近 畿 大 農総 研 報5121〜130(1997)
Bull. Inst. Compr. Agr. Sci. Kinki Univ. 5 : 121-130 (1997)
オオムギ子葉鞘細胞 における遺伝子発現解析 のための基礎的研究
松 田 克 礼 紳,豊 田 秀 吉*,田 中 徳 夫***,大 内 成 志 棚*
A microinjection system for the analysis of gene expression in single barley coleoptile cell.
Yoshinori MATSUDA, Hideyoshi TOYODA,
Norio TANAKA and Seiji OUCH!
Synopsis
Among glass pipettes prepared with a needle-drawing apparatus, those with tip diameter of 2.5 -3 .0 gm were found suitable for sucking up cytoplasmic contents of barley coleoptile cells. The volume of sucked up cytoplasmic contents was proportional to the number of microsucked cells and the volume of cytoplasmic content of single cell was estimated to be approximately 2.8 x 10-2 nl from the regression line. The effect of microsuction of cytoplasm from targetted cell on the survival rate of adjacent cells was determined by cytoplasmic streaming and stainability with fluorescein diacetate. Neighboring cells of microsucked cell showed normal cytoplasmic stream- ing and fluoresced as those located far from the microsucked cell, suggesting that microsuction could be used for sucking up cellular contents from a specific cell without causing major damage to adjacent cells. To prove that the extracted cytoplasm contains RNA, the extracts were hybridized with EcoRI digested-pGR221 which contains 18s rRNA sequence of barley coleoptile cells. Positive hybridization signal was observed indicating that the extracts contained at least rRNA of the cells. Total RNAs were then extracted from control and powdery mildew-inoculat- ed barley leaves and mRNA was isolated by using oligo(dT) latex particles. The mRNAs were transcribed to cDNA for differentiating mRNA specific to infected cells. One of clones which were expressed in both the control and infected leaves, pCDNA 10, was used for Northern hybridization with the extracted cytoplasmic contents. Since a positive signal was observed, its sequence was determined. These results suggested that genes expressed in a particular cell could be specified by the procedure developed in this study. However, in view of scanty amounts of mRNA in cells, it is necessary to amplify them by some measures such as in vitro or in situ PCR.
As an approach to in situ PCR, a procedure for pricking introduction of FITC-labeled bovine albumine was established.
1緒 言
栽培 植 物 にお け る遺 伝子 操作 の 目的 は,生 産性 を
高 め,資 源 を よ り効 率 的 に 利 用 し,害 虫,疾 病,不 利 な 環 境 に 対 し て よ り強 い 抵 抗 性 を 示 す よ う な 新 し
8農 学部農学科
(Department 榊 農学総合研究所 (Institute 牌事 森産業株式会社研究所
of Agronomy, Faculty of Agriculture, Kinki for Comprehensive
(Mushroom
牌榊 農学部農学科・農学総合研究所
Nara 631,Japan
Institute,
Agricultural Sciences, Mori Industory Co.
University, Nara Kink
Ltd.,
i University, Kiryu, Gunma
631, Japan Nara 376,
631 Japan
, Japan
(Department of Agronomy, Faculty of Agriculture and Institute for Comprehensive Agricultural Sciences, Kinki University,
122
近 畿 大学 農学 総合研 究 所報 告 第5号(1997)
い 遺 伝 子 型 を も つ 栽 培 植 物 を 作 り 出 す こ と で あ る1°)。植 物 病 理 学 分 野 に お い て も遺 伝 子 操 作 技 術 が 導 入 さ れ,ウ イ ル ス や 細 菌 な ど の 病 原 体 を 中 心 に 病 原 性 に 関 与 す る 遺 伝 子 の 発 現 機 構 の 解 析 が 進 め られ て き た'6}。近 年,宿 主 ・病 原 菌 相 互 作 用 に 関 す る研 究 に遺 伝 子 工 学 技 術 が 応 用 さ れ,分 子 レベ ル に お け る 病 態 生 理 学 的 解 析 が 試 み ら れ る よ うに な り,そ れ ら 基 礎 的 知 見 は病 害 抵 抗 性 植 物 作 出 に 基 礎 的 指 針 を 与 え る もの と期 待 さ れ て い る 。 し か しな が ら,病 原 菌 の感 染 に 対 す る 植 物 の抵 抗 反 応 に つ い て は,フ ァイ トア レ キ シ ン な ど物 質 レベ ル の解 析 は あ る もの の, 遺 伝 子 レベ ル で の研 究 は限 ら れ て い る。し た が っ て, 感 染 過 程 に 発 現 す る 遺 伝 子 を ク ロー ニ ン グ し,そ の 遺 伝 子 の 制 御 系 に つ い て 情 報 を蓄 積 す る こ とが 抵 抗 反 応 の分 子 機 序 解 明 に 寄 与 す る と と も に,病 害 抵 抗 性 植 物 作 出 に 貢 献 す る もの と考 え られ る 。 この よ う な命 題 の 解 決 に は,ま ず,関 連 す る 各 種 の 遺 伝 子 あ る い は遺 伝 子 群 が,い つ ど の よ う な 部 位 で 発 現 さ れ る か を解 析 す る こ とが 前 提 と な る。 従 来,遺 伝 子 発 現 解 析 の 方 法 と し て 抵 抗 性 誘 導 物 質 等 に よ り転 写 活 性 を高 め,目 的 と す る遺 伝 子 が 最 も活 発 に発 現 して い る時 期 に 感 染 組 織 か らmRNAを 分 離 し,こ れ を 鋳 型 と し てcDNAの 合 成 を行 い,特 定 遺 伝 子 の 単 離 と 転 写 レ ベ ル で の 制 御 の 解 析 が 行 わ れ て き た1・4・12・15)。しか し な が ら,こ の よ う な 方 法 は組 織 全 体 の遺 伝 子 発 現 を 検 討 す る も の で あ っ て,植 物 ・病 原 菌 相 互 反 応 を個 々 の 細 胞 レ ベ ル で 解 析 す る場 合 に は 必 ず し も効 果 的 な手 法 で あ る と は い え な い 。 そ こで 本 研 究 で は,特 定 細 胞 で 発 現 して い る遺 伝 子 の 単 離 とそ の 発 現 解 析 を 目 的 と し て,新 しい 解 析 方 法 を 確 立 す る こ と に し た 。 筆 者 ら の 研 究 室 で は,す で に マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン(MI)法 に よ る トマ トカ ル ス細 胞 や オ オ ム ギ の 子 葉 鞘 内 表 皮 細 胞 へ の 外 来 遺 伝 子 の 導 入 とそ れ ら の 発 現 解 析 に つ い て 報 告 し て き た14・14.2°)。MI法は,細 胞 内 注 入 を行 う の が 一 般 で あ る が ガ ラ ス 針 内 を 陰 圧 にす れ ば,標 的 とす る 細 胞 の 内容 物 を取 り出 す こ と も可 能 で あ る 。 そ こ で,こ の 特 性 を利 用 し た 細 胞 質 吸 引 法 に つ い て 基 礎 的 研 究 を 行 う こ と と し た 。 す な わ ち,本 研 究 で は,オ オ ム ギ 子 葉 鞘 とMI法 を組 合 せ て,1)MI法 に よ る 細 胞 内 容 物 吸 引 法 と細 胞 内 注 入 法 の 関発,2)吸 引 細 胞 内 容 物 中 の 核 酸 の 検 出,3)細 胞 内 に お け るPCRに
よ る遺 伝 子 増 殖 条 件 に つ い て 検 討 した の で,そ れ ら の 結 果 に つ い て 報 告 す る。
II材 料 と 方 法 1.実 験 材 料
1)供 試 植 物
オ オ ム ギ(HordeumvulgareL.)の 品 種 コ ビ ン カ タ ギ を使 用 し た 。 オ オ ム ギ は,20℃6,000〜illル ク ス の全 日 長 照 明 下 で7〜10日 間 生 長 さ せ,第 一 葉 が 展 開 し た オ オ ム ギ幼 苗 か ら子 葉 鞘 を 滅 菌 カ ミ ソ リ で 切 除 し,子 葉 鞘 内 表 皮 を剥 離 し た。 剥 離 後 の 子 葉 鞘 は 乾 燥 を 防 ぐ た め に2%寒 天 プ レ ー ト上 に 置 床
し,以 下 の 実 験 に使 用 し た19)。
2.実 験 方 法
1)マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン(MI)装 置 に よ る細 胞 質 の 吸 引
a)細 胞 内容 物 吸 引 用 ガ ラ ス 針 の 作 製
細 胞 内 容 物 の 吸 引 摘 出 に用 い る ガ ラ ス 針 を作 製 す る に あ た っ て,ガ ラ ス 針 内 表 面 へ の核 酸 の 吸 着 を極 力 少 な くす る た め,ガ ラ ス 管(NARISHIGE芯 入 硝 子 管GD‑1)の 内 表 面 に シ リ コ ン コ ー テ ィ ン グ を施 し た 。 シ リ コ ン コ ー テ ィ ン グ は 以 下 の 方 法 で 行 っ た23)。す な わ ち,5%(v/v)ジ メ チ ル ジ ク ロ ロ シ ラ ン の ク ロ ロ ホ ル ム 溶 液 に ガ ラ ス 針 作 製 用 ガ ラ ス 管 を 5〜10分 間 浸 漬 し,オ ー トク レ ー プ も し くは乾 熱 処 理 に よ っ て,ガ ラ ス 面 に シ リ コ ン を付 着 さ せ た 。 ガ ラ ス 針 の 作 製 に は,オ リ ンパ ス ・ニ ー ドル ド ロ ー イ ン グ 装 置(MODEL・IMP)を 用 い た。 ガ ラ ス 針 先 端 の 形 状 お よ び 口 径 は加 熱 式 ガ ラ ス 針 作 製 装 置 に加 え る電 圧 お よ び 電 流 に よ っ て 調 節 し た。 装 置 に加 え る 電 流 と電 圧 は電 圧 変 換 器 で 制 御 し,一 定 電 圧 下 で 形 状 の 均 質 な ガ ラ ス 針 を作 製 した14)。
b)イ ン ジ ェ ク シ ョ ン プ レ ー トの 作 製
イ ン ジ ェ ク シ ョ ン プ レ ー トは 既 報2Dの 方 法 に 従 っ て 作 製 した 。 す な わ ち,ス ラ イ ドグ ラ ス 上 に2%
寒 天 溶 液 を 滴 下 し,そ の上 に カ バ ー グ ラ ス を重 ね て, 寒 天 プ レ ー トを 作 製 し た 。 寒 天 が 固 化 した 後 カ バ ー グ ラ ス を除 去 し,オ オ ム ギ 子 葉 鞘 内 表 皮 を 置 床 し た 。 ま た,寒 天 周 縁 部 に は寒 天 の 乾 燥 を 防 止 す る た め 濾 紙 枠 を 置 き,常 時 滅 菌 水 を補 給 し た。
c)MIに よ る細 胞 質 吸 引 法
前 項 で 作 製 し た シ リコ ン コー トガ ラ ス針 を 用 い, オ リ ン パ ス 社 製 の マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク トス コ ー プ IMF‑YF14)を 使 用 し て 細 胞 内 容 物 を 吸 引 し た 。 ま ず,吸 引 用 ガ ラ ス 針 内 に はDTT溶 液(0.01M酢 酸 ナ ト リ ウ ム に1mMジ チ オ トレ イ トー ル を溶 解)を 一 定 量 満 た し,細 胞 内 吸 引 に 用 い た 。DTT溶 液 は, SSC溶 液(300mMNaC130mMク エ ン 酸3ナ ト リ
ウ ム2水 和 物pH7.0)に あ らか じ め ミ リポ ア フ ィ ル
松 田 ・豊 田 オオ ムギ子 葉鞘 細胞 にお け る遺伝 子発 現 の解 析
123タ ー(日 本 ミ リ ポ ア 工 業,MLILLEX‑GV,0.22μm
Filternuit)で 無 菌 濾 過 し たDTTを 加 え て 調 製 し た 。 細 胞 質 吸 引 の標 的 細 胞 に は,子 葉 鞘 中 央 部 の 活 発 な 原 形 質 流 動 の認 め られ る表 皮 細 胞 を 選 ん だ 。MI 操 作 と し て は,ま ず ガ ラ ス 針 の 先 端 を細 胞 表 面 に 移 動 し,細 胞 表 面 か ら約5μm下 降 さ せ て 細 胞 内 に ガ ラ ス 針 を挿 入 し た 。 一 定 時 間(10〜15秒)細 胞 内 に ガ ラ ス 針 を保 持 し た 状 態 で,圧 力 ゲ ー ジ に連 結 し た 減 圧 装 置 に よ っ て ガ ラ ス 針 内 を 陰 圧 に して 細 胞 内 容 物 を 吸 引 し た 。
2)ド ッ トプ ロ ッ ト ノ ー ザ ン ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン
子 葉 鞘 内 表 皮 細 胞 内 容 物 を吸 引 後,針 を抜 き と り ガ ラ ス 針 内 を加 圧 して,細 胞 内容 物 を吸 引 針 先 端 か らニ トロ セ ル ロ ー ス 膜 上 に 移 し,風 乾 さ せ た 。 乾 燥 し た ニ トロ セ ル ロ ー ス 膜 の 両 面 を3MM濾 紙 で 挟 み,80℃ で2時 間 加 温 し た の ち,細 胞 内 容 物 中 の RNAを 検 出 す る た め,ノ ー ザ ン ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン を行 っ た 。 プ ロ ー ブ に は う どん こ病 菌 の18S‑
rDNAI4)を 用 い た 。す な わ ち,pGR221に 組 込 ま れ た 18s‑rDNA配 列(EGR‑2)をEcoRIで 切 り出 し,既 報18)の 方 法 に 従 っ てhorseradishperoxidase
(HRP)で 標 識 した 。非 特 異 的 吸 着 を 防 ぐた め プ レ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を行 っ た 。 す な わ ち,吸 引 し た 細 胞 内 容 物 中 のRNAと プ ロ ー ブDNAを ハ イ ブ リ ダ イ ズ させ る た め,上 記 の ニ トロ セ ル ロ ー ス 膜 を シ ー ル パ ッ ク に移 し,1cm2あ た り0.25mlの ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン緩 衝 液(Amersham社)を 入 れ て42℃ で15分 間 振 と う し た 。 次 に,標 識 プ ロ ー ブ DNAを 入 れ,さ らに42℃ で10時 間 振 と う し た 。そ の 後,ニ トロ セ ル ロ ー ス膜 を 新 し い シ ー ル パ ッ ク に 移 し,ニ トロ セ ル ロ ー ス 膜1cm2あ た り2mlの 割 合 で 一 次 洗 浄 緩 衝 液(6M尿 素,0.4%SDS,75mM
NaCl,7.5mMク エ ン酸3ナ ト リ ウ ム2水 和 物)を 入 れ,42℃ で20分 間 振 と う し た 。 同様 の 操 作 を繰 り 返 し た 後,同 じ割 合 の 二 次 洗 浄 緩 衝 液(0.3MNaCl, 30mMク エ ン 酸3ナ トリ ウ ム2水 和 物)を 入 れ,5 分 間 室 温 で 振 と う し た 。この よ う な操 作 を繰 り返 し, 最 終 的 に1cm2あ た り0.125mlの 検 出 緩 衝 液1
(Amersham社)と 等 量 の検 出 緩 衝 液2(Amersham 社)の 混 合 液 に 浸 漬 して1分 間 反 応 させ た 。 ハ イ ブ
リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 有 無 は,標 識 に 用 い た パ ー オ キ シ ダ ー ゼ の 作 用 で 生 ず る ル ミ ノ ー ル 発 光 をX線 フ ィル ム で 感 光 させ て 検 出 し た18)。
3)オ オ ム ギ本 葉 の 全RNAの 抽 出
オ オ ム ギ 本 葉 の全RNAを,Chomczynskiら の 方
法 に従 っ て抽 出 し た3)。す な わ ち,オ オ ム ギ 本 葉(10 g)を 採 集 し,液 体 窒 素 中 で 凍 結 ・粉 砕 し た 。 得 られ
た摩 砕 葉 を5Qmlの 抽 出溶 液(4M塩 酸 グ ア ニ ジ ン, 25mMク エ ン酸3ナ ト リ ウ ム2水 和 物,0.1M2一 メ ル カ プ トエ タ ノ ー ル,0.5%ラ ウ ロ イ ル サ ル コ シ ン 酸 ナ ト リウ ム,pH7.5)と 混 合 し,氷 冷 下 で さ ら に摩 砕 し た 。次 に5mlの2M酢 酸 ナ トリ ウ ム(pH4.0)
と50mlの 水 飽 和 フ ェ ノ ー ル を 加 え,撹 押 後10ml の ク ロ ロ ホ ル ム/イ ソ ア ミル ア ル コ ー ル(24:1)を 加 え て,氷 中 に15分 間 静 置 した 。 そ の 後,遠 心 分 離
(10,000×g,20分,4℃)し,上 清 に等 量 の イ ソプ ロ パ ノー ル を 混 ぜ,‑20℃ で1時 間 静 置 し た 。RNA分 画 を遠 心 分 離(10,000×g,20分,4℃)で 回 収 し, 二 炭 酸 ジエ チ ル 処 理 滅 菌 水 に 懸 濁 し た 。 再 度 フ ェ ノ ー ル/ク ロ ロ ホ ル ム 処 理 し た後 ,遠 心分 離 し上清 の残 留 フ ェ ノ ー ル を ク ロ ロ ホ ル ム 処 理 で と り除 き,遠 心 分 離 上 清 を粗RNA画 分 と した 。 得 られ たRNAの 濃 度 は260nmの 吸 光 値 か ら も と め,滅 菌 水 で1rng/
mlに 調 製 し,最 終 濃 度 が2Mに な る よ う に10M塩 化 リチ ウ ム を加 え た 。4℃ で12時 間 静 置 した 後,遠 心 沈 渣 を 滅 菌 水 に懸 濁 し,精 製RNAと し て 以 後 の 実 験 に使 用 し た。
4)mRNAの 精 製
前 項 の 方 法 で 抽 出 し た 全RNAか ら,oligo(dT)‑
Latex粒 子9)を 用 い てmRNAを 精 製 し た 。 す な わ ち,全RNAに 抽 出 緩 衝 液(20mMTris‑HCI,pH
7.5,2mMEDTA・2Na,0.2%SDS)を 加 え,oligo
‑dT30(日 本 合 成 ゴ ム 株 式 会 社,日 本 ロ シ ュ 株 式 会 社)と 混 合 し て,65℃,5分 間 熱 処 理 し た 後,氷 中 で 急 冷 し た。 次 に,1/10量 の5MNaCIを 混 合 し, 37℃10分 間 保 温 し てmRNAをoiigo(dT)Latex粒
子 と結 合 さ せ た後,遠 心 分 離(26,000×g,15分,室 温)に よ っ てmRNA‑oligolatex複 合 体 を 得 た 。 こ れ を 洗 浄 緩 衝 液(10mMTris‑HClpH7.5
1mMEDTA・2NaO.1%SDSO.1MNaC1)で2回 遠 心 洗 浄(26,000×g,15分,室 温)し た 。 最 終 的 に得 ら れ た 沈 渣 を滅 菌 水 に 懸 濁 して,65℃5分 間 の加 熱 処 理 を行 いmRNAを 解 離 させ,遠 心 分 離 に よ っ て oligolatexと 分 離 させ た の ち,mRNAを 含 む 上 清 に 5MNaClを 加 え,冷 エ タ ノー ル よ り沈 澱 濃 縮 し,滅 菌 水 に溶 解 し てmRNA画 分 と し た。
5)cDNAの 合 成
mRNAか ら のcDNAの 合 成 はGublerとHoff・
manら の 方 法 に 従 っ た6)。す な わ ち,前 項 で 精 製 し た mRNAに オ リ ゴ デ オ キ シ チ ミ ジ ン プ ラ イ マ ー を 対 合 させ,AMVの 逆 転 写 酵 素(Amersham社)を 用
124
近畿 大学 農学 総合 研 究所 報告 第5号(1997)
い て フ ァ ー ス トス トラ ン ドcDNAを 合 成 し た 。 次 に,大 腸 菌 リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼHを 用 い てRNA鎖 を 切 断 し,大 腸 菌DNAポ リメ ラ ー ゼ1を 用 い た ニ ッ ク トラ ン ス レ ー シ ョ ン反 応 に よ っ て セ カ ン トス トラ ン ドcDNAを 合 成 し た 。 得 ら れ た2本 鎖cDNAに T4DNAポ リメ ラ ー ゼ を作 用 さ せ,両 端 を 平 滑 化 し た 後,プ ラ ス ミ ドベ ク タ ーpUC119のSmalサ イ ト に 挿 入 して,大 腸 菌JM‑149株 に感 染 増 殖 さ せ た 。
6)RNAの 電 気 泳 動 と ノ ー ザ ンハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン
葉 よ り抽 出 し た 全RNAよ り精 製 し たmRNAお よ び 分 子 量 マ ー カ ー と し て 用 い る 大 腸 菌23SrRNA (2.9Kb)と16SrRNA(1.6Kb)を 各 々1μgに 調 製 し,最 終 濃 度0.66Mの ホ ル ム ア ミ ドを加 え た ア ガ ロ ー ス ゲ ル に よ る電 気 泳 動 を 行 っ た エ3)。泳 動 後 ,キ ャ ピ ラ リー トラ ン ス フ ァ ー に よ りナ イ ロ ン膜 フ ィル タ ー (Amersham社)上 に 移 し,紫 外 線 照 射 に よ りRNA を ナ イ ロ ン膜 フ ィル タ ー 上 に結 合 させ た 。 ノ ー ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に 用 い る プ ロ ー ブ と し て は,前 項 で 得 ら れ たcDNAク ロ ー ン う ち 約400bp の 断 片 を も つpCDNA10を 選 び,HRPで 標 識 し た も の を 用 い た5)。ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン は,前 項 の ノ ー ザ ン ド ッ トハ イ ブ リ ダ イ ゼ イ シ ョ ン と同 様 に 行 っ た 。
7)制 限 酵 素 地 図 の 作 製
ク ロ ー ニ ン グ し たcDNAの 塩 基 配 列 を 決 定 す る た め,ま ず そ の制 限 酵 素 地 図 を作 製 し た。cDNAを
8種 の 制 限 酵 素(Sphl,Pst1,Sall,Hincll,Xbal,
BamHIKpnl,Sacl)で そ れ ぞ れ 切 断 し,サ イ ズ マ ー カ ー と共 に ア ガ ロ ー ス電 気 泳 動 を行 っ た 。 得 ら れ た 各 断 片 の 長 さ と,ベ ク タ ー 上 の切 断 点 に 基 づ き 限 酵 素 地 図 を作 製 した 。
8)M13ベ ク タ ー へ の サ ブ ク ロ ー ニ ン グ
pCDNA10に ク ロ ー ニ ン グ し たcDNAの 塩 基 配 列 をdideoxy法17)で 決 定 す る た め,ま ずcDNA断 片 をM13mp18お よ びMl3mp19RFDNAに 連 結 し た 。 す な わ ち,pCDNA10を 制 限 酵 素EcoRIとHin‑
dlll,HincllとBamHIま た はSallとBamHIで 2重 切 断 し,挿 入 断 片 を 切 り出 し,M13mp18あ る い はM13mp19RF‑DNAに 連 結 し て,Mande1と Higa11)の 塩 化 カ ル シ ウ ム 法 で コ ン ピ ー テ ン ト状 態 に した 大 腸 菌JMIO9株 を形 質 転 換 し た 。 これ に 一 晩 培 養 し たJM109(指 示 菌)と100mMIPTG(lso‑
propyl一 β一D‑thio‑galacto‑pyranoside)を 混 合 し, X‑Galプ レ ー ト(20μg/μ1のX‑Galを 含 有)上 に重 層 し,37℃ で 一 晩 培 養 し て,培 地 上 に プ ラ ー ク を形
成 さ せ 検 定 し た 。 す な わ ち,形 成 され た プ レー トの う ち 白 色 プ ラ ー ク を パ ス ツ ー ル ピ ペ ッ トで く り ぬ き,指 示 菌 を くわ え た2×YT液 体 倍 地 に植 菌 した 。 37℃6時 間 振 と う 培 養 を 行 っ た 後,遠 心 分 離
(20,000×g,4℃,5分)上 清 の1本 鎖M13フ ァ ー ジ 粒 子 を滅 菌 チ ュ ー ブ に移 し4℃ で 保 存 し た 。な お, 沈 渣 の 菌 体 内 に はM13フ ァ ー一ジ の2本 鎖DNAが RF(replicativeform)‑DNAの 状 態 で 存 在 す る の
で こ れ を抽 出 し た 。す な わ ち,沈 渣 をGTC溶 液 に 溶 解 し,GTC溶 液 の2倍 容 の2%SDS溶 液 を 加 え て 懸 濁 し,氷 中 に30分 静 置 し た 後,GTC溶 液 の1.5倍 容 の3M酢 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 を加 え,さ ら に,氷 中 に 30分 静 置 し た。 つ ぎ に,遠 心 分 離(20,000×g,4℃,
15分)で,菌 体 残 渣 と上 清 に分 け,上 清 を滅 菌 チ ュ ー ブ に移 して フ ェ ノ ー ル/ク ロ ロ ホ ル ム 処 理 を 行 っ た 。 再 度,遠 心 分 離(20,000×g,4℃,15分)し,
水 層 を 新 し い滅 菌 チ ュ ー ブ に移 し,等 量 の イ ソ プ ロ パ ノ ー ル と混 合 し た 後,室 温 で15分 静 置 し た 。室 温, 20,000×gで15分 間 遠 心 分 離 し,RF‑DNAの 沈 渣 を 得 た 。 こ れ を70%エ タ ノ ー ル で 洗 浄 し,真 空 デ シ ケ ー タ ー で 乾 燥 し た 後 ,30,cclの 滅 菌水 に懸濁 しRF‑
DNA溶 液 と し た 。こ のRF‑DNAを 制 限 酵 素EcoR IとHindIIIで 切 断 し,ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に
よ っ て,目 的 と す るDNAが ベ ク タ ー に組 み 込 まれ て い る こ と を確 認 し た 。DNAの 組 み 込 み が 確 認 で き た ク ロ ー ン に つ い て は,上 述 の4℃ に 保 存 した 上 清 よ りM13フ ァ ー ジ1本 鎖DNAの 単 離 を行 っ た 。
まず,遠 心 分 離(20,000×g,4℃,5分 間)に よ り 大 腸 菌 菌 体 を 除 去 し,上 清 を新 し い チ ュー ブ に移 し て20%PEG6000‑2.5MNaC1と 混 合 し,氷 中 に30分 間 静 置 し た 。 こ れ を遠 心 分 離(20,000×g,4℃,15 分)し,沈 渣 のM13フ ァー ジ1本 鎖DNAを 得 た 。
こ の 沈 渣 をTE緩 衝 液 に 懸 濁 し,TE飽 和 フ ェ ノ ー ル で 除 タ ンパ ク処 理 した 後,水 飽 和 工 一 テ ル で フ ェ ノー ル を 除 去 し た 。こ の 溶 液 に,1/10容 の3M酢 酸 ナ ト リ ウ ム と2.5倍 容 の100%エ タ ノ ー ル を 加 え,‑
80℃ に30分 間 静 置 し た 。 そ の 後,15分 間 の遠 心 分 離 に よ り 精 製DNAを 得 た 。 沈 渣 は27μ1の10mM Trisに 懸 濁 し,こ の う ち,1μ1を ア ガ ロー ス 電 気 泳 動 に使 用 し た。
9)cDNAの 塩 基 配 列 決 定
塩 基 配 列 の決 定 は,dideoxy法17)に よ り行 っ た 。 す な わ ち,前 項 で精 製 し た 鋳 型DNAを4本 の チ ュ ー ブ に 分 割 し,ア デ ニ ン(A>,チ ミ ン(T),グ ア ノ シ ン
⑥,シ トシ ン(C)に対 応 す る 蛍 光 色 素 標 識 し た プ ラ イ マ ー と対 合 させ た後,Sequenaseと,4種 の デ オ キ
松 田 ・豊 田 オオ ムギ子 葉鞘細 胞 にお け る遺伝 子 発現 の解 析
125シ ヌ ク レ オ チ ド(dNTP),1種 類 の ジ デ オ キ シ ヌ ク レ オ チ ド(ddNTP)を 加 え プ ラ イ マ ー を伸 長 させ た 。 各 鋳 型DNAの4種 の 反 応 生 成 物 を 各 サ ン プ ル ご と に1つ に ま と め,ポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 を行 っ た 。 デ ー タ の 解 析 は,ア プ ラ イ ドバ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 のDNASEQUENCERMODEL370A
を 用 い て 行 っ た 。
10)Polymerasechainreaction(PCR)用 プ ラ イ マ ー の 検 索 と合 成
得 ら れ た塩 基 配 列 デ ー タ ー よ り プ ラ イ マ ー の デ ザ イ ン を行 っ た 。 プ ラ イ マ ー は,β 一シ ア ノ エ チ ル ポ ス ホ ア ミダ イ ド法 に よ り ア プ ラ イ ドバ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製DNASYNTESIZER391PCR‑MATEを 用 い て 合 成 し た 。 合 成 し た プ ラ イ マ ー を 用 い てPCRに よ る 特 定 部 位 の 増 幅 を行 っ た 。PCRの 温 度 制 御 に は ア トー 社 製 の ザ イ モ リ ア ク タ ー(形 式':II)を 使 用 し,DNA鎖 の 変 性 に は94℃ で1分 間,プ ラ イ マ ー と鋳 型DNAの 対 合 に は30℃ で1分 間,お よ び DNA鎖 の 伸 長 反 応 に は72℃ で2分 間 の 反 応 条 件 を 設 定 し,こ れ ら を1サ イ ク ル と して,35サ イ クル の 反 復 反 応 に よ っ てDNAを 増 幅 し た 。
III結 果 お よ び 考 察
本 研 究 で は,特 定 標 的 細 胞 で の遺 伝 子 発 現 を 解 析 す る た め,単 一 細 胞 内 吸 引 法 と単 一 細 胞 内 注 入 法 を 確 立 す る こ と に し た。 す な わ ち,単 一 細 胞 内 吸 引 法 で は,マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン 装 置 を利 用 して, 子 葉 鞘 の 生 細 胞 か ら細 胞 質 を 吸 引 摘 出 し,細 胞 質 に 含 ま れ るmRNAを 試 験 管 内 でcDNAに 変 換 し た の ち,そ れ をPCR法 に よ っ て 増 幅 し,特 定 遺 伝 子 の 発 現 解 析 に 適 用 す る。 ま た,細 胞 内 注 入 法 は,ま ず, 細 胞 を固 定 し,特 定 の 標 的 細 胞 に プ リ ッ キ ン グ 処 理 を施 し て,プ リ ッ キ ン グ 細 胞 内 でPCR反 応 を 行 わ せ て 単 一 細 胞 内 の遺 伝 子 発 現 を 解 析 す る こ と を 目的 と す る 。 い ず れ の シ ス テ ム に お い て も,増 幅 し た cDNAは ベ ク タ ー に サ ブ ク ロー ニ ン グ し,各 々 の 単 一 細 胞 に 由 来 す る ラ イ ブ ラ リー を作 製 し た後
,健 全 葉cDNAと 罹 病 葉cDNAを 対 比 さ せ,感 染 特 異 的 cDNAを 選 抜 す る もの で あ る 。 今 回 の 実 験 で は,特
に 細 胞 内 吸 引 法 に つ い て,そ の 適 用 に必 要 な 基 礎 的 条 件 の 検 討 を行 う こ とに した 。
1.MI法 に よ る 細 胞 質 吸 引 摘 出 条 件 の 検 討 1)細 胞 質 吸 引 に適 した ガ ラ ス 針 の 口径
筆 者 ら の シ ス テ ム で は,ニ ー ドル ドロ ー イ ン グ 装 置 に加 え る 電 圧(65.0‑75.OV)と 電 流 を 変 化 さ せ, 種 々 の ガ ラ ス針 を作 製 す る こ とが で き る 。 そ こ で,
先 端 口径 の 異 な る ガ ラ ス 針 を 作 製 し,子 葉 鞘 内 表 皮 細 胞 か らの 細 胞 内 容 物 吸 引 摘 出 効 率 に つ い て検 討 し た。 先 端 口 径1.5μm以 下 の ガ ラ ス 針 を 使 用 し た 場 合,最 大 減 圧 条 件 下 で 吸 引 操 作 を 行 っ て も,細 胞 内 容 物 は吸 引 され ず,ま た,先 端 口 径 が5.0μm以 上 の ガ ラ ス針 を使 用 し た場 合 に は,細 胞 内 へ の ガ ラ ス針 の 挿 入 が 困 難 で あ っ た 。 先 端 口 径2.5〜3.0μmの ガ ラ ス 針 を 使 用 し た 場 合 に,細 胞 内 へ の 挿 入 及 び 細 胞 内 容 物 の 吸 引 が 最 も容 易 に 行 え る こ とが 確 認 さ れ た の で,細 胞 質 吸 引 摘 出 に は,先 端 口径 が2.5μmの ガ ラ ス 針 を 用 い る こ とに した(Fig.1)。 な お,こ の 口 径 の 針 で は核 は 吸 引 され な い。
2)吸 引 細 胞 内 容 物 の 量 的 計 測
ガ ラ ス 針 内 へ の 細 胞 内 容 物 の 吸 引 の 有 無 と量 を決 定 す る た め,以 下 の 実 験 を 行 っ た 。 ま ず,前 項 で 述 べ た 先 端 口 径2.5μmの ガ ラ ス 針 内 にDTT添 加
126
近畿 大学 農学 総合 研 究所報 告 第5号(1997)
肴52口35︒︒擢・︒幡宣︒↓暫旧︒雷コ︒﹀
o.os
0.04
0.02
20 40 60
Numbero.fcells
80
Fig.2.Relationshipbetweenthevolumeofsucked upcytoplasmiccontentsandthenumberof cellssuckedupoftheircontents.
SSC(×2)溶 液 を入 れ,細 胞 に 挿 入 し た の ち圧 力 ゲ ー ジ を操 作 し て,ガ ラ ス 針 内 を陰 圧 に し,細 胞 内 容 物 を 吸 引 摘 出 し た 。 吸 引 の 成 否 に つ い て は,顕 微 鏡 下 で 細 胞 の 収 縮 や,核 の ガ ラ ス 針 先 端 へ の 移 動 を観 察 す る こ とに よ っ て 確 認 し た 。 次 に,細 胞 内 容 物 の 吸 引 量 を 調 べ る た め,以 下 の 実 験 を 試 み た 。 す な わ ち,使 用 前 に 注 入 し たSSC緩 衝 液 の ガ ラ ス 針 内 で の 液 面 位 置 を記 録 し,吸 引 後 の 液 面 の 移 動 距 離 に 基 づ い て 細 胞 内 容 物 の 吸 引 量 を算 出 し た。 得 られ た 結 果 をFig.2に 示 す 。 そ れ に よ る と,吸 引 量 は吸 引 細 胞 数 に ほ ぼ 比 例 して お り,作 成 し た 検 量 線 か ら,本 法 に よ る 一 細 胞 当 た り の 吸 引 量 は約2.8×10‑2nlで あ る と推 定 さ れ た 。
3)吸 引 摘 出 の 周 辺 細 胞 に及 ぼ す 影 響
標 的 細 胞 か ら,そ の 内 容 物 を 吸 引 摘 出 し た場 合, そ の 隣 接 細 胞 に ど の よ う な影 響 を 及 ぼ す か を知 る た め に,吸 引 細 胞 に隣 接 す る細 胞 の 吸 引 後 の 生 存 率 を 調 べ た 。 す な わ ち,吸 引 摘 出 後 の 表 皮 組 識 を 寒 天 プ レー ト上 に 置 床 し,20℃,4000〜60001uxの 照 明 下 で 一 定 期 間 培 養 し て,周 辺 細 胞 に お け る 原 形 質 流 動 の 有 無 とFDA"(フ ロ レ ッ セ イ ンニ 酢 酸)に よ る 染 色 反 応 を調 べ た 。FDA染 色 反 応 は表 皮 組 識 を0.1%
FDA(ア セ トン に溶 解)で 浸 漬 し約3〜5分 後 に 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 し て 調 べ た。 生 存 率 は,生 存 細 胞 数 (暗視 野 で 蛍 光 を発 す る 細 胞 数)/全 細 胞 数(明 視 野 で の 細 胞 数)×100(%)で 表 した 。 そ の 結 果,隣 接 細 胞 は活 発 な 原 形 質 流 動 を 維 持 し て お り,FDAに よ る 生 体 染 色 反 応 も陽 性 で あ っ て(Fig.3),そ れ らの 生 存 率 は95〜100%で あ っ た 。 この よ う な 結 果 か ら,本 研
一
̀
γ 一
̀㍗
♂声
● 一
ず
,/
馬ゴ
r 艦 電 1哺
P●
一
魯 i
Fig.3.Effectofmicrosuctionofcytoplasmiccon‑
tentsfromtargettedcellsontheirneighbor‑
ingcells.Survivalratewasdeterminedby Fluoresceindiacetatestaining.
究 で 開 発 し た細 胞 質 吸 引 法 に よ っ て,周 辺 の 非 標 的 細 胞 を 死 滅 さ せ る こ とな く,特 定 の 標 的 細 胞 か ら細 胞 質 を 摘 出 す る こ と が で き る もの と考 え た。
4)細 胞 内 容 物 中 のRNAの 検 出
子 葉 鞘 内 表 皮 細 胞 よ り吸 引 し た細 胞 内 容 物 中 に お け る遺 伝 子 発 現 状 態 を 解 析 す る モ デ ル 系 を確 立 す る た め,ま ず 細 胞 質 内 に 多 量 に 存 在 す るrRNAに 着 目 し,そ の検 出 を試 み る こ と に し た。 す な わ ち,オ オ ム ギ18s‑rDNAに 対 応 す るEGR‑2断 片 を プ ロ ー ブ DNAと して ノ ー ザ ン ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン を 行 い,細 胞 質 内 容 物 中 のrRNAの 検 出 感 度 を検 定 し た。 多 くの 吸 引 細 胞 質 に つ い て 検 出 を 試 み た が,い ず れ の 場 合 も分 子 雑 種 形 成 が 確 認 され た 。 本 法 に よ る ノ ー ザ ン分 析 の 検 出 限 界 は1011gのrRNAで あ っ た が,(Fig.4),こ の 量 のrRNAを 得 る に は250〜300 細 胞 の 吸 引 が 必 要 で あ っ た 。 こ の よ うな 結 果 お よ び 細 胞 内 に 存 在 す るmRNAの 量 がrRNAの 一 割 程 度 で あ る こ と を考 慮 す れ ば,効 果 的 な 遺 伝 子 発 現 検 出 系 を確 立 す る た め に は,何 ら か の 方 法 でRNA量 を増 高 させ る 必 要 が あ る も の と考 え られ た 。
2.cDNA合 成 とPCR増 幅
前 項 で 述 べ た よ う に,遺 伝 子 情 報 発 現 に 関 わ る転 写 の 量 的 計 測 の た め に は,細 胞 内 に 存 在 す る mRNAの 増 幅 が 不 可 欠 と な る。そ こで,本 実 験 で は mRNAか らcDNAの 合 成 お よ びcDNAの 増 幅 を 試 み る こ と に し た 。 こ れ に はPCR(Polymerase chainreaction)法 が 最 も適 し て い る。PCRを 行 う に あ た っ て は,確 実 に 発 現 して い る遺 伝 子 を増 幅 で き る プ ラ イ マ ー を デ ザ イ ン す る必 要 が あ る 。そ こ で, 細 胞 質 に 存 在 す るmRNAの 分 離 と塩 基 配 列 を 決 定 す る こ と に し た。
松 川 ・豊田 オ オム ギ 子葉 鞘細 胞 にお け る遺 伝 子発現 の解析
12750
125
500
10
SCC
SCC
Fig.4.Northernhybridizationofsuckedupcyto‑
plasmicmaterialwithEcoRl‑digested pGR221whichccmtains18SrDNA.SSC twospotsofcrudecytoplasmiccontents.
Numbersrepresenttheamountsoftotal RNA(ng)extractedfrombarleyleaves.
Notethatthesignalintensityof5SCrough‑
lycorrespondsto10…5UngofrRNA.
1)mRNAの 精 製 とcDNAの 合 成
ま ず オ オ ム ギ 葉 か らRNAを 抽 出 し,そ の 全 RNAか らoligo(dT)‑Latex法 に よ っ て,mRNA を分 画,精 製 し た 。 真 核 細 胞 のmRNAは,そ の3' 末 端 に数 百 個 の ア デ ニ ル 酸 か らな る ポ リ ア デニ ル 酸 部 を も つ こ とが 知 られ て お り,ま た,こ の特 性 に 基 づ きoligo(dT)latexを 用 い てmRNAが 精 製 さ れ て い る22)。本 実 験 に お い て も,ポ リAテ ー ル と対 合 す るoligo(dT)1atex法 に よ っ てmRNAの 分 画 を 試 み た が,吸 着 と溶 出 操 作 を繰 り返 す こ と で,純 度 の 高 いmRNAを 分 取 で き る こ と が 明 ら か と な っ た 。 す な わ ち,1回 の み の 吸 着 ・溶 出 で は,ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 に 際 し てrRNAの 混 在 が 検 出 さ れ た の で,再 度 ポ リ㈹+RNAの 精 製 を 試 み た 結 果, rRNAの 混 入 し な いmRNAを 調 製 す る こ と が で き
た 。 そ こ で,本 実 験 に は2回 精 製 し たmRNAを cDNA合 成 に 使 用 し,そ れ を 鋳 型 と し逆 転 写 酵 素 を 用 い て,cDNAを 合 成 し た。合 成 したcDNAは プ ラ ス ミ ドベ ク タ ーpUC119のS≫zalサ イ トに 挿 入 し, cDNAラ イ ブ ラ リー を 作 製 し た 。本 実 験 の 目 的 は あ
る 特 定 のmRNAを 対 称 と し て そ の 発 現 経 緯 を 明 ら か に す る こ と に あ る の で,全 て ク ロ ー ン に つ い て 解 析 す る必 要 は な い 。そ こ で,全mRNAを プ ロ ー ブ と し た ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に お い て,特 に 強 い シ グ ナ ル が 得 られ た ク ロ ー ン(pCDNA10:400bp.)
を選 び,以 下 の 実 験 を 行 う こ と と し た。 す な わ ち,
GACGCCAACGGCAGGAAGGTCGGCAAGAAGGG TGTCTACCAGTTTGTTGACAAGTACGGCGCCAAC GTCGACGGCTACAGCCCAATCTACACGCCAGAG GAATGGTCCGAATCTGGTGACCGCTACGCCGGT GGAACGACCGGGCTTCTTATCTGGGCCGTCACC CTCGCCGGCCTCCTCGGCGGCGGCGCCCTCCT CGTCTACAACACCAGCGCTCTCGCCGGCTAAGA AAGCATCTACCTGTAACACGGGGCGGAGTTTCTA CTCTGTAATCTACGTAGCTACCATGTGAATGTAT GTCATCAACGATGCAAAGTAATTCATCCGAACAG ATGGTTTGTACGTAAAAAAAAAAAAAAAA Fig.5.NucleotidesequenceofpCDNA10which
hadbeenprovedtobeexpressedinboththe controlandpowderymildewinoculated
leaves.
pCDNAIOを プ ロ ー ブ と し てmRNAと の ノ ー ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 行 っ た 。 大 腸 菌 の16Sお よ び23S‑rRNAを サ イ ズ マ ー カ ー と し て, pCDNA10に 対 応 す るmRNAの サ イ ズ を 求 め た と
こ ろ,こ のmRNAの 全 長 は約900bpで あ る と推 定 され た 。 こ のmRNAは 子 葉 鞘 細 胞 で 確 実 に発 現 し て い る こ とが 解 っ た の で,そ れ がPCRに よ り増 幅 で きる か 否 か に つ い て検 討 し た 。 まず,PCR法 は, 厳 密 な 温 度 制 御 下 で 遺 伝 子 を増 幅 す る もの で あ り, ま た そ の た め の プ ラ イ マ ー デ ザ イ ン に は塩 基 配 列 中 のGC含 量 に 基 づ く融 解 温 度 を 求 め る こ とが 必 須 と な っ て く る 。 そ こ で,こ の 分 離mRNAか ら 得 た cDNA断 片 の 塩 基 配 列 を 決 定 す る こ と に し た 。 ま ず,ク ロ ー ニ ン グ した 断 片 の 塩 基 配 列 を 決 定 す る た め に,そ の 断 片 の 制 限 酵 素 地 図 を 作 製 し た 。 す な わ ち,cDNAを 各 種 制 限 酵 素(Sphl,Pstl,Sall,Hisrcll, Xbal,BamHI,Kpnl,Sacl)に よ っ て 切 断 し,サ イ
ズ マ ー カ ー と共 に ア ガ ロ ー ス電 気 泳 動 を行 っ た 。 得 ら れ た各 断 片 の 長 さ と,ベ ク タ ー上 の 切 断 点 を 考 慮 し て 制 限 酵 素 地 図 を作 製 し た。 そ の 結 果,こ の ク ロ ー ニ ン グ し た 断 片 上 に は 五1'ηぐII,Sallの2つ の 制 限 酵 素 サ イ トが 存 在 す る と推 定 され た 。 そ こ で,制 限 酵 素 地 図 の 情 報 を も と に,cDNA断 片 が 挿 入 さ れ た ク ロ ー ン か らプ ラ ス ミ ドベ ク タ ーpCDNAlOを 分 離 し,そ れ か らcDNA領 域 の み を 切 り出 し,Ml3mp18 お よ びM13mp19フ ァ ー ジ ベ ク タ ー のRF‑DNAに 挿 入 し た後,Dideoxy法 に よ っ て 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。結 果 をFig.5に 示 す 。こ のcDNAは361bpか ら な り上 流 か ら49pbに 制 限 酵 素Hirrc・IIサ イ トが,70 bpに 正1'ὴ・IIおよ びSallサ イ トが 存 在 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。
2)プ ラ イ マ ー の 合 成 とPCR条 件 の 検 討
先 に述 べ た よ う に,吸 引 分 取 し た細 胞 内 容 物 の な
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近 畿大 学 農学総 合研 究所 報 告 第5号(1997)
か に は 直 接 ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ っ て検 出 で き る量 のmRNAは 含 ま れ て い な い 。そ こで,特 定 遺 伝 子 の 発 現 を 解 析 す る た め に は,そ のmRNAの cDNAを 試 験 管 内 ま た は細 胞 内 で 増 幅 す る 必 要 が
あ る。本 項 で は,先 に 得 たcDNAに っ い て,PCRに よ る増 幅 を 試 み た 。 ま ず,前 項 で 得 ら れ た 塩 基 配 列 デ ー タ ー よ りプ ラ イ マ ー の デ ザ イ ン を行 っ た 。
プ ラ イ マ ー の 条 件 と し て は① 鎖 長 は15〜30塩 基 で,②1組 の プ ラ イ マ ー は標 的DNAお よ び そ の 上 流 と下 流 を 含 め た 全 体 の 領 域 との ホ モ ロ ジ ー が 低 い,③GC含 量 が50%程 度 で あ る,④ 自 己 相 補 配 列 な ど を含 ま な い,⑤2つ の プ ラ イ マ ー が お 互 い に相 補 的 で な い,⑥2つ の プ ラ イ マ ー のTm値(融 解 温 度) が,ほ ぼ 同 じで あ る,こ とな どが 挙 げ られ る。 こ れ ら の 点 を 考 慮 に入 れ プ ラ イ マ ー の検 索 を行 い,そ の デ ー タ ー に も とつ い て プ ラ イ マ ー を合 成 した 。PCR の 条 件 は オ リ ゴdTプ ラ イ マ ー と15merよ り な る 合 成 プ ラ イ マ ー(GC含 量53.3%,融 解 温 度46℃)を 用 い て 検 討 し た。PCRの 鋳 型 に はmRNAか ら合 成 し たcDNAま た は全RNAか ら 合 成 し たcDNAを 使 用 し た 。 ま た対 照 と し てpCDNA10を 鋳 型 と し て 使 用 し た 。 これ らcDNAに 合 成 し た プ ラ イ マ ー(5'
‑TTACTTTGCATCGTTG‑3' ,5'‑CAAT‑
CTACACGCCAG)を 加 え,変 性94℃1分,ア ニ ー リ ン グ30℃1分,伸 長 反 応72℃2分 サ イ ク ル 数35回 の 条 件 でPCRを 行 っ た と こ ろ,特 異 的 な バ ン ドが 検 出 さ れ た 。 こ れ ら の 結 果 は,PCR法 に よ っ て 特 定 細 胞 のmRNAを 増 幅 す る こ とが 可 能 で あ る こ と を 示 す 。 す な わ ち,こ の細 胞 質 吸 引 法 を応 用 す る こ と に よ っ て,特 定 細 胞 に お け る遺 伝 子 発 現 解 析 が 可 能 で あ る こ とが 明 ら か とな っ た 。
3.細 胞 内 注 入 法 に よ る 遺 伝 子 発 現 解 析 の 基 礎 的 条 件
細 胞 内 でPCRを お こ な い,特 定 細 胞 内 で の 遺 伝 子 発 現 を検 出 す る 方 法 を確 立 す る た め の 基 礎 的 条 件 の 検 討 を お こな っ た 。こ の 方 法 は,細 胞 内 でPCRを 行 っ て,そ の細 胞 内 で の 遺 伝 子 の 発 現 を検 出 す る も の で あ っ て,感 染 細 胞 に 限 ら ず 形 態 形 成 過 程 に お い て 発 現 す る遺 伝 子 の 発 現 解 析 に も応 用 で き る。 そ こ で,筆 者 ら は,ま ず,PCRに よ り細 胞 内 で 酵 素 反 応
を行 う た め の 細 胞 内 へ の 高 分 子 の 導 入 と移 動 に つ い て 検 討 し た。 ま ず,オ オ ム ギ 子 葉 鞘 内 表 皮 組 織 を,
4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドに よ っ て 固 定8)し,イ ン ジ ェ ク シ ョ ン ス コ ー プ に 装 着 し た ガ ラ ス 針 を 用 い て,特 定 細 胞 に プ リ ッ キ ン グ 処 理 を行 っ た 。 こ の 子 葉 鞘 を,0.5%FITC結 合 ア ル ブ ミン 溶 液 に浸 漬 し,
山O<トZ山O匡回血
INCUBATION(min)
Fig.6.TimerequiredforprickingintrosuctionofFITC‑labeledbovineserumalbumineinto barleycoleoptilecellsandfortheirremoval bywashing.A:Rateoffluorescedcells afterimmersioninphosphate‑buffered salinesolutioncontainingFITC‑labeledal‑
humine.B:Rateofremovaloftheal‑
buminebybathinginphosphate‑buffered salinesolution.
5分 毎 に 蛍 光 顕 微 鏡 下 で観 察 し た 。 そ の 結 果,浸 漬 し て15分 後 に プ リ ッキ ン グ 処 理 し た細 胞 の90%以 上 に お い て 蛍 光 が 認 め ら れ た 。 こ の と き プ リ ッ キ ン グ を行 っ て い な い細 胞 で 蛍 光 を 発 し た もの は,10%以 下 で あ っ た 。 次 に,導 入 さ れ た 子 葉 鞘 を 洗 浄 液 に 浸 漬 し,FITC結 合 ア ル ブ ミ ン の 脱 洗 を 検 討 し た と こ ろ,20分 後 に は 完 全 に 洗 浄 さ れ る こ と が 分 か っ た (Fig,6)。 この こ と か ら,オ オ ム ギ 子 葉 鞘 内 へ のPCR 反 応 液 の 導 入 が 可 能 で あ り,細 胞 内 で のmRNAの PCRに よ る増 幅 は 可 能 で あ る と推 測 し た 。
以 上,本 研 究 で はMI法 を用 い た 単 一 特 定 細 胞 に お け る 遺 伝 子 発 現 解 析 の た め の細 胞 質 吸 引 法 と細 胞 内 注 入 法 に つ い て 基 礎 的 条 件 を 検 討 し た 。 特 に細 胞 質 吸 引 法 に つ い て はmRNAの 抽 出,分 離,cDNA合 成 とPCRに よ る遺 伝 子 増 幅 な ど詳 細 に わ た る 実 験 的 検 討 か ら,本 法 は感 染 細 胞 に 特 異 的 に発 現 す る遺 伝 子 の 解 析 に 応 用 で き る こ と が 確 認 さ れ た 。 今 後 は 細 胞 内 で 発 現 し て い る 遺 伝 子 を 検 出 す る た め の細 胞 内 注 入 法 に つ い てPCR条 件 の設 定 も含 め て検 討 を 行 い,オ オ ム ギ う ど ん こ病 感 染 オ オ ム ギ 葉2)に お い て 発 現 す る遺 伝 子 とそ の 発 現 の 時 間 的 経 緯 を 明 ら か に し,宿 主 一病 原 菌 相 互 反 応 を分 子 レベ ル で 論 ず る よ う研 究 を 発 展 させ た い 。
1 2 3 4 5 6 7 8 9
ia)
松 田 ・豊 田:オ オ ムギ子 葉鞘 細胞 にお け る遺伝 子 発現 の解 析
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