

サクランの腎不全に対する効果を

5/6

腎臓摘出術を施行した

CKD

モデルラットを用いて検討した．4週間の予備飼育後，サクラン投与群・非投与群に分け，サクラン

0.25 w/v％水溶液を自

由飲水形式にて

4

週間投与した．4 週後の生存率を比較した結果，非投与群に比べ，投与群では生存率の上昇が確認された．またサクラン摂取量別の生存率を比較した結果，サクランの

1

日摂

取量が

19 mg

以上の

CKD

モデルラットで生存率が大幅に上昇していた(Fig. 5)．

(17)

8 Fig. 5 Survival probability of CKD model rats after 4 weeks in condition (a) Sacran-

administered / Non-administered and (b) based on an average daily intake of 19 mg of sacran.

(18)

9

第４節サクランの腎保護及び抗酸化効果

第

3

節の結果を踏まえ，サクラン投与量を

10, 20, 40 mg

に設定し，投与

4

週後の腎不全抑制効果について，尿毒症吸着剤

AST-120

と比較検討した．5/6腎臓摘出術を施行したラットを予備飼育後，非投与群，サクラン

10, 20, 40 mg/day

投与群, AST-120 40 mg/day投与群にわけ，1回

投与量が

2 mL

となるように水溶液・懸濁液を調製し，ゾンデを用いて経口投与を行った．投与

0

週及び

4

週後に採血を行い，各種評価を行った．その結果，ポジティブコントロールである

AST- 120

投与群では，体重，血圧，生化学パラメータである血漿クレアチニン(creatinine:CRE)，尿素窒素(blood urea nitrogen: BUN)，無機リン(inorganic phosphorus:IP)，尿毒症物質の

IS，抗酸

化パラメータである血漿中抗酸化能(potential antioxidant:PAO)がすべて顕著に改善していた．

一方，サクラン投与群では，濃度依存的に腎不全のパラメータを改善していたが，20 mg/day投与以上はほぼ同等の抑制効果を示していた(Table 1)．

Table 1. Body weight and vital, biochemical and antioxidant parameters after administration of sacran and AST-120 to the CKD rats.

For each group, n = 4 - 5. Values are expressed as the mean ± SEM. p *< 0.05, p **< 0.01,

compared to non-administered group. (One-way factorial ANOVA). Abbreviations: BW = Body

weight, SBP = Systolic blood pressure, CRE = Creatinine, BUN = Blood urea nitrogen, IP =

Inorganic phosphorus, IS = Indoxyl sulfate, PAO = Potential antioxidant.

(19)

10

第５節サクランの腸内細菌叢への影響

第

2

節での検討より，

in vitro

におけるサクランのインドール吸着能が

AST-120

に比べて小さいにもかかわらず，第

4

節の検討において，サクラン投与群と

AST-120

投与群の

CRE

がほぼ同程度の低下を示した．そこで腸管内の細菌叢変動に着目し，投与

4

週後のサクラン

40 mg

投与群，

非投与群及び

AST-120 40 mg

投与群の糞をメタゲノム解析し，比較検討した．その結果，ヒト常在菌叢を構成する主な細菌主

Firmicutes

，

Bacteroidetes

，

Actinobacteria

，

Proteobacteria

，

Verrucomicrobia

の

5

門のうち，非投与群及び

AST-120

投与群に比べ，

Bacteroidetes

において増加傾向を示し，

Firmicutes

においては減少傾向を示した(Fig. 6a)．一般に，腸内細菌叢から発見された細菌の

90%

以上は

Bacteroidetes

，

Firmicutes

のわずか

2

門に存在する

Bacteroides

，

Alistipes

，

Prevotella

，

Porphyromonas

，

Clostridium

，

Dorea

，

Faecalibacterium

，

Eubacterium

，

Ruminococcus

，

Lactobacillus

属であることから，次にこれら属に着目し，3 群間のこれら属菌数の変動について比較検討した⁴⁵⁾．その結果，サクラン投与群は，非投与群及び

AST-120

投与群

に比べ，

Lactobacillus

属の顕著な増加が観察された(Fig. 6b)．また興味深いことに，この属菌数

と血漿

IS

濃度の間に負の相関(Fig. 6c)，また血中抗酸化能との間に正の相関が観察された(Fig.

6d)．

第６節サクランを投与したラットの腎組織の観察

サクラン投与

4

週後における腎臓切片を

Masson’s trichrome

染色し，組織学的観察を行った．

Masson’s trichrome

染色は，膠原繊維を染色する方法であり，組織の線維化を評価することがで

きる．その結果，サクラン投与群の方が非投与群に比べ，濃度依存的に腎尿細管の変性を伴う損傷が少なく，また，腎尿細管から間質領域における腎線維化や炎症細胞の浸潤も少ないことが観察された(Fig. 7)．

(20)

11 Fig. 6 Effect of sacran on the gut bacterial community in CKD rats.

Relative abundance of bacterial community at the phylum level (a) and significant differences

of lactobacillus (b) at the genius level. The correlation between the number of lactobacillus and

plasma IS (c) or plasma antioxidant potential (d).

(21)

12 Fig. 7 Representative histological photomicrograph of kidney sections by Masson’s trichrome staining after administration of sacran and AST-120.

Non-administered, Sacran-administrated and AST-120-administered CKD rats were

measured after 4 weeks of administration as described in materials and methods. Each scale

bar indicates 200 μm. Black arrows indicate kidney tissue damage and red arrows indicate

fibrosis.

(22)

13

第７節考察

本章では，サクランの

CKD

進行に対する抑制効果を検討した．硫酸化多糖であるフコイダンに腎保護効果の可能性が示唆されている報告があること，プレバイオティクスとしての効果があることを鑑み，同じ硫酸化多糖であるサクランを用いて検討を開始した．まず，インドール吸着能を

in vitro

で評価したところ，サクランの最大吸着量(qm

)は AST-120

の約

22％であった(サク

ラン最大吸着量

q

m

: 29 mg/g, AST-120

最大吸着量

q

m

: 130 mg/g)．次に，自由飲水形式にて 5/6

腎臓摘出術を施行した

CKD

モデルラットにサクラン水溶液を投与し，至適投与量を検討した結果，

サクラン非投与群に比べサクラン投与群は生存率の上昇を示し，サクラン

1

日摂取量

19 mg

以上で生存率は大幅に上昇した(Fig. 5)．この結果を基にサクラン

1

日投与量を

10，20，40 mg

に設定し，腎不全抑制効果を

AST-120

と比較検討を行った．その結果，濃度依存的にサクラン投与群は生化学パラメータ，抗酸化パラメータともに改善していたが，

in vitro

におけるサクランのインドール吸着能が

AST-120

に比べて低値を示したにもかかわらず，IS 濃度はほぼ同等の低下作用を示していた(Table 1)．そこで，新たな抑制メカニズムの一つとして腸管内の細菌叢変動との関連性について検討した．

今回，サクランは

CKD

モデルラット腸内の

Bacteroidetes / Firmicutes (B/F)比率を増加させ，

血中

IS

濃度を低下させた(Fig. 6a，Table 1)．この

B/F

比率は慢性疾患の指標として利用されており，高値ほど良いとされている．さらに，サクランの投与は，AST-120投与群および非投与群に比べて

Lactobacillus

属菌数の有意な増加を示した．一般に

Lactobacillus

^{は腸管細胞に直接作}

用し

tight junction

蛋白の発現を増加させ，物質の膜透過性を制御することが報告されている⁴⁶⁾．

またこの

Lactobacillus

は腎不全患者の腸管でその数が低下することにより，インドールをはじ

めとした尿毒症前駆物質の膜透過性が向上する可能性が示唆されている⁴⁷⁾．事実，本検討においても，

Lactobacillus

の菌量と血漿

IS

濃度との間に有意な負の相関を観察した(Fig. 6c)．このことより

Lactobacillus

の低下は

tight junction

の機能低下につながるだけでなく，インドールをはじめとした尿毒症物質の取り込み増加につながり，腎不全の進行に関与することが強く示唆された．これまでにも

5/6

腎臓摘出

CKD

モデルラットに

Lactobacillus

を含むプロバイオティクスを投与することで，寿命延長，

BUN

の低下を認めたという報告や，腹膜透析患者に対する

(23)

14 Lactobacillus

を含むプロバイオティクスの投与により，血中炎症性サイトカインやエンドトキシ

ン濃度を低下させることが報告されていることから，CKD 患者において，

Lactobacillus

を主とした腸内細菌叢が

CKD/尿毒症に対する新規の治療薬になる可能性を示している

^48,49)．また，これまでにも

AST-120

投与により，CKDモデルラットにおいて

Lactobacillus

属の増加は報告されているものの，サクランのような新たなプレバイオティクスとの比較は今回がはじめてであり，

AST-120

投与による

Lactobacillus

の増加率は，今回の結果ではサクランに及ばないものとなっ

た(Fig. 6b)．このことは，サクランが

AST-120

に比べ，インドール吸着能は低いものの，腸内細菌叢の安定化により寄与することにより，腎不全の進行抑制に寄与する可能性が強く示唆された

50,51)．また，

Lactobacillus

属と血漿中

PAO

との間に有意な正の相関が観察されたことから(Fig.

6d)，サクラン投与は，腎不全進行だけでなく，酸化ストレス軽減にも寄与している可能性が強く

示唆された．さらにサクラン投与

4

週間後の腎臓切片の組織学的観察を行ったところ，非投与群に比べ腎組織の損傷が少なく，腎線維化も少ないことが観察された (Fig. 7)．以上の結果より，

サクランの経口投与において，インドール吸着能に加えた腸内細菌叢の安定化，特に

Lactobacillus

の増加が

CKD

進行抑制及び酸化ストレス軽減に寄与している可能性が示唆された．

また

CKD

モデルラット糞便中のインドールを定量したところ，20 mg以上の投与で有意にインドールの糞中排泄が見られた．興味深いことに，このインドールの糞中排泄量は，AST-120投与群よりも高い値を示した．この要因として，サクランの消化管における吸着効果に加え，サクランの高い粘性と吸水力・保水力による尿毒症物質の消化管吸収抑制が考えられた．

本研究では，硫酸化多糖サクランの消化管内でのインドールの吸着と粘性による吸収抑制効果によって糞便中に排泄させることで尿毒症物質である

IS

濃度を減少させ，効率的に酸化ストレスを軽減し，さらにプレバイオティクスとして作用することで

CKD

進行を抑制することを見出した．現在，尿毒素吸着剤として認可されている

AST-120

は，透析導入前の尿毒症症状出現時期に服用を開始し，保険適応上透析導入開始とともに中止するという短期間の使用に留められている

41)．しかし，サクランは酸化ストレスが出現する腎不全初期の段階から使用することで効果的な腎保護作用が期待できる(Fig. 8)．

当研究室では過去に

SDACNFs

がインドールを吸着し，CKD 進行抑制および酸化ストレス抑制効果を発揮することを明らかにしている．本研究により，サクランについても

SDACNFs

と同

(24)

15

様，酸化ストレスをおさえ，CKD進行を抑制することが示唆された．今回の結果より，上記効果に加えて，サクランがプレバイオティクスとして腸内細菌叢を変化させることで

CKD

進行を抑える多面的効果を持つことが強く示唆された．

Fig. 8 Strategy to control renal failure progression.

(25)

16

第８節小括

本章では，サクランの医薬分野への応用を目的として，

CKD

モデルラットを用いてサクランの腎保護効果について検討した．以下に得られた知見を小括する．

１) 尿毒症物質

IS

の前駆物質であるインドールの最大吸着量を

Langmuir

の吸着等温式から算出した結果，サクランの最大吸着量は

AST-120

の約

22％であった．

２) サクランを投与することで生存率が上昇し，1日サクラン摂取量

19 mg

以上で生存率は大幅に上昇した．

３) サクランは濃度依存的に

CKD

関連パラメータを改善し，この効果は臨床で使用されている

AST-120

と同等であった．

４) 腸内細菌叢の解析より，サクランに

Lactobacillus

の増加に伴うプレバイオティクス効果が強く示唆された．

５) 腎臓組織の

Masson’s trichrome

染色の結果からサクランは腎組織の繊維化や損傷を抑えることが示された．

以上の結果より，サクランは尿毒素吸着効果，抗酸化効果およびプレバイオティクス効果等，

多面的な効果により腎不全の進行を抑えることが明らかとなった．

(26)

17

第２章非アルコール性脂肪肝炎モデルラットにおけるサクランの肝炎進行，酸化ストレスの抑制及び腸内細菌叢に関する検討

第１節序

非アルコール性脂肪性肝疾患(nonalcoholic fatty liver disease:NAFLD)は組織診断あるいは画像診断で脂肪肝を認め，アルコール性肝障害などほかの肝疾患を除外した病態である．

NAFLD

の多くは，肥満，糖尿病，脂質異常症，高血圧などを基盤に発症することから，メタボリックシンドロームの肝病変としてとらえられている．NAFLD は組織学的に大滴性の肝脂肪編成を基盤に発症し，病態がほとんど進行しないと考えられている非アルコール性脂肪肝(nonalcoholic fatty

liver:NAFL)と進行性で肝病変や肝癌の発症母地にもなる非アルコール性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis:NASH)に分類される(Fig. 9)． NASH

は，脂肪変性，炎症胞傷害(風船用変性)が特徴である⁵²⁾．

Fig. 9 The pathogenesis of NAFLD and NASH and the "Two-hit theory”

^54-57)

.

(27)

18

現在肥満人口の増加は先進国だけでなく発展途上国においても社会問題となるなど全世界的に増加の一途をたどっており，日本においても生活習慣の西欧化に伴い肥満人口，メタボリックシンドロームの患者の増加に伴って

NAFLD/NASH

の有病者数も増加している実態が明らかとなっている．NASHの病態においては単に肝細胞に脂肪が蓄積するだけではなく，肝臓に炎症や繊維化が惹起されやすくなり，最終的に肝硬変や肝癌に進行することが知られている．C 型肝炎を代表とするウイルス性肝炎の治療法が急速に進歩して，将来的にウイルスによる肝癌患者の減少が見込まれる中，NASHを基盤にした肝癌の増加が懸念されている⁵³⁾．

NAFLD/NASH

の病因は複雑であり，現在のところ仮説として

NAFL

に二次的ストレスが加わ

ることによって

NASH

にいたる

Two-hit theory

が広く認知されている(Fig. 9)^54-57)．また最近では炎症が脂肪化と同時，あるいは先行する機序(multiple parallel hit)も提唱されている⁵⁷⁾．酸化ストレスや小胞体ストレス，ミトコンドリア機能異常，オートファジー，などが

NASH

の病態に関与しているとされている ⁵⁸⁾．また，腸内細菌叢の変化に伴う自然免疫系賦活が

NASH

だけ

でなく

NAFLD

にも有益な変化をもたらすことが報告されている⁵⁹⁾．例えば，肝保護作用をもつ

とされるシリビンなどのベルベリンアルカロイドは，NAFLD を改善させるとともに，腸内細菌叢の組成を変化させることで短鎖脂肪酸の産生を亢進させ，また，二次胆汁酸のうち細胞毒性の強いデオキシコール酸，リトコール酸の産生を低下させることが示されている ⁶⁰⁾．したがって，

NASH

における腸内細菌叢の役割を解明することは，

NASH

に対する腸内細菌叢を標的とした治療法の確立につながるものと考えられる^61,62)．しかし，現在利用可能な

NASH

の治療法は限られており，食事療法・運動療法を含む生活習慣の改善と基礎疾患に対する対症療法が治療の基礎となっている．

前章の検討において，サクランが尿毒素吸着作用，抗酸化作用，腸内細菌叢の安定化作用など，

多面的に効果を発揮することが示唆された．この結果を考慮すると，NASHのような複合的疾患に対して，サクランのみで対処できる可能性がある．そこでサクランの

NASH

抑制効果について，

脂質吸着作用²⁵⁾，腎保護作用²⁶⁾，創傷治癒促進作用 ²⁷⁾，抗酸化作用 ²⁸⁾など多面的効果が認められ，特定保健用食品や創傷被覆材として既に活用されている表面脱アセチル化キチンナノファイバー(surface deacetylated chitin nanofibers: SDACNFs)と比較検討した．

(28)

19

また，このような疾患に対する治療効果を評価する際にはヒト

NASH

に類似した病態モデルを用いることが重要となる．Kitamoriらは，脳卒中易発症性高血圧自然発症ラットの亜系統である

SHRSP5/Dmcr

が，高脂肪-高コレステロール(high-fat and -cholesterol:HFC)飼料を与えることで短期間に重度の繊維化を含むヒト

NASH

に酷似した肝病変を呈することを報告している ⁶³⁾．今回の検討ではこのモデルラットを用いて，生化学パラメータ，血中抗酸化能，炎症・繊維化関連サイトカイン，腸内細菌叢の変動について評価を行い，NASH抑制効果について検討した．

第２節サクラン経口投与による至適投与量の検討

サクランによる

NASH

進行抑制効果の検討に際し，至適投与量を決定するため，健常ラットに対して，コーン油投与後，サクランを濃度依存的に投与し，サクランの消化管からのコーン油取り込み抑制による血漿中における中性脂肪(triglyceride:TG)の変動について検討した ⁶⁴⁾．その結果，サクラン

10 mg

投与群では，血漿

TG

の増加を抑制できなかったものの，サクラン

20 mg

投与群では，サクラン非投与群に比べて顕著な抑制効果を示した (Fig. 10)．以上の結果より，サクラン投与量を

20 mg/day

に設定し，以下の検討を行った．

Fig. 10 Effects of sacran on TG absorption in rats. Time-course for plasma TG levels is shown.

Rats were orally administered corn oil (5 ml/kg) and distilled water with or without sacran (10

and 20 mg/day each). Data are expressed as the mean ± S.E. p < 0.05 vs. the control group

(One-way factorial ANOVA).

(29)

20

第３節サクランの体重・臓器重量に対する影響

サクランによるNASH進行抑制効果を検討するため，

SHRSP/Dmcr

ラットを用いて検討した．

HFC

飼料を与え予備飼育を

1

週間行った後，未投与群，サクラン

20 mg/day

投与群，

SDACNFs

20 mg/day

投与群の

3

群に分けゾンデにて連日

8

週間経口投与を行った．0週，4週および

8

週

後の体重変化及び

8

週後の肝重量体重比の評価を行った結果，サクラン及び

SDACNFs

投与群において未投与群に比べ有意な体重減少を示した．また，肝重量体重比においてもこれら

2

種の多糖類において顕著な抑制を示した．以上の結果により，NASH形成を抑制している可能性が示唆された(Fig. 11)．

Fig. 11 Body weight variability at 0, 4 and 8 weeks (a) and liver weight to body weight ratio at

8 weeks (b) in the NASH model rats. Values are expressed as the mean ± SEM. p *<0.05,

p **<0.01, compared to non-administered group (One-way factorial ANOVA).

(30)

21

第４節サクランの肝保護及び抗酸化効果

各投与群の投与

8

週間後の生化学パラメータ，抗酸化パラメータ，炎症・線維化関連サイトカイン，収縮期血圧について比較検討した．その結果，収縮期血圧はサクラン投与群のみ有意に低下した．生化学パラメータにおいて総コレステロール(total cholesterol:TC)・TG・血糖値(blood

glucose:BG)は，サクラン投与群・SDACNFs

投与群ともに非投与群に比べ有意に低下した．肝機

能値においてもサクラン投与群・SDACNFs 投与群ともに未投与群にくらべ有意に低下していたが，その効果はサクラン投与群において顕著だった．抗酸化能(potential antioxidant:PAO)についてはサクラン投与群・SDACNFs 投与群ともに非投与群に比べて有意に上昇させた．肝組織におけるサイトカイン関連について，炎症性サイトカインである

TNF-α

及び繊維化パラメータである

TGF-β

1ともにサクラン投与群・SDACNFs投与群ともに非投与群に比べ低下させた(Table 2).

Table 2. Various parameters after 8 weeks of sacran and SDACNFs administration to the NASH model rats.

For each group, n = 5. Values are expressed as the mean ± SEM. p *< 0.05, compared to non-

administered group (One-way factorial ANOVA). Abbreviations: SBP = Systolic blood pressure,

TC = Total cholesterol, TG = triglycerides, BG = Blood glucose, PAO = Potential antioxidant.

(31)

22

第５節サクランの腸内細菌叢への影響

前章の腎不全の検討において，サクランが腸内環境の改善に寄与するプレバイオティクス機能を持つ可能性が示唆された．そこで

NASH

についても同様の機能があるのではないかと考え，投与

8

週間後の糞をメタゲノム解析し比較検討した．その結果，ヒト常在菌叢を構成する主な細菌主

Firmicutes

，

Bacteroidetes

，

Actinobacteria

，

Proteobacteria

，

Verrucomicrobia

の

5

門のうち，非投与群に比べ，サクラン及び

SDACNFs

投与群において

， Bacteroidetes

及び

Proteobacteria

において減少傾向を示し，

Firmicutes

においては増加傾向にあった．また，サクラン投与群のみ，ヒト常在菌叢ではない

Fusobacteria

において顕著な増加傾向を示した(Fig. 12a)．

また属菌数について

3

群間で比較検討した結果，非投与群に比べ，サクラン及び

SDACNFs

投与群において

Blautia

属菌数の増加及び

Prevotella

属菌数の減少が観察された(Fig. 12b)．加えて，非投与群に比べ，サクラン投与群においてのみ，

Fusobacterium

属菌数の増加が観察された

(Fig. 12b)．また，肥満の指標の一つである Blautia

属菌数と肝重量体重比に負の有意な相関が観

察された(Fig. 12c)．以上の結果より，サクラン及び

SDACNFs

投与は，それぞれ腸内細菌叢に対する影響が異なる可能性が示唆された

.

第６節サクランの肝組織に対する影響

サクラン投与

8

週後の肝臓を摘出後，繊維化の状態を見る

AZAN

染色(Azan stain)，組織の成り立ちを概観する

HE

染色(Hematoxylin-Eosin Stain)を行った．染色の結果，全体的に風船化はみられていたものの，脂肪沈着，炎症細胞の浸潤，線維化は未治療群に顕著に観察された．また，

SDACNFs

投与群に比べ，サクラン投与群は脂肪の沈着や組織の繊維化が見られず，肝保護作用

を示していることが示唆された(Fig. 13).

(32)

23 Fig. 12 Relative abundance of bacterial community at the phylum level (a) and OTU counts of

the genius level (b). The correlation between the OTU counts of Blautia and the relative ratio

of Liver/Body weight (c). Values are expressed as the mean ± SEM. p *<0.05, compared to non-

administered group (One-way factorial ANOVA).

(33)

24 Fig. 13 Histological observation of liver sections after 8 weeks of administration. Black arrows

indicate fat deposition and white arrows indicate ballooning. The blue arrows indicate

inflammatory cell infiltration, and the yellow arrows indicate tissue fibrosis. Each scale bar

indicates 50 μm.

(34)

25

第７節考察

本章では，サクランの

NASH

進行抑制効果を，既に脂質吸着効果 ²⁵⁾をはじめとする多面的効果が認められ特定保健用食品として広く認知されている

SDACNFs

と比較検討を行った．

NAFLD/NASH

の発症は肥満と強く関連していることが明らかとなっており，高度肥満者におけ

る

NASH

有病率が非肥満者に比べ高いことがよく知られている^65,66)．また

NAFLD/NASH

の身体所見として肝腫大を認めることがあるため，はじめに体重・臓器重量に対するサクランの影響を検討した．その結果，サクラン及び

SDACNFs

投与群において未投与群に比べ有意な体重減少を示していた．また，肝重量体重比においてもこれら

2

種の多糖類において顕著な抑制を示した．

以上の結果により，サクランは

NASH

形成前段階の

NAFL

の増加を抑制している可能性が示唆された (Fig. 11)．そこで次に

NASH

モデルラットにサクランを投与し，肝臓に与える影響と

NASH

進行のリスクファクターとされる酸化ストレスの抑制効果を検討した．サクラン投与群は非投与群に比べて，収縮期血圧，

TC

や

TG

の脂質，アスパラギン酸アミノ基転換酵素（aspartate

aminotransferase: AST）やアラニンアミノ基転換酵素（alanine aminotransferase: ALT）の肝

機能，BG，PAO，肝組織の繊維化に関与する

TGF-β

1を有意に改善させ，肝組織の炎症状態に関

与する

TNF-α

についてもサクランの投与で改善傾向を示した (Table 2)．これは

NAFL

に二次

的ストレスが加わることによって

NASH

にいたると提唱されている機序，”Two-hit theory” ^53-56) や，炎症が脂肪化と同時，あるいは先行する機序と提唱されている”multiple parallel hit”⁵⁷⁾の二次性ストレスや危険因子とされるものを改善させていることより, NASH 進行抑制にサクランが寄与していると考えられる．また，腸内細菌叢が

NASH

進行抑制に関与しているという報告があるため，サクランの腸内細菌叢に対する影響について検討を行った．腸内細菌叢は動物の消化不良や栄養吸収，食物の代謝によるエネルギーの放出などに大きな役割を果たしていることが報告されている．このことから，消化器疾患や腸管ストレス，酸化ストレスに腸内細菌叢が関与していることが考えられる．

今回，サクラン及び

SDACNFs

投与群において，

Bacteroidetes

^門の

Prevotella

^{属の減少と}

Firmicutes

^門の

Blautia

属の顕著な増加を観察した (Fig. 12b)．通常，

Prevotella

^{属の増加と}

NASH

患者への病態進行との間に正の相関が観察されており，これら多糖類の投与による

(35)

26 Prevotella

属の減少は，病態進行の抑制につながっているものと考えられる⁶⁷⁾．また

Prevotella

属の増加は，炎症性サイトカインとの関連性もリウマチ患者にて指摘されており，病態は異なるものの，肝臓での抗炎症効果に

Prevotella

属の減少も寄与しているかもしれない^,68)．一方，

Blautia

属の変動は，BMI等の肥満指数との関連が指摘されており，やせ型のヒト程，その存在が多いことが言われている ⁶⁹⁾．今回

NASH

モデルラットにおいて，

Blautia

属の増加と肝臓/総重量の相対比の間に負の相関を示したことから，

Blautia

属の増加が

NASH

進行抑制に関与している可能性が示唆された

(Fig. 12c, r = 0.83， p <0.05)．また興味深いことにサクラン投与群のみ，

Fusobacterium

属菌数の増加が観察された．これまでに

Fusobacterium

属の変動に関する報告

は少ないものの，最近，肝炎から肝がんに移行した患者において

Fusobacterium

属の顕著な減少が報告されている⁷⁰⁾．今回，サクラン投与のみ

Fusobacterium

属の顕著な増加を示したことは，

今後，

NASH

から癌への移行を防ぐ新たな治療法へとつながるかもしれない．また肝組織の観察において，染色の結果，全体的に風船化はみられていたものの，脂肪沈着，炎症細胞の浸潤，線維化は未治療群に顕著に観察された．そして，SDACNFs 投与群に比べ，サクラン投与群は脂肪の沈着や組織の繊維化が見られず，肝保護作用を示していることが示唆された(Fig. 13)．これはサクランの多面的効果，特に

Fusobacterium

属の顕著な増加により

NASH

進行が抑制されたためかもしれない．

本研究においてサクランが

SDACNFs

と同等の抗酸化作用，脂質抑制などの効果を示した．さらに，サクラン投与群のみ肝がん関連菌が属するとされる

Fusobacterium

属菌数の増加が観察された．これはビタミン類や

N -アセチルシステインなど，従来から抗酸化作用が知られている物質

とは異なる機序であり，NASHを含む

NAFLD

の予防・治療薬と併用可能な新しい治療薬・予防薬としてサクランが貢献する可能性が示唆された．

(36)

27

第８節小括

本章では，サクランの医薬分野への応用を目的として，モデルラットを用いて

NASH

抑制効果について検討した．以下に得られた知見を小括する．

１) サクランの経口投与は，未投与群に比べ，体重及び肝重量体重比の増加を有意に抑制した．

２) サクランの経口投与は，未投与群に比べ，各種血液パラメータ，抗酸化能，肝組織の炎症パラメータ，繊維化パラメータを有意に改善した．

３) サクランの経口投与は，未投与群に比べ，がん予防に寄与する

Fusobacterium

属菌数を増加させた．

４) サクランの経口投与は，

NASH

進行に対し，

SDACNFs

と同様に抑制効果を示すものの，その抑制効果の機序として，

SDACNFs

に比べて多くの腸内細菌叢に影響を及ぼすことにより

NASH

進行を抑制している可能性が示唆された．

以上の結果より，サクランはプレバイオティクスとしての作用，酸化ストレス抑制等，多面的な効果により

NASH

の進行を抑えることが明らかとなった．

スイゼンジノリ由来高分子多糖 サクランの医薬分野への応用

崇城大学学位論文

スイゼンジノリ由来高分子多糖 サクランの医薬分野への応用

令和２年度

後藤 美和

崇城大学学位論文

スイゼンジノリ由来高分子多糖 サクランの医薬分野への応用

March 2021 後藤 美和

Application of sacran, a sulfated polysaccharide, to the medical and pharmaceutical fields

Miwa Goto

Application of sacran, a sulfated polysaccharide, to the medical and pharmaceutical fields

Miwa Goto

Sacran, a polysaccharide that is extracted from the Japanese indigenous cyanobacterium Aphanothece sacrum, has an extremely high molecular weight (Mw: 1.6 × 10

Therefore, the potential for the application of sacran to the medical and pharmaceutical fields including an oral form was investigated.

1) Renoprotective and antioxidant activity of sacran in chronic kidney disease (CKD) model rats

in a concentration dependent manner, compared with the non-treatment group.

These effects are similar to those observed for an AST-120 treatment. At the

genus level, only sacran administration caused a significant increase in the

useful genus of Lactobacillus, compared with a similar treatment with the

non-treatment group. It was concluded that sacran administration has the

potential to reduce the absorption of indole into the blood and to improve several gut microbiotas, in the gastrointestinal tract, thereby inhibiting the subsequent development of oxidative stress and renal markers in the systematic circulation on CKD.

2) Sacran suppresses the absorption of lipids and modulates the intestinal flora in non-alcoholic steatohepatitis (NASH) model rats

The objective of this study was to investigate the effects of administering

sacran on liver biology, gut microbiota, oxidative stress, and inflammation,

compared with that for surface-deacetylated chitin nanofiber (SDACNFs) or

a non-treatment group on stroke-prone spontaneously hypertensive

(SHRSP5/Dmcr) rats that develop fibrotic steatohepatitis with histological

similarities to that of NASH. As a result, sacran administration was observed

to decrease the extent of oxidative stress and hepatic biochemical parameters

in the plasma and hepatic injury with the levels of TGF-β

and TNF-α, being

increased, compared with the non-treatment group. This effect was found to

be similar to that for treatment with SDACNFs. At the genus level, the

administration of sacran and SDACNFs caused a significant decrease in the

harmful Prevotella genus, and a significant increase in the useful Blautia

genus, compared with the non-treatment group. It is noteworthy that this

effect of sacran is higher than that of SDACNFs. It was concluded that sacran

administration has the potential to reduce the absorption of lipids into the

blood and to improve several gut microbiotas, in the gastrointestinal tract,

thereby inhibiting the subsequent development of oxidative stress and

hepatic markers in the systematic circulation on NASH.

3) Preparation and evaluation of sacran/ SDACNFs pellets for use as an extended-release excipient

In conclusion, sacran or their interpolymer complex could be used for several

clinical applications because of their safety and multifunction.

AD Atopic dermatitis

ALT Alanine aminotransferase

AST Aspartate aminotransferase

BG Blood glucose

BUN Blood urea nitrogen

CKD Chronic kidney disease

CRE Creatinine

CVD Cardiovascular diseases

CyD Cyclodextrin

ESKD End-stage kidney disease

HFC High-fat and -cholesterol

HP-β-CyD 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin

IP Inorganic phosphorus

IS Indoxyl sulfate

NASH Nonalcoholic steatohepatitis

NAFL Nonalcoholic fatty liver

NAFLD Nonalcoholic fatty liver disease

PAO Potential antioxidant

ROS Reactive oxygen species

SDACNFs Surface-deacetylated chitin nanofibers

TC Total cholesterol

TG Triglyceride

THC Tetrahydrocurcumin

1) Sacran, a high-molecular weight polysaccharide inhibits renal injury and oxidative stress in chronic renal failure model rats, J. Nutri. Bio., 4, 267-275 (2018).

M. Goto, D. Iohara, S. Kaneko, T. Higashi, K. Motoyama, T. Maruyama, K. Uekama, F.

Hirayama, M. Otagiri and M. Anraku.

2) Preparation and evaluation of freeze dried surface-deacetylated chitin nanofiber/sacran pellets for use as an extended-release excipient, Int. J. Biol. Macromol., 124, 888-894 (2019).

M. Goto, S. Ifuku, K. Azuma, H. Arima, S. Kaneko, D. Iohara, F. Hirayama and M. Anraku.

3) Effects of surface-deacetylated chitin nanofibers on non-alcoholic steatohepatitis model rats and their gut microbiota, Int. J. Biol. Macromol ., 164, 659-666 (2020).

M. Goto, D. Iohara, A. Michihara, S. Ifuku, K. Azuma, D. Kadowaki, T. Maruyama, M.

Otagiri, F. Hirayama and M. Anraku.

4) Sacran, a sulfated polysaccharide, suppresses the absorption of lipids and modulates the intestinal flora in non-alcoholic steatohepatitis model rats, Life Sci ., 268, 118991 (2021).

M. Goto, K. Azuma, H. Arima, S. Kaneko, T. Higashi, K. Motoyama, A. Michihara, T.

Shimizu, D. Kadowaki, T. Maruyama, M. Otagiri, D. Iohara, F. Hirayama and M. Anraku.

In vitro

1

スイゼンジノリ由来高分子多糖サクランの医薬分野への応用

スイゼンジノリ由来高分子多糖サクランの医薬分野への応用

後藤美和

スイゼンジノリ由来高分子多糖サクランの医薬分野への応用

March 2021 後藤美和