氏 名 ・（本籍） 山本 竜平（神奈川県）
専 攻 分 野 の 名 称 博士(医学)
学 位 記 番 号 医博甲第 1036 号 学 位 授 与 の 日 付 令和 3 年 3 月 22 日
学 位 授 与 の 要 件 学位規則第 4 条第 1 項該当 研 究 科 ・ 専 攻 医学系研究科医学専攻 学 位 論 文 題 名
論 文 審 査 委 員 （主査） 山本 雄造 教授
論 文 審 査 委 員 （副査） 海老原 敬 教授 髙橋 直人 教授
Treg expansion with trichostatin A ameliorates kidney ischemia/reperfusion injury in mice by suppressing the expression of costimulatory molecules
（マウス腎虚血／再灌流障害モデルにおける制御性
T
細胞の腎保護効果の 検討）Akita University
学
位 論 文 内 容 要 旨
論 文 題 目
Treg expansion with trichostatin A ameliorates kidney ischemia/reperfusion injury in mice by suppressing the expression of costimulatory molecules
マ ウ ス 腎 虚 血 ／ 再 灌 流 障 害 モ デ ル に お け る 制 御 性
T
細 胞 の 腎 保 護 効 果 の 検 討 申 請 者 氏 名 山 本 竜 平研
究 目 的
虚 血 ／ 再 灌 流 障 害 （Ischemia / Reperfusion Injury, IRI） に よ る 臓 器 障 害 は 、 活 性 酸 素 や フ リ ー ラ ジ カ ル 産 生 に よ る 直 接 的 機 序 に 加 え 、 血 管 内 皮 細 胞 障 害 、 微 少 循 環 障 害 に 伴 う 炎 症 細 胞 浸 潤 に よ る 過 剰 免 疫 応 答 が 関 連 し て い る(Hercule A et al, J Pharmacol Exp Ther 2002) 。 制 御 性 T 細 胞 （Regulatory T cell, Treg） は 過 剰 な 免 疫 応 答 を 制 御 す る 機 能 を 有 す る こ と か ら 、Treg を 増 幅 す る こ と は 臓 器 IRI の 治 療 と し て 有 用 な 可 能 性 が 示 唆 さ れ て お り
（Lai LW et al, Kidney Int 2012）、 薬 剤 で 特 定 の 経 路 を 抑 制 す る 手 法 よ り も 理 に か な っ て い る 。
一 方 、IRI臓 器 の 血 管 内 皮 細 胞 上 で は CD80、CD86、ICAM-1な ど の 免 疫 関 連 抗 原 分 子 の 発 現 強 度 が 亢 進 し 、 炎 症 細 胞 浸 潤 、 ひ い て は 臓 器 機 能 の 低 下 を も た ら す 事 が 報 告 さ れ て い る
（Kojima N et al, Hepatology 2001, Satoh S et al, Lab Invest 2002, Saito M et al, Arch Histol Cytol 2005）。Tregは CTLA-4と 競 合 的 に CD80・86に 結 合 し 、 免 疫 応 答 の 促 進 を 防 ぐ こ と か ら 、我 々 は Tregの 臓 器 IRI に 対 す る 保 護 効 果 は 免 疫 関 連 抗 原 分 子 の 発 現 亢 進 を 抑 制 す る こ と と 関 連 し て い る と 仮 説 を 立 て た 。
本 研 究 で は 、自 己 の Tregを 内 因 性 に 増 幅 す る こ と で 腎 IRIに 対 し て 腎 保 護 効 果 を 発 揮 で き る か 、 ま た 免 疫 関 連 抗 原 分 子 の 発 現 と の 関 連 性 を 検 証 す る こ と を 目 的 と し た 。
研
究 方 法
1）C57BL/6 マ ウ ス（10-12 週 齢 ）の 左 腎 動 静 脈 を 血 管 鉗 子 で 遮 断 し 、30分 経 過 し た 後 に 遮 断 を 解 除 す る と 同 時 に 右 腎 を 摘 出 す る マ ウ ス 腎 IRIモ デ ル を 作 成 し た 。
2） ヒ ス ト ン 脱 ア セ チ ル 酵 素 阻 害 薬 で あ る Trichostatin A（TsA） を 投 与 し 、 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い て 脾 臓 で の Treg 分 画 （CD4(+)Foxp3(+)） の 割 合 が 増 加 、 す な わ ち Tregが 増 幅 さ れ る （Liesz A et al, J Neurosci 2013） こ と を 確 認 し 、 ま た 、PC61（ 抗 CD25抗 体 ） を 投 与 し Treg が 減 少 す る こ と を 確 認 し た 。
3）Treg が 増 幅 し て い る 治 療 群 （TsA 群 ）、 コ ン ト ロ ー ル 群 （DMSO 群 ）、TsA＋PC61 群 、DMSO
＋PC61群 の 4 群 に 分 け 、そ れ ぞ れ に IRIを 起 こ し 、ク レ ア チ ニ ン 、抗 炎 症 性・炎 症 性 サ イ ト カ イ ン （IL-10, TGF-β, IL-6 な ど ） の 血 中 濃 度 を 経 時 的 に ELISA で 測 定 し 比 較 し た 。 ま た IRI 後 の 左 腎 を 摘 出 し て PAS 染 色 を 行 い 、 病 理 学 的 に 組 織 障 害 の 評 価 を 行 っ た 。 さ ら に IRI 後 の 左 腎・脾 臓 に お け る 抗 炎 症 性・炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の mRNA 発 現 レ ベ ル を 半 定 量 し 比 較 し た 。
4）4 群 間 で IRI 腎 で の 免 疫 関 連 抗 原 分 子 （CD80, CD86, ICAM-1） の 発 現 を mRNA レ ベ ル ・ 蛋 白 レ ベ ル （ ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト ） で 比 較 し た 。
5）4 群 間 で IRI 腎 で の 炎 症 細 胞 浸 潤 を 評 価 す る 目 的 で CD45 免 疫 染 色 を 行 い 、 単 位 面 積 当 た り の 陽 性 細 胞 数 を 測 定 し て 比 較 し た 。
研
究 成 績
IRI 後 早 期 の 腎 機 能 障 害 は 、DMSO 群 と 比 較 し て 、TsA 群 で 血 清 学 的 （ ク レ ア チ ニ ン 濃 度 ） に も 組 織 学 的 （ATN score） に も 有 意 に 軽 減 さ れ て い た 。
腎 IRI後 の 血 清 サ イ ト カ イ ン 濃 度 の 検 討 で は 、 抗 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る IL-10の 血 中 濃 度 は DMSO群 と 比 較 し て TsA群 で 有 意 に 上 昇 し 、 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る IL-6の 血 中 濃 度 は DMSO群 と 比 較 し て TsA 群 で 有 意 に 低 下 し て い た 。 ま た 、 腎 ・ 脾 臓 で の mRNA発 現 レ ベ ル の 検 討 で は 、DMSO 群 と 比 較 し て TsA群 で IL-10、TGF-B の mRNA発 現 が 有 意 に 亢 進 し 、炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る IL-6 の mRNA発 現 が 有 意 に 低 下 し て い た 。
免 疫 関 連 抗 原 分 子 で あ る CD80、CD86、ICAM-1 の mRNA・ 蛋 白 発 現 レ ベ ル の 検 討 で は 、DMSO 群 と 比 較 し て TsA群 で い ず れ も そ の mRNA 発 現 レ ベ ル は 低 下 し 、ま た 蛋 白 発 現 レ ベ ル に お い て も TsA 群 でCD86、ICAM-1 の 発 現 は 低 下 し て い た 。
さ ら に IRI 後 2 日 目 の 腎 で の CD45 免 疫 染 色 で 炎 症 細 胞 数 の 評 価 で は 、DMSO 群 と 比 較 し て TsA群 で は 炎 症 細 胞 浸 潤 が 有 意 に 減 少 し て い た 。
こ れ ら の TsA 投 与 に よ る 効 果 は PC61 投 与 に よ り 相 殺 さ れ た こ と か ら 、TsA 投 与 に よ る IRI 後 の 腎 保 護 作 用 は Treg依 存 性 で あ る と 考 え ら れ た 。
結
論
TsA投 与 に よ る 内 因 性 の Tregの 増 幅 は 、抗 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 増 加 と 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 減 少 に 関 与 し 、 腎 IRI後 の 免 疫 関 連 抗 原 分 子 の 発 現 亢 進 を 抑 制 す る こ と で 、 炎 症 細 胞 浸 潤 を 軽 減 し 、IRI後 早 期 の 腎 保 護 効 果 を 発 揮 で き る 可 能 性 が あ る 。
