人 白 血 病 の ウ イ ル ス 学 的 研 究
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(2) 500. 宇. に よ るRNA rse. dependent. DNA. transcriptase)の. polymerase. (Rive. 発 見 に よ り,に. 血 病 の 成 因 と し てC型RNAウ. 野. イル スの関 与 が見 直 さ. 教 室 で は こ の よ う な 実 験 日 血 病 の 研 究 成 績 よ り, イ ル ス 関 与 の 立 場 か ら人 白 血 病 の ウ イ ル. ス 学 的 解 明 を 試 み る べ く実 験 を 行 っ て 来 た. 従 来,人. 子顕. 微 鏡 に よ る ウ イ ル ス 粒 子 の 証 明,組 織 培 養 法 の 応 用, transcriptaseの. 証 明,そ. が 用 い られ て い る が,私. 郎. 羊 血 清3ml. osphate. buffered. 7.2を3ml加. の他 種 々の 方 法. は 教 室 に お け るRauscher. (Total. え,さ. ら に6mlの. rpm. 15分 遠 沈 し上 清 を 捨 て る.こ. 室 温 に 放 置 し, 0℃. 画 が 除 去 さ れ る.次 溶 解 し, 3mlの. 4時. 清 を 捨 て る.こ. し,透. 析 用cellulose. PBSに. る.彼. 等 はRauscher白. と 略)に. に か け てFi. Bates15),ら. 対 す る 抗 体 やC型. 2.. ウ イル ス様 粒 子 を含 ん だ. か る 一 連 の 研 究 は,人. の. FITCの. 蛋 白 濃 度Ag/dl,蛋 /100=Cmg.色 ま り1ml中. 私 は,極 め て 純 度 の 高 い 抗RLV血 の 抗RLV血. ずRauscher白. phaseと. 数 日 間 の 肝,脾. くに ウ イ. いわれるウイルス接 種後. にお け る ウ イ ル ス抗 原 の 現 れ方 を分. 析 す る こ と に よ っ て,用 ら に,. い た抗 血 清 の 特 異 性 を確 め. Rauscherウ. イル ス と人 白血 病 細 胞. 蛋 白 が 含 ま れ る状 態 で行 うの が. し た が っ て こ の 場 合,. 特 異 反 応 の 除 去 な ど 厳 重 なcheckを. 行 うこと. に よ り 再 検 討 し,興 味 あ る 知 見 を 得 た の で 報 告 す る.. =0.8mlと Gを. magnetic. て,蛍. Cancer. InstituteのDr.. り供 与 さ れ た 抗RLV山 の 抗 血 清 のIgG分. Fluoresceine. isothiocyanate. Ra. 羊 血 清(IS‑7) 画 を 分 離 し,こ (FITC)を. 光 抗 体 法 直 接 法 で 行 っ た.方. 法 は,川. のLot.. 抗RLV山. 使 用 し た.. FITCを. 拌 を 続 け な が ら4時. 識 終 了 後,す. G‑25を. に. 攪 拌 し な が ら加 え る. FITC結. に 保 ち,攪. FITC標. G. 生 理 食 塩水. の 溶 解 液 をB+G液. 9041265を. を 除 去 す る た め にSephadex. 間標. み や か に未 結 合色 素 gel. filtrationを. 行 う.. 直 径1.5cmのcolumnに8cmの. 高. れ に. 村の方. ら か じ め ゲ ル 内 は0.005mol,. PBS+0.1mol き,試. 結 合 させ. 法16)に 従 っ た. 1.. 溶 解 し,こ. stirrerで. 識 し た.. C. 実 験 材 料 及 び実 験方 法. 抗 血 清 はNational. を 用 い た.こ. B=1.9ml,. F=3.04/10=0.304ml,. 加 えFにEを. さ に つ め,あ. uscherよ. 理 食塩. な る.計 算 が 終 る と 蛋 白 液Bに. Sephadex Ⅱ. な る. 0.5mol,. D=60.8/20=3.04ml,. E=60.8/100=0.608mg,. 加 え た 液 は6℃. 識,非. は,総 蛋 白 量. A=3.2%,. =1 .9×3.2/100=60.8mg,. を,抗Rauscherウ. 標. 加 えた. え るFITC量. 水 量D‑(B+F)=Gml.. 晶 はBBL製. FITCの. bufferやsalineを. 酸 重 炭 酸 緩 衡 液 量D/10=Fml,生. との 間 に 果 して この よ うな 交 又 反 応 がお こ るか 否 か イ ル ス 血 清 の 精 製,. の蛋. 蛋 白 量B×A. し た た め, C/100=Emgと. 9.5炭. 清 を 用 い た 蛍 光 抗 体 法 に よ り,ま 血 病 マ ウ ス の 初 期 病 変,と. ル ス のeclipse. た 後,さ. 清 を入 手 したの. BaCl2を. tube中. 白 液 量Bml,総. に20mgの. の1/100と PH. の 関 与 の 可 能 性 も除 外 で き な い.. 0.5mol. 入 れ,. 素 の 標 識 は 最 終 蛋 白 濃 度 が2%,つ. 最 終 量 はC/20=Dml.加. 特異反応. 溶解. 20/32)に. 標識 と蛍 光 抗 体 の 精 製. の と して,極. め て 重 要 な 意 義 を もつ もの で あ る が,. (size. 析 が 終 了 す れ ばcellulose. 最 も効 果 的 で あ る た め,. で,こ. 除 か れ, IgG分. 白 濁 が生 じな い こと を確. 白血 病 細 胞 内 に お け る ウ イ ル スの 存 在 を証 明 した も. こ れ らの 報 告 を 詳 細 に 検 討 し た と こ ろ,非. くり. 数 式 は 次 の ご と く で あ る.. 白血 病. 細 胞 中 に こ れ らの 抗 体 と 特 異 的 に 反 応 す る 抗 原 の あ る こ と を 報 告 し て い る.か. 和後. 15分 遠 沈. 白 液 量 及 び 蛋 白 濃 度 を 日 立 屈 折 蛋 白 計 で 測 定 し た.. 下RLV. 白 血 病 患 者 血 漿 に 対 す る 抗 血 清 を 用 い て,人. 9000rpm,. 透 析 し,. 加 え て もBaSO4の. 認 す る.透. の報告があ. 血 病 ウ イ ル ス(以. ず. 和 の 操 作 を3回. tube. 硫 安 を 除 く た め にPBSで. の 分 野 に お け る研. か ら1969年. 0℃,. 返 し,こ れ に よ りpseudoglobulinが. の 問 題 を 解 明 し よ う と試 み た.こ で に1964年. に て9000. れ に よ っ て,ま. に こ の 沈 渣 を6mlの. の33%飽. よ る 人 白 血 病 の ウ イ ル ス 抗 原 分 析 と い う立 場 で,こ. nk9)‑11),Yohn12)13), Ioannides14),. PH. 飽 和 硫 安 を 加 え, 33%飽. 間 室 温 に 放 置 し て,. し,上. 0.01mol,. 飽 和 硫 安 を 加 え て50. 和 後, overnightで. Albumin分. 7.2g/dl)にph. (PBS). 画 と な る.こ の 沈 渣 を で き る だ け 少 量 のPBSに. 白 血 病 ウ イ ル ス に 関 す る 研 究 成 績 か ら蛍 光 抗 体 法 に. 究 と し て は,す. protein. solution. %飽. PBSで. 白 血 病 の ウ イ ル ス 学 的 研 究 に は,電. Riverse. 一. 抗RLV山. わ か に人 白. れ て 来 た.. C型RNAウ. 潤. NaClのelute. 画の分離. 飽 和 して お. 料 が ゲ ル 層 に 移 行 し た ら同 じ緩 衡 液 で 流 出 を. 行 う と,流. 出 の 早 い標 識 蛋 白 バ ン ドと流 出 の遅 い末. 結 合 色 素 バ ン ドに 分 か れ る の で,流. 出の早いバン ド. の み 集 め る. 次 に,こ. 羊 血 清 か らのIgG分. bufferで. PH 7.2. ethyl. (DEAE). のFITC標 cellulose. 識 蛋 白 液 をDiethylamino column. chromatography.
(3) 人 白血 病 の ウ イ ル ス学 的 研 究. に よ り精 製 す る. DEAE columnに6cmの. celluloseを. 高 さ に つ め,. bufferで. 置換. 料 が 全 部celluloseに. 移. し て お い た も の を 用 い,試 行 し た 後,同. じelute. bufferで. 流 出 させ る.特. 特 異 蛍 光 の 強 い 過 陰 性 荷 電 の も の は, 吸 着 さ れ,. F/Pモ. た 資 料 に よ る と 表3,. 直 径1.5cmの. elute. を2. ご と く で あ る.こ. fold. dilutionに. 肝,脾. のstaining. ル 比 を測 定 し. 4.. 蛍 光 抗 体 の 吸収 操 作. (1). mouse. 蛍 光抗 体 の性 状 の検 討 ル比 の計 算. ル 比 が1‑2の. 分 画 を 選 ぶ 必 要 が あ る.そ. た め,光 電 光 度 計 に よ り280mμ, tical. density. (OD)を. か ら標 準 吸 収 曲 線 に よ り,ま 算,次. のOD495の. プ ル のOD280の OD280の. 読 み と す る.こ. れ をpoolし. 温 で1時. 計. の 上 清 を50mgのtubeに. 操 作 を く り返 し,そ. てF/P2.1と. し て 使 用 し た.. (2). one. 表1. 抗Rauscher白. Solution. of. 1/100. FITC. to. final. Gel Column Collect. liver. powderに. the. acetone. powderに. for. filtration. of. 4 hours through. the protein. at. 6•Ž. on of. with. Sephadex. chromatogaphy fraction. of. 1/10. fluorescent. DEAE. FITC標. 識 抗RLV山. よ る吸 収 liver. acet. 法 は(1)と 同. liver. acetone. coatに. powderで. よ る 吸 収.. 吸 収 して もな お. 正 常 人 末 梢 血 白 血 球 に 非 特 異 蛍 光 が み ら れ た た め,. り送 附 され. amount in. 混 入 を さ 通 して使 用 し. よ る 吸 収 を 行 っ た が,方. 羊 血 清 のFITC標. protein. by. volume is. weight. of. the. adjusted. gentle. is 2%. 識方法. to. dissolved. protein. 2%. by. the. G-25 cellulose antibody. (F/P. ratio. 羊 血 清 のF/Pモ. ル比測定結果. in. carbonate. solution. stirring. Storage. 表2. powderの filterを. 正 常 人 未 梢 血 白 血 球buffy. human. concentration. Incubate. human. (3). 血 病 ウ イ ル ス(RLV)山. buffer. 15分 低 温. 入 れ て 同様 の. Immunoglobulin. -bicarbonate The. 9000rpm. 様 の 操 作 を し た.. あ り,こ. NCIよ. 15分 遠 沈. 蛍 光抗 体 を入 れ. 人 白 血 病 細 胞 を 染 色 す る前 にhuman. F/P×1. 抗 体 価 の 測 定 と特 異 性 の 検 討. 本 抗 血 清 の 特 異 性 と抗 体 価 は,. の 上 清 は,. po 入 れ,. た.. 6本 に 分 注 し た 本 蛍 光 抗 ご と く0.9‑3.1で. 間 放 置 後,. 0.2μ のmilipore. tubeへ. 9000rpm. の 沈 渣 に1mlの. で 遠 沈 し,そ. 掛 けた もの が. ル 比 は 表2の. 清 を 捨 て,こ. け る た め,. acetone. 分 け てvinyl. て 攪 拌 し,室. の値をサ ン. め る モ ル 比 は,. ら計 算 で き る.. 体 のF/Pモ. (2). の 値 に0.75を. あ る.求. せ. よ る吸収. liver. よ く攪 拌 し30分 放 置 後,. し,上. 読 み か ら差 し 引 い た も の を 蛋 白 の. 蛋 白 の 値(P)で /2.43か. PBSで. の. お け るFITCの. 読 み を 別 の 標 準 吸 収 曲 線 か ら計 算 し,こ. 測 定 し,合. powderに. 読 み. ずFITC量(F)を. に こ の 値 に 相 当 す るOD280に. acetone. 吸 収 にmouse. widerを100mgと50mgに. 495mμ に お け るop. 測 定 し,そ. liver. 蛍 光 抗 体1mlの. 非 特 異 蛍 光 を さ け,末 標 識 抗 体 を 除 去 す る た め に, F/Pモ. titerを. て 特 異 性 を 検 討 し た.. 3.. 色 素 対 蛋 白 質(F/P)モ. 応す. の 希 釈 ま で 特 異 蛍 光 が み られ. た(表1).. (1). ま で 希 釈 し,対. 血 病 発 症 マ ウ ス の 末 梢 血,. を 染 色 し て,ど. る か に よ っ て,そ. こで は. 成 した 蛍 光 抗 体 の力 価. よ り64倍. る 抗 原 材 料 のRauscher白. に非. celluloseに. 採 取 し, F/Pモ. 4の. 蛍 光 抗 体 法 の 実 用 性 か ら,作. ル 比 の 低 い 順 に 流 出 し て く るの で,. 試 験 管 に 少 量 づ つ6本. 501. 1-2). addition. of. saline.
(4) 502. 宇. 野. 潤. 表3 抗RLV山 羊血清の特異性 Immunoelectroosmophoresis Test. *. Serum. **. b‑number. and. 表4. は,. heparin加. 30mlを. coatを. 0℃,. 郎. Results. undiluted. bands. observed. 羊 血 清 の抗 体 価. 50% hemolysis. endopoint,. 集 め て 吸 収 し た.方. 正 常 人 末 梢 血100mlに6%. 加 え よ く混 和 し,. 採 取 し, 1200rpm,. tested. discrete. 抗RLV山. *. 正 常 人 末 梢 血buffy. antigens of. 一. 法. 1時 間 放 置 し,そ. dextran. 10分 間 遠 沈 し,そ. の上清 を の沈渣. 5CH50. にPBSを. complement. 加 え, 1000rpm,. く り返 し た 後,. 9000rpm,. の 白 血 球 の 沈 渣 約0.3mlに. 0℃,. 10分 間 遠 沈 を3回. 0℃,. 15分 間 遠 沈 し,そ. 蛍 光 抗 体0.2mlを. 加 え る.. つ ま り量 的 に 白 血 球 量 が 多 い ぐ ら い で 吸 収 す る.こ.
(5) 人 白 血 病 の ウ イル ス学 的研 究 表5. FITC標. 識 抗RLV山 with. 羊血清の吸収法. 1.. Absorption. 2.. Absorption with normal human buffy coat Heparinized normal human peripheral Stand Collect Wash. human. for. liver. acetone. powder. buffy. coat. repeatedly. 3 times. Incubate for 1 hour at C .f. g. at 9.000rpm for Supernatant. れ を よ く攪 拌 し, rpm,. 0℃,. 1時. is used. 間 室 温 に 放 置 し,再. び9000. 15分 間 遠 沈 し,そ の 上 清 を 使 用 し た(表. 5).. 5.. 使 用 し た細 胞. with. saline. for. room. antibody. temperature. 15min. application. to human. leukemic. 白 血 病 発 症 マ ウ ス の 脾 の20% mlを 腹 腔 内 に 接 種 し,約1ヶ 病 の 発 症 し たBALB/cマ. cell free抽. 出液0.2. 月 後 にRauscher白. 血. ウス と,対 照 と して正 常. ウ スの 肝,脾 の 凍 結切 片 お よ び ス タン プ. 標 本 と末 梢血 塗 抹標 本 を室 温 で10分 間 ア セ トン固 定. 山羊 血 清 を標 本 に重 ね,漏 紙 で湿 潤 に した容 器 内 で 間反 応 させ た の ち, 15分 間 に3回PBSを. え て,振. と う器 で洗 い,風 乾 し,緩 衝 グ リセ リ ン液. ン を1:9に. を見 て行 く上 で, Rauscher白 ス 抗原 の臓 器 局 在,と. のcross. 血病 マウスのウイル. ス粒 子 の認 め られ な い 時期,い. わ ゆ るeclipse. ph. 9.5と 無 蛍 光 グ リセ リ. 入 らぬ よ うに封 入 す る.蛍 光 顕微 鏡 は 日本 光学 製 で, 東 芝 製SH‑200の. 超高 圧 水銀 ラ ン プでUV励. 用 した.写 真 撮 影 に はAnscochrome はKodak. high speed. Ⅲ 1.. 抗RLV山. FITC標 mouse. 起 を使. ASA200ま. ectachrome. 用 し,露 出時 間 は1‑5分. reaction. くに感 染 初 期 に電 顕 で ウ イ ル. ASA. 間 と した.. 成. 績. 羊血清 の抗 体 価 測 定 と特 異 性 の検 討. 識 抗RLV山. 羊 血 清 の 未 吸 収 の もの お よ び. liver acetone. powderに. よ り吸 収 した もの. を2 fold dilutionに よ り64倍 ま で 希 釈 し, Rausc. BALB/cマ. her白 血 病BALB/cマ. 間後,. 3日 後,. 5日 後,. 2W後,. 4W後. ウス お よ び正 常 マ ウ ス の肝,. の. 脾,末 梢 血 標 本 と反 応 させ た と こ ろ,未 吸 収 の もの. に分 け,そ の 肝 と脾 の0.3μ 凍 結. で は,対 照 の 正 常 マ ウス の 肝 で8倍 希 釈 ま で血 管 内. 切 片 お よ び ス タ ン プ標 本 を10分 間 室 温 で アセ トン固. 皮 や 輸 胆 管 に,脾 で も血 管 壁 に非 特 異 性 の 吸 着 が見. もの を3匹 づ つ7群. 7日 後,. 染24時. た. 160を 使. aseに お け る ウ イ ル ス抗 原 の分 析 を行 っ た.動 物 は ウス を 用 い,正 常 お よ びRLV感. 代. 混 じ,よ く混 和 した もの)に て気 泡 の. した もの を用 い た. また,人 白血 病細 胞 とRLVと. cell. 37℃1時. (0.5mol炭 酸 重 炭 酸 緩 衝 液PH. staining titer測 定 に 使用 した材 料 は, Rauscher. BALB/cマ. blood. 1 hour. About same amounts of labeled is added to this sediment. -. 503. 定 した もの を用 い た.. られ たが,吸 収 した もの で は,そ の 非 特 異 染 色 は見. 人 白血 病 細 胞 につ い て は,急 性 白血 病20例(骨 性14例,リ 3例,リ. ンパ 性6例),慢 ンパ 性3例),そ. (Hodgkin病4例,リ 例),多. 性 白血 病6例(骨. 髄 髄性. の 他 悪 性 リ ン パ 腫10例 ン パ 肉 腫4例,細. 網 肉 腫2. 発 性 骨 髄 腫2例 の 合 計38例 を対 象 と して 用. い た.対 照 と して 血 液 疾 患 以 外 の 悪 性 腫 瘍 患 者5例 (食 道 癌,胃 癌,肺 癌,子 宮 癌,乳 癌 各1例),潰 瘍 性 大 腸 炎2例,正. 常 人3例 の 合計10例 の 末 梢 血 ま. た は 骨髄 塗 抹 ア セ トン固 定標 本 を使 用 した. 6.. 蛍光抗体 法直接法. 蛍光 抗 体 の希 釈 に はmicro 倍 ま た は8倍 にPBSで. られ な くな り,ま た,特 異 蛍 光 も認 め られ な か った. 一 方 , Rauscher白 血 病 マ ウ スの 肝,脾,末 梢血 で は 強 い 輝 きの あ る緑 色 を呈 す る特 異 蛍 光 が,そ れ ぞ れ32倍 希 釈 まで み られ た.肝 で は多 数 の 浸 潤 増 殖 した 赤 芽 球 系 腫 瘍 細 胞 と思 え る細 胞 に特 異 蛍 光 が み られ,し か も集 塊 を形 成 した と こ ろが 多 くみ られ た (写 真1).脾. で も増 殖 浸 潤 し た細 網 細 胞 や赤 芽 球. と思 わ れ る細 胞 に特 異 蛍 光 を認 め た(写 真2).末 梢 血 にお い て も腫 瘍 性 赤 芽 球 と思 え る 多数 の 細胞 に 特 異 蛍 光 が 認 め られ た(写 真3)(表6).. syringeを. 希 釈 したFITC標. 用 い, 4 識 抗RLV. この よ うに 対 照 の 正 常 マ ウ ス で は特 異 蛍 光 は み ら れ ず, Rauscher白. 血 病 マ ウ ス に明 らか に特 異 蛍 光.
(6) 504. 宇. 表6. 蛍 光 抗 体 法 に よ るFITC標. +…Intensity M.. L.. P.. of. 潤. 識抗RLV血. 一. 郎. 清 の特 異 性 とStaining. titerの 測 定. reaction. P.…Mouse. liver. B.…Peripheral. が み られ る た め,使. 野. acetone. powder. blood. 用 し た 抗RLV山. て,脾 被膜 下の巨核 球 らしい 大 型 の 細 胞 と脾 の実 質 の. 羊 血 清 はRLV. に 特 異 的 な 抗 体 を 有 し,し か も,そ のstaining は32倍 希 釈 ま で 特 異 蛍 光 の み られ るhigh. titer. titerの. も. 極 く少 数 の細 胞 に特 異 蛍光 が 認 め られ るが(写 真6) 5日 以 降 で もそ の細 胞 の数 は あ ま り増 加 しなか った.. の で あ る こ と が 判 明 し た.. 2.. RLV感. 染 マ ゥス の肝,脾. に お け るRLV抗. 原. 表7. RLV感 染 マ ウス に お け る ウイ ル ス抗 原 の 蛍 光 抗 体 法 に よ る経 時 的 検 索. の現れ方 RLVをBALB/cマ. ウ ス の 腹 腔 内 に感 染 させ,感. 染後 経 時 的 に肝,脾 で のRLV抗. 原 を 追 求 した と こ. ろ,肝 に お い て は, 24時 間 後 は全 く陰 性 で あ った が, 3日 後 に は,そ の数 は わ ず か で あ る がす で に肝 実 質 内 に特 異蛍 光 を示 す 細胞 が み られ る よ うに な り(写 真4),す. で に一 部 で は集 塊 を形 成 して い る の もみ. られ た. 5日 後 に は,そ の特 異 蛍 光 陽 性 細 胞 数 は非 常 に増 加 し,集 塊 形成 も多 く認 め られ る よ うに な り, 1週 以 降 は,肝 組 織 はRauscher白. 血病の浸潤細胞. で 占 め られ る程 に な って い る(写 真5). 脾 にお いて は,凍 結 切 片 で は, 3日 後 に,は じめ. 表8. +…Intensity. of. specific. reaction. 一 方 ス タ ン プ標 本 で は. ,病 期 の進 展 と と もに特 異蛍. 光 陽 性 細 胞 は 増 加 し, 2週 か ら4週 目で は 多数 認 め られ た(写 真7)(表7).ウ. イ ル ス抗 原 の細 胞 内. 抗RLV山 羊血清 によ る人 白血病及 びその他 の疾患患者の骨髄 と末梢血 細 胞の蛍光抗体法 による検索成績.
(7) 人 白病 の ウ イ ル ス学 的 研 究. 505. 局 在 を示 す 特 異 蛍 光 は,細 胞 質 に 限 られ,核 に は み. 白血 病 マ ウ スの 脾 と交 又 反 応 を示 す ウ イル ス 抗 原 分. られ な が った.. 析 結 果 を 報 告 して い る17).これ らは い ず れ もRa. 3.. 人 白 血 病 細 胞 とRLV抗. 体 との交 又 反 応 の有. 血 病 の 進 展 期 また は 極 期 に お け る もの で. あ って,初 期 病 変,と. 無 の検 討 まずhuman 抗RLV山. liver acetone. powderで. 吸 収 した. 羊 血 清 で正 常 人 の 末 梢 血 塗 抹 標 本 と反 応. させ た と こ ろ,白 血 球 の 細 胞 質 や核 に非 特 異 染 色 が み られ た.そ こで,さ 血buffy. uscher白. coatで. らに この抗 血 清 を正 常 人 末 梢. 吸 収 した と ころ, 1回 の 吸収 の み. くにeclipse. phaseと. いわれ. る電 顕 的 に ウ イル ス 粒 子 の 認 め られ な い 時期 か らの ウ イル ス 抗 原 の追 求 は,わ ず か にRappとFriend23 )がFriendウ. イ ル ス で, Pinkelら24)がRLVお. Moloneyウ. イ ル ス をin. よび. vitroで 培 養 細 胞 に感 染 さ. せ て 追 求 して い るの が報 告 され て い る が, RLVのin. で この 非 特 異 染 色 は み られ な くな っ た.し か し,同. vivoの 実 験系 で は,ま だ報 告 を み な い.電 顕 に よ る. 時 にRLV特. 異 抗 体 も除 か れ て い る危 険 が あ るた め,. 観 察 で はRLV感. このbuffy. coatで 吸 収 した抗RLV血. め て 巨 核球 や 細胞 間 隙 にC型 粒 子 が 出 現 し,病 期 の. Rauscher白. 清 を用 い て,. 血 病 マ ウス の 肝 お よ び脾 と反 応 させ た. とこ ろ,明 らか な 特 異 蛍 光 が 認 め られ, RLV特 体 は除 か れ て い な い こ とが確 認 で きた.そ. 異抗. して 急 性. 骨 髄 性 白血 病14例,急. 性 リ ンパ性 白血 病6例,慢. 性. 骨 髄 性 白血 病3例,慢. 性 リ ンパ性 白血 病3例,悪. 性. リンパ 腫10例,多 患 患 者7例,正. 発 性 骨髄 腫2例,そ. 常 人3例. の他非血液疾. の 骨髄 ま た は末 梢 血 細 胞 と. の 交 又 反 応 を試 み た が,す べ ての 標 本 に特 異 蛍 光 は み られ な か った(表8).. 進 展 と と もに 白血 病 細 胞 中 に多 数 見 出 され る と いわ れ20),組 織 学 的 に は, Dunnら25)に. よれ ば,脾 で は感. 染1週 後,肝 で は2週 後 に は じめて 赤 芽 球 な どの 白 血 病 細 胞 が 出現 す る こ とが認 め られ て い る. 私 の 蛍光 抗 体 法 に よ るRLV抗. 原 分 析 結 果 で は,. 感 染3日 後 に は,す で に脾 被 膜 下 の 巨核 球 や 実 質 の ご く少 数 の細 胞 に ウ イル ス抗 原 陽 性 細 胞 が 出 現 し, 肝 に お い て も, 3日 後 に少 数 の 細 胞 に特 異 蛍 光 が み られ た.す な わ ち,電 顕 的 に ウ イ ル ス粒 子 が 認 め ら. Ⅳ マ ウス のGrossウ. 染 後 の マ ウス の脾 で は, 7日 後 に初. 考. れ ず,組 織 学 的 に も腫 瘍 細 胞 の み られ な い早 期 か ら. 按. イ ル ス 自 血 病 の 研 究 を は じめ. と して,動 物 の ウイ ル ス性 白血 病 の 研 究 は,人 白血. す で にRLV抗. 原 を もつ 細 胞 が 認 め られ る こ と が判. 明 した. RLV感. 染 マ ウ スや ラ ッ トの 巨核 球 に特 に強. い特 異 蛍光 の み られ る こ とはYoshida26), Fink8)に よ. 病 の 格好 な モ デ ル とい える.こ れ が果 して どこ まで. って 示 され,私 の成 績 と一 致 す る が,彼 等 が 検 索 し. 本 質 的 に 類似 す るか は 問題 で あ る が,人 白血 病 の 解. た の は,そ の 巨核 球 中 に ウ イル ス粒 子 の 見 出 され な. 明 に実 験 白血 病 の果 す役 割 は,は か りしれ な い もの. い 感 染初 期 で は な く, Rauscher白. が あ る.. ed stageの 巨核 球 で あ り,多 数 の ウ イ ル ス粒 子 が認. 私達 の教 室 で は,こ れ までRauscherウ. 血 病 のadvanc. イル ス性. め られ るた め に よ く染 ま る と述 べ て い る点 は私 の成. 白血病 に つ い て の研 究 が行 われ,そ の 発 生 機 序 な ど. 績 とは異 な っ て い る,マ ウ ス 自血 病 ウ イ ル ス感 染 後. 多 くの 詳 細 な成 績 が あ る17)‑22).本 研 究 で は,人 白血 病. の細 胞 へ の ウ イ ル ス抗 原 出現 時 間 は,感 染 に用 い た. 細 胞 に お け るRLV抗. ウ イ ル ス の濃 度 に比 例 して お り,ま た ウ イル ス の ち. 原 との 共 通 抗 原 の 有 無 を検 討. す る こ とを主 な 目的 と して,ま ずRauscher白 を人 白血 病 の1つ の モ デル と考 え, RLV接 ウス のtarget RLVのtarget. organと organは. 血病 種後の マ. が い に よ っ て も差 が あ る こ とが, RappとFriend や23)Pinkelら24)に よ るin. vltroの 実 験 で証 明 され. そ の抗 原 分 布 を追 って みた.. て お り,また そ の ウ イル スの もつleukemogenic. ac. 組 織 学 的 に は,主 と して 肝. tivityや 感 染 に用 い た 動 物 のsusceptibilityな. ど多. お よ び脾 で あ り,白 血 病 細 胞 で あ る赤 芽 球,細 網 細. くの要 因 が あ り簡 単 に は論 じ られ な い が,こ の よ う. 胞 やRauscher. にRLV感. cellの 増 殖 性 浸 潤 を伴 う肝 脾 腫 型. 病 像 を呈 す る腫 瘍 と考 え られ て い る17)21)22). 蛍 光 抗 体 法 に よ るRauscher白 ル ス抗 原 分 析 は,す で にFinkら いて,肝,脾. 血 病 マ ウスの ウ イ が抗RLV抗. も,潜 在 的 に は前 白血 病 状 態 とな っ て お り,ウ イ ル. 体 を用. ス増 殖 の場 とな り,後 に 白血 病 細 胞 へ と変 っ て い く. 異 抗原 の. 細 胞 で あ る こ とが示 唆 され る.い ず れ1として もマ ウ. 癌 お よ び 白 血病 マ. ス に お け る ウ イ ル ス抗 原 が,こ の よ うな形 で簡 単 に. な どの 白血 病 細 胞 中 にRLV特. あ る こ と を示 し8),入 野 らはAKR乳. 染 後 早 期 に ウ イル ス抗 原 がintegrateさ. れ た細 胞 は,形 態 的 に は悪 性 化 を示 す 細 胞 で な くて. ウス の臓 器 抽 出 液 に対 す る抗 体 を用 い てRauscher. と らえ られ 得 る とす れ ば,人 の 想定 され るviralag‑.
(8) 506. 宇. 野. 潤. 一. 郎. FITC量. entも 抗 原 的 に動 物 由 来 の ウ イル ス,こ こで はRLV. が 多 量 で あ り,そ. のF/P比. が 非 常 に高 い こ. と類似 性 を有 す るな ら,こ の よ うな方 法 で と ら え ら. と に ま ず 問 題 が あ る の で は な か ろ う か. Finkら8)は,. れ は しな いだ ろ うか.. 加 え るFITC量. 人 白 血 病 の 成 因 と考 え られ て い るウ イ ル ス に 関 す. が 蛋 白 量 の1/20,. 40と 多 量 で あ り,反. る研 究 に は,動 物 ウ イ ル ス研 究 の た め に 開 発 され た. Sephadex. 方 法,す. Yohnら13)はF/P比. な わ ち ウ イ ル ス粒 子 と して追 求 す るた め に. 電 子 顕 微 鏡 や 組 織 培 養 法,腫 瘍 免 疫学 的立 場 か ら蛍. gel. filtrationを. が3.86‑12.48で. イ ル ス 関連 物 質 と. してReverse. transcriptaseな. どを見 つ けて い く. び 骨 髄 細 胞 な ど で 複 雑 か つ,く. 方 法, BUDR,. X線 な どに よ るvirus. 蛍 光 抗 体 法 に よ る人 白血 病 細胞 中 の ウ イ ル ス 抗 原 にFinkら9)‑10)が. 体 と反 応 す るRLV抗. る こ と を示 し,さ. 人白血病. 原 類似 物 質 の あ. らにC型 ウイ ル ス様 粒 子 を 含 ん だ. 人 白血 病 の血 漿 に対 す る抗 体 が 多数 の人 白 血 病 細 胞 と特 異 的 に反 応 す る こ とを示 して,人 の 白 血 病 がC 型RNAウ. ら は,そ. の ラベ ル. 常 人 末 梢 血 白 血球 お よ り返 し て 吸 収 し て い. る が,や は り抗 体 蛋 白 の 過 陰 性 荷 電 に よ る 非 特 異 的 吸 着 に よ る反 応 は さけ られ な いの で は な い か と考 え ら. 利 用 す る方 法 が用 い られ て い る.. 細 胞 にRLV抗. 識後. 実 に平 均7.02の. もの を 使 用 し て い る の で あ る.彼. 光 抗 体 法 やimmunodiffusion,ウ. の 検 索 は, 1964‑1965年. 間 で,標. 行 っ て い る だ け で あ る.. 抗 体 を 臓 器 ア セ ト ン 粉 末,正. inductionを. Batesら15)は1/. 応 時 間 も12‑14時. イルスに よ って起 るだ ろ う とか な り大 胆 な. 推 論 を して い る. 1968年Yohnら13)もC型. ウ イル ス. れ る.私. の 使 用 し た 蛍 光 抗 体 は 加 え るFITC量. 白 量 の1/100,反 phadex. gel. 応 時 間 は6℃4時 filtration,. chromatographyに. DEAE. human は,正. liver. acetone. powderに. よ る吸 収 の み で. 常 人 末 梢 血 白 血 球 に 非 特 異 染 色 が み られ た.. こ れ は 免 疫 に 使 っ たRLVが. 人胎児 腎培 養 細胞 中で. 増 殖 させ た も の で あ る28)の で,当. い, Ioannidesら14)はRLV猿. envelopeの. 然,人. の細胞膜を. 構 成 成 分 と して い る可 能 性 の あ る ウ イ ル. 見 が得 られ た と報 告 して お り,1969年 に はBatesら 15)が, RLV猿 抗 体 とC型 ウ イ ル ス様 粒 子 の み られ る. ス で 免 疫 し て お り,そ. 人 白血 病 の血 漿 に対 す る抗 体 を 用 い て,こ れ まで の. 思 わ れ る.し. 報 告 の総 括 的 な実 験 に よ り,同 様 の 陽 性 所 見 の み ら. column. のF/P比2.1の. れ で も未 吸 収 の も の お よ び. 様 粒 子 の み られ る人 白 血病 の 血漿 に対 す る抗体 を用 抗 体 を用 い て 同様 の 所. 間 標 識 後 にSe cellulose. よ り 精 製 し,そ. もの を 得 て 使 用 し た.そ. は蛋. の た め抗 血 清 中 に正 常 の 細胞. に 対 す る 抗 体 が 含 ま れ て い る こ と に も関 係 が あ る と か し 正 常 人 末 梢 血buffy. coatに. よる. 1回 の 吸 収 だ け で 非 特 異 反 応 は 全 く消 失 し た. しか も,こ れ ま で の 陽 性 成 績 を 再 検 討 し て み る と,. れ る こ とを報 告 して い る. しか し,こ の よ うな 抗RLV血. 清 に よ る人 白血 病 細. 白 血 病 の 病 型 で は,急. 性 リ ン パ 性 白 血 病 で はFink9). 胞 の蛍 光 抗 体 法 に よ る陽性 所 見 は,私 の 非特 異 反 応. が80%,. Bates15)が100%,急. を除 去 す る厳 重 なcheckに. で はFink9),. よ る成 績 で はすべ て 陰 性. で あ っ た.. Ioannides14)が50%,. 非 特 異 反 応 除去 の最 大 のkey. pointはFITC標. 識. 2前 後 の 分 画 を得 る こ とで あ る. F/P比 が 高 けれ ば 蛋 白 分 子 に 多 く結 合 して い る こ と. 悪 期 の み100%,. Yohn13)ら. は 骨 髄 性 の み陽 性 で リン. た 病 期 に よ っ て も増 悪 期 と 寛 解 期 の 陽 性 率 の 差 が 報 告 者 に よ りま ち ま ち で あ り,そ の 他 白 血 病 以 外 にHo dgkin病. 的 吸 着 が お こ りや す くな るか らで あ って, FITC標. 陽 性 所 見 が み ら れ て い る が,. 識 条件 の 改 良 つ ま り加 え る色 素 量 は蛋 白 量 の1/100 ‑1/150で 足 りる し,標 識 時 間 も4℃‑6℃ で3‑. 類 白 血 病 反 応,血. ation,. DEAE. cellulose. column. gel filtr. chromatography. に よ る ラベ ル 抗 体 の 精 製 に よ り,ほ ぼ抗 体 側 に 由 来 す る非 特 異 反 応 は除 去 で きる と い わ れて い る27). F/P 比 は2前 後 が 最 良 で, 5に な る と非 特 異 的 反 応 が強 く. Bates15)が 増. パ 性 の 場 合 は す べ て 陰 性 で あ る と 報 告 して い る.ま. に な り,そ の た め蛋 白質 の 陰 性 荷 電 を高 め,非 特 異. 6時 間 で 充 分 で あ り,さ らにSephadex. 性 骨 髄性. Bates15)は100%,. 慢 性 リ ン パ 性 で はIoannides14)が80%,. 条 件 の 改 良 と ラ ベ ル抗 体 の精 製 に よ っ て, F/P比 が. 高 い程, FITCが. Ioannides14),. な ど の 悪 性 リ ン パ 腫,多. Finkら9)は. 転 移 癌,. 小 板 減 少 性 紫 斑 病 な ど で も陽 性 で. あ っ た と報 告 し て い る.特 て も,. 発 性 骨 髄 腫 な どに. Ioannides14)は. 異 蛍 光 の細 胞 内局 在 に し. 細 胞 質 や 核 に,. es15)は 大 部 分 が 細 胞 質 で,稀. Ioannides14), Bat. に 核 に み られ,. Yohn13). は 細 胞 質 の み で 核 に は 見 られ な い と い っ て い る. こ の よ う に,こ. れ ま で の 報 告 は 再 現 在 に 乏 し く,. 一 定 の結 果 が み られ ず. ,と. くに紫 斑 病 や 真 菌症 な ど. な り, 10以 上 に な る と問 題 に な らな い.従 来 の報 告. で 陽 性 所 見 が み ら れ る こ と に は 問 題 が あ る. Fink9),. で は,使 用 され た 蛍 光 抗 体 は,標 識 の た め に加 え る. Ioannides14)ら. は こ の 説 明 に や は りウ イ ル ス を 関 連 づ.
(9) 人 白血 病 の ウ イル ス学 的 研究. けて考 察 し, Bates15)は 検 索 した材 料 の ちが い とか 抗 血 清 の 吸収 の しか た の相 異 に よ るの で は な い か と 述 べて いる.し か し,本当 に 人 白血 病 細 胞 とRLVと. の. 間 に この よ うな 交 又 反 応 が あ る の で あ ろ うか.そ. し. て マ ウ ス 白血 病 ウ イル ス が人 白 血 病 のetiological agentと. り, RLV感. 原 的 に も共 通 な ウ イ. ル ス に よ っ て起 る だ ろ うと大 胆 な 仮 説 を述 べ て い る Yohn13), Batesら15)は. 蛍光 抗 体 を 正 常 骨 髄 細 胞. 行 う ことによ. 染 マ ウ スの 初 期 病 変 にお け る肝 お よ び脾. の ウ イ ル ス抗 原 の 現 れ 方 を追 求 し,さ らに本 抗 血 清 を 用 い て,人 白血 病 細 胞 とRLVと. の 間 に交 又 反 応 が. 起 るか否 か を検 討 した. RLV感. は マ ウ ス,人 な ど の 白 血 病 は 形. 態 的 に 似 た も の の み な らず,抗. が,. 非特 異 反 応 の 除去 な ど厳重 なcheckを. な っ て い る と 考 え て よ い の で あ ろ うか.. Fink9), Ioannides14)ら. 507. 染 マ ウ ス の肝 お よ び脾 に お いて,ウ イ ル ス. 抗 原 陽 性 細 胞 は 感染3日. 目 に初 め て認 め られ,そ の. 数 は経 時 的 に増 加 した. RLVのeclipse. phaseは. 約1週 間 とい わ れ て い るが,ウ イ ル ス抗 原 はす で に 3日 後 に現 わ れ,こ の よ うに感 染 後 早 期 に ウ イ ル ス. で く り返 し 吸 収 す る こ と に よ っ て 陰 性 と な る た め に,. 抗 原 のintegrateさ. こ の 反 応 は ウ イ ル ス 特 異 的 な もの で は な く,骨. とな り,潜 在 的 に前 白血 病 状 態 とな って お り,後 に. 胞 特 異 的 な も の で,と. 髄細. くに未 熟 な 骨 髄 細 胞 が成 熟 す. 白血 病 細 胞 へ と変 っ て ゆ くこ とが示 唆 され る.. る と きに 出 て くる あ る種 の 抗 原 で は な か ろ うか とい っ て,ウ. イ ル ス の 関 連 に つ い て は 言 及 し て い な い.. ま た 人 白 血 病 患 者 血 漿 中 にみ ら れ たC型 様 粒 子 が,果 ろ うか.彼. あ り,彼. ら も,ウ. agmentか. ま りに も不 鮮 明 で. イ ル ス の 形 に み え るcellular. も し れ な い し,た と えvirionで. 動 物 に 抗 体 を 作 る 程 のimmunogenと だ ろ う と い っ て い る.現. 在,す. が 見 出 さ れ て も,病. 性 白血 病6例(骨. 髄 性3例,リ. 性 リンパ腫10例(Hodgkin病4例. リン パ肉 腫4例,細. 網 肉 腫2例),多. ,. 発 性 骨 髄 腫2. 例,そ の 他10例 の 骨 髄 お よ び末 梢 血細 胞 の す べ て に. ,. 以 上 の成 績 か ら直 ち に人 白血 病 に お け る ウ イ ル ス 関与 の有 無 につ い て結 論 的 な こ と をい え る もの では. ま りprovirus. 因 と 関 係 の な いpassenger. な い が,想 定 され る人 白 血 病 の ウ イル ス 抗原 は. ,少 な くと も,か か る形 で と ら え られ 得 る もの で は な い よ うに思 わ れ,さ. と え ウ イル ス 様粒 子. らにgroup. specific. 分析 な ど別 の角 度 か らのapproachが. antigenの. 必 要 と思 われ. る.. vi. 可 能 性 を除 外 で きない とい わ れ て い る.. 私 の 人 白 血 病 細 胞 中 にRLV抗. 原 を見 つ け よ うと. す る 試 み は す べ て 陰 性 で あ っ た が,と もあ れ ,こ の 成 績 だ け で人 白血 病 の 成 因 と して ウイ ル ス の関 与 が な い と結 論 で き る もの で は な い .未 が,こ. リンパ性6例),慢 ンパ性3例),悪. 髄 性14例,. は な り得 な い. 形 で 存 在 して い る た め に発 見 が む. ず か し い と 考 え ら れ て お り,た. 体 との 交 又 反 応 は み られ. 特 異 蛍 光 は み られ な か っ た.. あ って も. の ウイ ル ス は粒. 子 と し て は 検 出 証 明 が 困 難 な 様 式,つ と してgenomeの. fr. べての人の腫瘍に ウ. イ ル ス が 関 与 し て い る と し て も,そ. rusの. ウ イル ス. ウ ス 白血 病 ウ イ. ル ス で み ら れ る も の と異 な り,あ. 人 白 血 病 細 胞 とRLV抗. な か った.す な わ ち,急性 白血 病20例(骨. して 想 定 さ れ る 人 白 血 病 ウ イ ル ス で あ らが 示 す そ の 粒 子 は,マ. れ た細 胞 は,ウ イ ル ス増 殖 の 場. 知 人 癌 ウ イル ス. の よ う な 形 で 容 易 に と ら え られ 得 る もの で は. な く,別 の 方 法,例 かRiverse proachが. え ばgroup. transcriptaseの. specific. antigenと. 結. 助 と御 指 導 を い た だ い た入 野 昭 三 講 師 に深 謝 い た し ま す.さ. らに蛍 光 抗 体 法 の 御 指 導 を仰 い だ 東 大 医 科. 学 研 究 所 川 村 明義 教 授,白 血 病 お よ び悪 性 リンパ腫. よ う な 角 度 か らのap. 患 者 の材 料 の一 部 を提 供 して い た だ い た国 立 が ん セ. 必 要 と思 わ れ る. Ⅴ. 稿 を終 る に あ た り御 指導 と御校 閲 を賜 った恩 師 平 木 潔 教 授 に 深 甚 の謝 意 を表 します .ま た 多大 の御 援. ン タ ー副 院 長 木 村 禧 代 二 博 士 に感 謝 致 し ます. . (本論 文 の 要 旨 は 昭和47年 第34回 日本 血 液学 会 総. 語. 会 お よ び昭和47年 第31回 癌 学 会総 会 に お い て発 表 し 抗RLV山. 羊 血 清 を 精 製 し,. FITCを. 標 識 し た後. ,. た.).
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(14) 512. 宇. 写 真5. Rauscher白. ウ ス の2週. 野. 宇. 野. 潤. 潤. 一. 郎. 血 病 ウ イ ル ス感 染 マ. 間 後 の 肝 に お け る 多数 の特 異. 螢光. 写 真7. 郎. 論. 文. 写 真6. 附. 図. Rauscher白. ウ ス の 脾 で3日 られ た特 異 螢光. Rauscher白. ウ ス の2週. 血 病 ウ イ ル ス感 染 マ. 間 後 の 脾 に お け る 多数 の 特 異. 血 病 ウ イ ル ス感 染 マ. 後 に,は. じめ て 巨 核 球 に み.
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