ショウジョウバエ神経筋シナプス伝達調節機構におけるCentaurin gamma 1Aの機能解析

目 次 --- 2

I 背 景 --- --- --3

II 研 究 方 法 --- ---12

1. 使 用 系 統 --- ---12

2. RNA 干 渉 法 (RNA interference) --- ---13

3. Gal4-UAS system--- ---13

4. 電 気 生 理 学 的 解 析 --- ---14

4-1. 細 胞 内 電 位 記 録 法 --- ---14

4-2. Paired pulse stimulation (PPS) --- ----16

4-3. 高 頻 度 反 復 刺 激 に よ る シ ナ プ ス プ ー ル サ イ ズ の 測 定 ---16 4-4. 電 気 生 理 学 的 手 法 に お け る 解 析 方 法 --- ---17 5. 形 態 観 察 --- ---18 III 実 験 結 果 --- ---19 1. P 因 子 挿 入 に よ る cenG1A 変 異 体 に お け る 電 気 生 理 学 的 解 析 ---19 2. RNA 干 渉 法 に よ り 組 織 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 ---21 2-1. 組 織 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 に お け る 電 気 生 理 学 的 解 析 ---21 2-2. 組 織 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 に お け る シ ナ プ ス 形 態 解 析 ---25 2-3. 組 織 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 に お け る 放 出 確 率 の 解 析 ---28 2-4. 組 織 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 に お け る シ ナ プ ス 小 胞 数 の 解 析 ---31 IV 考 察 --- ---33 1. 神 経 細 胞 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 ---33 2. 筋 肉 細 胞 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 ---35

3. negative regulator と し て の CenG1A 機 能 --- ---36

V 謝 辞 --- ---38

4

シ ナ プ ス 前 細 胞 に 存 在 す る 神 経 伝 達 物 質 を 含 ん だ シ ナ プ ス 小 胞 は 、 放 出 可 能 プ ー ル (RRP: Readily releasable pool)と 、 貯 蔵 プ ー ル (RP: reserve pool)の 主 に 二 種 類 の プ ー ル に 分 か れ て い る 。 RRP の 小 胞 は シ ナ プ ス 前 膜 に 付 着 し た 状 態 で 存 在 し 、 シ ナ プ ス 前 膜 の 脱 分 極 に よ る Ca2 +_{の 流 入 に よ り 、 直 ち に シ ナ プ ス 前 膜 の 放 出 活 性 体} (active zone)に 融 合 す る こ と が で き る 。 こ の シ ナ プ ス 小 胞 の 前 膜 へ の 付 着 と 融 合 の メ カ ニ ズ ム と し て SNARE 仮 説 が 提 唱 さ れ て い る 。 SNARE 仮 説 と は 、 小 胞 の 膜 へ の 付 着 が 、小 胞 膜 上 に 存 在 す る v-SNARE、シ ナ プ ス 前 膜 側 に 存 在 す る t-SNARE と 細 胞 質 タ ン パ ク 質 で あ る SNAPs や NSF 等 と の 相 互 結 合 に よ る も の だ と す る と い う 仮 説 で あ る 。 他 に も 、 シ ナ プ ト タ グ ミ ン 等 の 多 く の タ ン パ ク 質 が 関 与 し 、 標 的 膜 へ の 付 着 と 融 合 を 達 成 し て い る と 考 え ら れ て い る (Cowan et al, 2001)。一 方 、RP の 小 胞 は 、 ア ク チ ン で 構 成 さ れ た 細 胞 骨 格 に 結 合 し て お り 、 シ ナ プ ス 前 膜 の 脱 分 極 に よ る 細 胞 内 へ の Ca2 +_{の 流 入 後 直 ち に は 放 出 さ れ ず 、 RP か ら RRP へ と 移 動 す る 。} こ の 二 種 の プ ー ル (RP と RRP)は 更 に 分 類 す る こ と が で き 、 放 出 さ れ る 能 力 を 持 つ が 前 膜 に 付 着 し て い な い‘ non-RRP’で あ る 小 胞 の プ ー ル を 、リ サ イ ク リ ン グ プ ー ル と 呼 び 、小 胞 は RP、 リ サ イ ク リ ン グ プ ー ル 、 RRP の 3 つ の プ ー ル に 分 け ら れ る と 考 え ら れ て い る 場 合 も あ る (図 2A)(Zucker and Regehr, 2002)。

図 2. シナプス小胞プール

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シ ナ プ ス 伝 達 で は 、神 経 伝 達 物 質 が 放 出 さ れ る と 、細 胞 膜 と 融 合 し た 小 胞 膜 が 、 エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ り 再 び 取 り 込 ま れ 、 神 経 伝 達 物 質 を つ め ら れ て 再 利 用 さ れ る リ サ イ ク リ ン グ と い う 現 象 が お き て い る 。シ ナ プ ス 小 胞 リ サ イ ク リ ン グ に は 、 2 つ の 反 応 の 速 い 経 路 と 1 つ の 遅 い 経 路 の 計 3 つ の 経 路 が あ る 。1 つ め は 、active zone に 小 胞 が 結 合 し た ま ま 神 経 伝 達 物 質 を 最 充 填 す る kiss and stay。 2 つ め は 、 局 所 的 な リ サ イ ク リ ン グ で ク ラ ス リ ン 非 依 存 的 に 行 わ れ る Kiss and run。 3 つ め は 、 ク ラ ス リ ン 依 存 的 な エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ る endosomal recycling で あ る (図 3)。 こ の 3 つ め の 経 路 で は 、ク ラ ス リ ン と い う タ ン パ ク 質 が 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 。ク ラ ス リ ン は 膜 の 細 胞 質 に 面 し た 側 に か ご 状 の 網 目 構 造 を 組 み 上 げ 、 細 胞 膜 を 出 芽 さ せ る 。 出 芽 し た 小 胞 の 根 元 を 囲 む よ う に ダ イ ナ ミ ン タ ン パ ク が 並 び 、 小 胞 を 膜 か ら く び り 切 る こ と に よ り 、 小 胞 は 前 膜 か ら エ ン ド サ イ ト ー シ ス さ れ 細 胞 内 に 回 収 さ れ る 。 こ れ ら の 経 路 に よ り シ ナ プ ス 小 胞 は 再 び プ ー ル に 充 填 さ れ る 。 こ の シ ナ プ ス 小 胞 リ サ イ ク リ ン グ の 過 程 に も 多 く の 分 子 が 関 与 し て お り 、 た と え ば 、 低 分 子 量 G タ ン パ ク で あ る Rab5 や Rab11 な ど が 関 与 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る (Maxfield and McGraw, 2004)。Rab5 は endosome の 形 成 と 機 能 に 関 与 し て お り (Lawe et al., 2002)、Rab11 は 、エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ り 取 り 込 ま れ た 分 子 の リ サ イ ク リ ン グ を 制 御 し て い る と い う 報 告 が あ る (Chen et al., 1998; Ren et al., 1998)。こ れ ら 多 く の 因 子 が 働 き 、 シ ナ プ ス 小 胞 放 出 過 程 が 適 切 に 行 わ れ る こ と で 、 シ ナ プ ス 伝 達 が 達 成 さ れ て い る 。

6 図 3. シナプス小胞リサイクリング経路

Active zone に結合したまま伝達物質を充填される(Kiss-and-stay)。クラスリン非依存的で局所的なエンド

7 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ に つ い て モ デ ル 生 物 と し て の シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ は 、 ラ イ フ サ イ ク ル が 短 く 扱 い や す い た め 、 古 く か ら モ デ ル 生 物 と し て 多 く の 研 究 で 使 わ れ て き た 。 そ の た め 、 数 々 の 遺 伝 学 的 、 分 子 生 物 学 的 手 法 が 確 立 さ れ て お り 、 分 子 レ ベ ル に お い て も 個 体 レ ベ ル に お い て も 解 析 が 可 能 で あ る 。 こ れ ら の 理 由 か ら 優 れ た モ デ ル 生 物 と な っ て お り 様 々 な 研 究 に 用 い ら れ て い る (Keshishian et al., 1996; Kazama et al., 2003; Marqués and Zhang, 2006; Uytterhoeven et al., 2011; Müller et al., 2011)。 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ で 用 い る 遺 伝 学 的 手 法 の 代 表 例 と し て GAL4 エ ン ハ ン サ ー ト ラ ッ プ 法 が あ る (Brand and Perrimon, 1993)。 こ れ は 、 ゲ ノ ム 上 に 存 在 す る 組 織 特 異 的 な エ ン ハ ン サ ー 活 性 を 利 用 し て 、 酵 母 由 来 の 転 写 因 子 GAL4 を 発 現 さ せ る 手 法 で あ る 。 エ ン ハ ン サ ー と は 遺 伝 子 の 前 後 や イ ン ト ロ ン の 中 な ど に 位 置 し 、付 近 の DNA 領 域 の 転 写 活 性 を 調 節 す る DNA 領 域 の こ と を 示 す 。 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ の ゲ ノ ム に は 少 な く と も 数 千 以 上 の エ ン ハ ン サ ー が 存 在 す る こ と が わ か っ て い る 。 ま た 、 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ は ト ラ ン ス ポ ゾ ン の 一 種 で あ る P 因 子 を も っ て い る 。P 因 子 は P 因 子 転 移 酵 素 に よ り ゲ ノ ム 内 を ジ ャ ン プ す る こ と が で き る 。 酵 母 由 来 の 転 写 調 節 因 子 で あ る gal4 遺 伝 子 を こ の P 因 子 に 組 み 込 む こ と に よ っ て 、 ゲ ノ ム 内 の さ ま ざ ま な 位 置 に gal4 遺 伝 子 が 挿 入 さ れ た エ ン ハ ン サ ー ト ラ ッ プ 系 統 が 作 成 で き る 。 そ れ ぞ れ の エ ン ハ ン サ ー ト ラ ッ プ 系 統 で は 、P 因 子 挿 入 位 置 の 近 く に あ る エ ン ハ ン サ ー の 調 節 を 受 け て GAL4 タ ン パ ク 質 が 発 現 す る 。 こ の GAL4 タ ン パ ク 質 は 、 UAS (upstream activator sequence) と 呼 ば れ る DNA 配 列 に 連 な る 遺 伝 子 の 発 現 を 誘 導 す る 。 任 意 の 遺 伝 子 を UAS の 下 流 に 組 み 込 ん だ 系 統 と 、GAL4 エ ン ハ ン サ ー ト ラ ッ プ 系 統 を 掛 け 合 わ せ る こ と に よ り 次 の 世 代 の 個 体 は GAL4 タ ン パ ク 質 が 発 現 し て い る 組 織 で の み 、 UAS 下 流 の 任 意 の 遺 伝 子 が 発 現 す る 個 体 と な る 。 様 々 な GAL4 エ ン ハ ン サ ー 系 統 、 UAS 系 統 が ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク ト に よ り 作 成 さ れ 、 ス ト ッ ク セ ン タ ー に 保 存 さ れ て い る

8 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 幼 虫 神 経 筋 接 合 部 位 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 幼 虫 の 神 経 筋 接 合 部 位 は 、 A2-A7 の 各 体 節 に 片 側 あ た り 30 個 の 筋 肉 細 胞 が 規 則 正 し く な ら び 、 腹 部 神 経 節 か ら 伸 び た 運 動 ニ ュ ー ロ ン が ど の 筋 肉 細 胞 に シ ナ プ ス を 形 成 し て い る か が 明 ら か に な っ て い る (keshishian et al., 1996) (図 4)。 そ の た め 、 シ ナ プ ス の 応 答 と 形 態 を 単 一 シ ナ プ ス レ ベ ル で 解 析 す る こ と が 可 能 で あ り 、 シ ナ プ ス 形 成 、 機 能 調 節 の 分 子 メ カ ニ ズ ム の 解 明 に 適 し た 実 験 系 で あ る と 考 え ら れ て い る 。 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 神 経 筋 接 合 部 位 に お け る 情 報 伝 達 も 、 神 経 終 末 膜 の 脱 分 極 に よ り 、 シ ナ プ ス 小 胞 の エ キ ソ サ イ ト ー シ ス が お き 、 受 容 体 が 活 性 化 さ れ る こ と に よ っ て 行 わ れ て い る 。 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 神 経 筋 シ ナ プ ス で は 、 シ ナ プ ス 間 隙 に 放 出 さ れ る 神 経 伝 達 物 質 は グ ル タ ミ ン 酸 で あ る 。 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 幼 虫 の 筋 肉 細 胞 に は 、2 種 の グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 が 存 在 す る 。細 胞 内 電 位 記 録 法 を 用 い 、筋 肉 細 胞 の 静 止 電 位 か ら 、 受 容 体 へ の 伝 達 物 質 結 合 に よ っ て 生 じ た 筋 肉 細 胞 膜 電 位 変 化 を 記 録 す る こ と に よ っ て 、 シ ナ プ ス 機 能 に つ い て 解 析 を 行 う こ と が 可 能 で あ る 。 ま た 、 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ の 神 経 筋 シ ナ プ ス の シ ナ プ ス 前 細 胞 に は 、 タ ー ミ ナ ル に 約 84,000 の 量 子 (小 胞 )を 含 ん で お り 、 全 シ ナ プ ス 小 胞 の 約 80% が 貯 蔵 プ ー ル に (Reserve pool: RP)、14～ 19％ が リ サ イ ク リ ン グ プ ー ル (Recycling pool)、約 0.4％ が 即 時 放 出 可 能 プ ー ル (readily releasable pool: RRP)に 貯 蔵 さ れ て い る と い わ れ て い る (Rizzoli and Betz, 2005)(図 2B)。

図 4. ショウジョウバエ神経筋接合部位

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部位は、半体節に約 35 のモーターニューロンが 30 個の筋肉細胞に投 射している。ISN: intersegmental nerve, SN: segmental nerve, vm: ventral midline, dm: dorsal midline.

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シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 神 経 筋 接 合 部 位 を 用 い た 研 究

神 経 筋 接 合 部 位 を モ デ ル 系 と し て 、 様 々 な 因 子 の シ ナ プ ス で の 機 能 が 研 究 さ れ て い る 。 例 え ば 、 Phoshoinositide 3-kinase (PI3K)が 神 経 筋 シ ナ プ ス 伝 達 の negative regultor で あ る 可 能 性 を 示 唆 す る 研 究 や (Howlett et al., 2008)、細 胞 接 着 因 子 で あ る Fasciclin II (FasII)の 神 経 筋 シ ナ プ ス 発 達 や 可 塑 性 に お け る 機 能 な ど が 研 究 さ れ て い る (Davis et al., 1997; Sánchez-Soriano and Prokop, 2005 )。最 近 の 研 究 で は 、FasII が 足 場 タ ン パ ク 質 で あ る Discs large (Dlg)と 共 に 機 能 し 、 活 動 依 存 的 な シ ナ プ ス 発 達 を 調 節 し て い る と い う こ と も 明 ら か に な っ た (Beumer et al.,2002; Kazama et al., 2007; Morimoto et al., 2010)。ま た 、シ ナ プ ス 後 細 胞 か ら 、前 細 胞 に 働 き か け 伝 達 物 質 放 出 過 程 を 調 節 す る 逆 行 性 シ グ ナ ル (Retrograde signal) が 存 在 す る こ と が 明 ら か に な っ て お り (Davis and Goodman, 2002; Davis, 2006)、bone morphogenetic protein (BMP)と い う シ グ ナ ル 分 子 が 同 定 さ れ て い る (Aberle et al., 2002; Marqués et al., 2002; Marqués and Zhang, 2006)。 こ の よ う に 、 神 経 筋 接 合 部 位 を 用 い た 研 究 で 多 く の 知 見 が 得 ら れ て い る 。

Centaurin に つ い て

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告 も あ る (Wassink et al., 2005) 。し か し 、Centaurin 遺 伝 子 の シ ナ プ ス に お け る 機 能 、 自 閉 症 と の 関 連 は ま だ 明 ら か に な っ て い な い 。Centaurin が ArfGAP や PH な ど の ド メ イ ン を も つ こ と か ら 、 私 は Centaurin family が 小 胞 の リ サ イ ク リ ン グ に 関 係 し て い る 可 能 性 が あ る と 考 え た 。 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ に お い て centaurin 遺 伝 子 は 、 遺 伝 子 が 2 種 (β, γ)、 1 つ の 遺 伝 子 か ら 産 生 さ れ る isoform も 3 つ (A, B, C)の み で 哺 乳 類 と 比 較 す る と 圧 倒 的 に 分 子 の 数 が 少 な い 。 本 研 究 で は 、 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ の 2 つ の centaurin 遺 伝 子 の う ち 、 centaurin gamma 1A (cenG1A) に 着 目 し た 。 cenG1A 遺 伝 子 は 、 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 幼 虫 の 筋 肉 細 胞 に も 神 経 細 胞 に も 存 在 し 、 発 生 段 階 に お い て 運 動 ニ ュ ー ロ ン が 筋 肉 細 胞 に 投 射 し て い く 過 程 で 、 運 動 ニ ュ ー ロ ン の 投 射 に 依 存 し て 筋 肉 細 胞 内 で 発 現 量 が 増 加 し て い た 遺 伝 子 で あ る こ と が わ か っ て い る (Flybase, Fukui et al., 2012)。そ の た め 、CenG1A は 神 経 筋 シ ナ プ ス に お い て も 何 ら か の 機 能 を も つ こ と が 期 待 で き る 分 子 で あ る 。

図 5. Centaurin family

12 II 研 究 方 法 1, 使 用 系 統 全 て の 実 験 に お い て キ イ ロ シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ (Drosophila melanogaster)の 25℃ で 飼 育 し た 3 齢 幼 虫 を 実 験 動 物 と し て 用 い た 。 cenG1A 遺 伝 子 の シ ナ プ ス 機 能 へ の 影 響 を 調 べ る た め に 、P 因 子 挿 入 に よ り cenG1A 遺 伝 子 に 変 異 が お き て い る 個 体 (20232, 12957)(図 6)と 、Gal4-UAS system (Brand and Perrimon, 1993) を 用 い て 、組 織 特 異 的 に cenG1A 遺 伝 子 の 発 現 を 調 節 し た 個 体 (図 6)を 使 用 し た 。 Gal4-UAS system と は 、 Gal4 系 統 と UAS(upstream activating sequence) 系 統 を か け あ わ せ る こ と で 、 任 意 の 分 子 を 特 定 の 組 織 に 発 現 さ せ る こ と が で き る 実 験 系 で あ る (後 述 )。

本 研 究 で は 、 以 下 の 系 統 の 個 体 を 実 験 に 使 用 し た 。

・ Yellow White (yw) cenG1A 遺 伝 子 の 変 異 体 の 遺 伝 的 バ ッ ク グ ラ ウ ン ド に な っ て い る 個 体 。 対 照 個 体 と し て 用 い た 。

・ 20232, 12957 P 因 子 挿 入 に よ り cenG1A 遺 伝 子 に 変 異 が 起 き て い る 個 体 (Bellen et al., 2004)。

・ elav-Gal4 全 神 経 細 胞 特 異 的 に GAL4 タ ン パ ク 質 を 発 現 し て い る GAL4 系 統 。 ・ 24B-Gal4 全 筋 肉 細 胞 特 異 的 に GAL4 タ ン パ ク 質 を 発 現 し て い る GAL4 系 統 。 ・ UAS-31811R-2(X)RNAi UAS 配 列 の 下 流 に cenG1A 遺 伝 子 に 対 す る RNA 干 渉 を

13 2, RNA 干 渉 (RNAi: RNA interference)

RNAi と は 、遺 伝 子 を 不 活 性 化 す る こ と が で き る 手 法 で あ る 。細 胞 ま た は 生 物 に 不 活 性 化 し た い 遺 伝 子 と 塩 基 配 列 が 一 致 す る 二 本 鎖 RNA 分 子 を 導 入 す る 。二 本 鎖 RNA は Dicer と い う 二 本 鎖 合 成 酵 素 に よ っ て 21bp 程 度 に 小 さ く 切 断 さ れ る 。こ の 断 片 が RISK と い う タ ン パ ク 複 合 体 と 結 合 し 、 標 的 遺 伝 子 か ら つ く ら れ る mRNA と ハ イ ブ リ ッ ト 形 成 し 、 分 解 、 ま た は 翻 訳 を 阻 害 す る 。 分 解 に よ っ て 生 じ た 短 い 断 片 RNA は 新 た な 二 本 鎖 RNA 分 子 作 り に 使 わ れ 、 標 的 遺 伝 子 の mRNA は 絶 え ず 分 解 さ れ る (Alberts et al., 2002)。こ の よ う な メ カ ニ ズ ム に よ り 、RNAi を 用 い る こ と で 標 的 遺 伝 子 を 不 活 性 化 す る こ と が で き る 。シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ に は 2 つ の Dicer (Dicer-1, Dicer-2)が 存 在 す る 。 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ RNAi 機 構 に お い て は ， 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ た 外 来 二 本 鎖 RNA が Dicer-2 お よ び そ の 結 合 因 子 R2D2 依 存 的 に 小 分 子 RNA（ small interfering RNA; siRNA） に 切 断 さ れ ， 一 本 鎖 siRNA が RISC 中 核 因 子 AGO2 に 取 り 込 ま れ る こ と で RISC が 形 成 さ れ る 。 様 々 な 遺 伝 子 に 対 し て RNA 干 渉 を 起 こ す 配 列 を も つ UAS 系 統 が 作 成 さ れ 、stock center に 保 存 さ れ て い る (Drosophila Genetic Resource Center (DGRC) 京 都 )。 ま た 、 こ れ ら の 系 統 に Dicer を 共 発 現 さ せ る こ と で 、 RNA 干 渉 が 促 進 さ れ る (Dietzl et al., 2007)。 本 研 究 で は 、 centaurin 遺 伝 子 に 対 す る RNAi 配 列 を も つ UAS-31811R-2(X)RNAi と い う 系 統 を 使 用 し た 。

3, Gal4-UAS system

14 図 7. GAL4-UAS system

Gal4 タンパク質が発現している場所でのみ、UAS の下流の任意の配列の発現を調節できる実験系。本 研究では、神経細胞特異的に Gal4 タンパクを発現している elav-Gal4、筋肉細胞特異的に Gal4 タンパク を発現している 24B-Gal4。cenG1A 遺伝子に対する RNAi 配列をもつ UAS-31811R-2(X)RNAi。

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2μm 以 下 、抵 抗 15MΩ 以 上 )を 挿 入 し て 行 っ た (図 8 下 図 )。1 個 体 か ら は 1 体 節 の み を 使 用 し た 。 増 幅 器 は Multiclamp700A (Axson instruments Inc., CA, USA)、 AD 変 換 機 は Digidata1322A (Axson instruments Inc., CA, USA)を 使 用 し た 。

記 録 測 定 時 の 外 液 は カ ル シ ウ ム 濃 度 を 二 種 類 (CaCl2 1.5mM,CaCl2 0.375mM) に 変

化 さ せ た 。刺 激 電 極 か ら 吸 い 込 ん だ 神 経 束 に 2－ 4mV, 0.2Hz の 刺 激 を 10 回 与 え て 、 刺 激 に よ る 神 経 伝 達 物 質 放 出 に 伴 う 膜 電 位 の 変 化 (Excitatory junctional potentials: EJPs)を ガ ラ ス 記 録 電 極 に よ り 記 録 し た 。 静 止 膜 電 位 か ら ピ ー ク 電 位 ま で の 差 異 を EJP の 大 き さ (EJPs amplitude)と し 、10 回 の 刺 激 に よ る 応 答 を 1 個 体 の EJPs amplitude と し た 。 さ ら に 、 個 体 ご と に 得 ら れ た EJPs amplitude を 平 均 し 、 そ の 系 統 の EJPs amplitude の 値 と し て 使 用 し た 。ま た 、0.375mM の CaCl2を 含 む HL3 溶 液 下 で 刺 激

16 4-2, Paired Pulse Stimulation (PPS)

Paired Pulse Stimulation (PPS)は 、数 十 ミ リ 秒 の 時 間 間 隔 で 二 回 刺 激 を 行 い 、シ ナ プ ス 伝 達 を 誘 起 さ せ る 手 法 で あ る 。 一 般 に 、 一 回 目 の 刺 激 に よ る 応 答 に 対 し 、 二 回 目 の 刺 激 に よ る 応 答 が 増 大 す る 。こ れ を Paired pulse facilitation (PPF)と い い 、残 存 Ca2 +_{に 起 因 す る 現 象 で あ る と い わ れ て い る (Zucker and Regehr, 2002)。 PPS に お}

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図 9. 高頻度刺激による放出可能シナプス小胞数の測定

50Hz の高頻度刺激を 30sec 行ったときの EJPs 記録。刺激開始から 刺激終了時にかけて EJPs amplitude は徐々に減衰してくる。Scale bar は 5000ms, 10mV。

4-4, 電 気 生 理 学 的 手 法 に お け る 解 析 方 法

EJPs amplitude, mEJPs amplitude の 算 出 は 全 て Mini analysis (Synaptosoft Inc., NJ USA)を 使 用 し た 。膜 電 位 が -55mV～ -76mV の デ ー タ を 使 用 し た 。PPS、高 頻 度 刺 激 に お け る amplitude は 、 Clamp fit 9.0 (Axson instruments Inc., CA, USA ) を 用 い て 静 止 膜 電 位 か ら 、最 大 の ポ イ ン ト を 手 動 で 測 定 し た (図 10)。全 て の デ ー タ は 、one-way analysis of variance (ANOVA)に よ り 統 計 処 理 を 行 っ た 。

図 10. EJP における amplitude の測定

18 5, 形 態 学 的 解 析 CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 際 に シ ナ プ ス 形 態 に 与 え る 影 響 を 解 析 す る た め に 、抗 体 染 色 を 用 い て 、生 理 学 実 験 に 用 い た 6 番 筋 肉 を 含 む 、6,7 番 筋 肉 の シ ナ プ ス の 形 態 観 察 を 行 っ た 。 一 次 抗 体 と し て 、

goat anti-horse radish peroxides (HRP), mouse anti-GluRIIA, mouse anti-nc82 二 次 抗 体 と し て

donkey anti-mouse Alexa488, donkey anti-goot Alexa594 (Molecular Probes, Engene, OR, USA, ) を 使 用 し た 。 観 察 は 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 (Olympus FV1000D IX81 confocal laser scanning microscope, Olympus, Tokyo, Japan) を 用 い て 行 い 、 解 析 は IPLab software (Scanalytics, Fairfax, VA, USA) を 用 い て 行 っ た 。

シ ナ プ ス 前 細 胞 の マ ー カ ー と し て 使 用 し た 抗 HRP 抗 体 を 用 い る こ と に よ り 染 色 さ れ た 神 経 細 胞 (図 11A 上 図 )の 面 積 を そ の 神 経 が 投 射 し て い る 筋 肉 細 胞 の 面 積 で 割 り 付 け た 値 を 神 経 の 面 積 と し て 使 用 し た 。ま た 、GluRIIA 抗 体 を 用 い る こ と に よ り 染 色 さ れ た 6,7 番 筋 肉 の シ ナ プ ス の GluRIIA(図 11A 下 図 )の 蛍 光 強 度 を GluRIIA 量 と し て 用 い た 。HRP に 対 す る 抗 体 で 染 色 さ れ た エ リ ア の 面 積 、GluRIIA の 蛍 光 強 度 の 値 は 、そ れ ぞ れ CentRNAi の 個 体 か ら 得 ら れ た 値 で ノ ー マ ラ イ ズ し 、そ れ ぞ れ の 系 統 の 値 と し て 使 用 し た 。さ ら に active zone の マ ー カ ー で あ る nc82 を 用 い る こ と に よ り 染 色 さ れ た puncta の 数 は 、6.7 番 筋 肉 に 投 射 し て い る シ ナ プ ス か ら ラ ン ダ ム に 4 つ の bouton (図 11B)を 選 択 し 、そ の bouton 内 に 観 察 で き る nc82 positive puncta を 測 定 、 bouton 一 つ 分 の puncta 数 の 平 均 を そ の 個 体 の puncta 数 と し て 用 い た 。

図 11. 抗体染色による形態観察

A,上図, HRP に対する抗体によって染色された 6，7 番筋シナプスの神経細胞。下図, GuRIIA 抗体によ って染色された 6，7 番筋シナプスの GluRIIA 受容体。Scale bar は 50μm。B, NC82 によって染色され た active zone。円は 1 つの bouton を示す。1 サンプルからランダムに 4 つの bouton を選択して puncta を数えた。Scale bar は 10μm。

HRP HRP

GluRIIA

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図 12. P 因子挿入による cenG1A 変異体における電気生理学的解析

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C, Quantal content の平均値のグラフを示す。二種の cenG1A 変異体(中央:20232、右:12957)は対照個体 (左:Yw)と比較して QC が有意に増大している (yw, n=11; 20232, n=9; 12957, n=7. *P<0.01, ANOVA)。Bars は平均値±標 準 誤 差 。

2, RNA 干 渉 法 に よ り 組 織 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体

cenG1A 遺 伝 子 の 変 異 体 に お け る 電 気 生 理 学 的 解 析 の 結 果 か ら 、 CenG1A が 神 経 筋 シ ナ プ ス 伝 達 機 構 に お い て 機 能 を も つ 可 能 性 が 高 い こ と が 示 唆 さ れ た 。 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 神 経 筋 シ ナ プ ス に お い て CenG1A は 、 シ ナ プ ス 前 、 後 細 胞 の 両 方 に 発 現 し て い る こ と が わ か っ て い る (Flybase, Fukui et al., 2012)。そ の た め 、シ ナ プ ス 前 細 胞 に 発 現 し て い る cenG1A 遺 伝 子 、 シ ナ プ ス 後 細 胞 に 発 現 し て い る cenG1A 遺 伝 子 そ れ ぞ れ の シ ナ プ ス 伝 達 に お け る 機 能 を 解 明 す る た め に 、 RNAi 干 渉 法 (RNAi 法 )を 用 い て cenG1A 遺 伝 子 の 発 現 を 組 織 特 異 的 に 抑 制 し た 個 体 で シ ナ プ ス 機 能 解 析 を 行 っ た 。組 織 特 異 的 に cenG1A 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 す る た め に Gal4-UAS system を 用 い 、 全 神 経 細 胞 で cenG1A 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 し た 個 体 (31811R-2(X)RNAi×elav-Gal4 (elav-CentRNAi))、全 筋 肉 細 胞 で cenG1A 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 し た 個 体 (31811R-2(X)RNAi×24B-Gal4 (24B-CentRNAi))、 そ れ ぞ れ に 対 す る 対 照 個 体 (31811R-2(X)RNAi×yw (CentRNAi) 、 31811R-2(X)RNAi×elav (elav) 、 31811R-2(X)RNAi×24B (24B))を 用 い 、 そ れ ぞ れ に つ い て 電 気 生 理 学 的 解 析 と 形 態 学 的 解 析 を 行 っ た 。

2-1, 組 織 特 異 的 に CenG1A発 現 を 抑 制 し た 個 体 の 電 気 生 理 学 的 解 析

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図13. 神経細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における電気生理学的解析

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図14. 筋肉細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における電気生理学的解析

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図15. 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における形態学的解析

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28 2-3, 組 織 特 異 的 に CenG1A発 現 を 抑 制 し た 個 体 に お け る 放 出 確 率 の 解 析 こ れ ま で の 結 果 か ら 、 神 経 細 胞 、 ま た は 筋 肉 細 胞 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 ど ち ら に お い て も 、 神 経 伝 達 物 質 放 出 量 の 増 加 が お き て い た が 、 シ ナ プ ス の 形 態 に は 影 響 が み ら れ な い こ と が わ か っ た 。 伝 達 物 質 放 出 量 が 増 加 す る 要 因 と し て 、 一 般 に 、 シ ナ プ ス サ イ ト 数 の 増 加 、 放 出 確 率 の 増 加 、 シ ナ プ ス 小 胞 数 の 増 加 な ど が 考 え ら れ る 。 上 述 の nc82 に よ る 抗 体 染 色 に お い て 、 active zone 数 に 差 異 が 見 ら れ な か っ た こ と か ら 、CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 で サ イ ト 数 が 変 化 し て い る 可 能 性 は 低 い 。 そ こ で 残 る 神 経 伝 達 物 質 放 出 量 増 加 の 要 因 で あ る 放 出 確 率 と シ ナ プ ス 小 胞 数 に つ い て 解 析 を お こ な う こ と に し た 。

ま ず 、 放 出 確 率 を 調 べ る た め に 、 Paired pulse stimulation (PPS)を 行 っ た 。 PPS に お い て 一 回 目 の 刺 激 に 対 す る 応 答 と 二 回 目 の 刺 激 に 対 す る 応 答 の 相 対 比 に よ り 算 出 さ れ る Paired pulse ratio (PPR)は Ca2 +_{依 存 的 な 放 出 確 率 の 指 標 と し て 用 い ら れ て}

29 間 隔 50, 100ms の 際 に は 、残 存 Ca2 +

量 の 違 い か ら 、こ の Ca2 +_{依 存 的 な 何 ら か の 要 因}

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図16. 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における放出確率

31 2-4, 組 織 特 異 的 に CenG1A発 現 を 抑 制 し た 個 体 に お け る シ ナ プ ス 小 胞 数 の 解 析 神 経 伝 達 物 質 放 出 量 増 加 の 要 因 の う ち 、PPS に よ り 放 出 確 率 が 増 加 し て い る 可 能 性 が 高 い 事 が 確 認 で き た 。 次 に 残 る 要 因 で あ る 、 シ ナ プ ス 小 胞 数 に つ い て 解 析 を お こ な っ た 。 シ ナ プ ス 小 胞 は RP と RRP の 2 つ の プ ー ル に わ け ら れ 、 リ サ イ ク リ ン グ さ れ て い る 。高 頻 度 刺 激 下 で は 、RRP の シ ナ プ ス 小 胞 と 、RPR か ら RP へ と 移 行 し た シ ナ プ ス 小 胞 が 放 出 さ れ る 。RRP と RP の シ ナ プ ス 小 胞 を 放 出 さ せ る た め に 50Hz の 高 頻 度 刺 激 を 行 い 、 応 答 を 測 定 す る こ と で 、 放 出 可 能 シ ナ プ ス 数 に つ い て 解 析 を お こ な っ た 。図 17A の よ う に 50Hz の 刺 激 を 30sec 行 う と 、EJP amplitude が 徐 々 に 減 衰 し て く る 。 こ の 減 衰 は シ ナ プ ス 小 胞 の 枯 渇 を 示 し て い る 。 シ ナ プ ス 小 胞 数 の 増 加 、 ま た は リ サ イ ク リ ン グ 速 度 の 増 加 、 あ る い は こ の 両 方 が お き て い る 個 体 で は 、 こ の 減 衰 度 合 が 弱 く 、 こ れ ら が 減 少 し て い る 個 体 で は 、 減 衰 度 合 が 強 い こ と が 予 想 で き る 。そ こ で 実 験 で は 、刺 激 開 始 時 に 得 ら れ た 最 大 の EJP amplitude か ら 、30sec 後 刺 激 終 了 時 の EJP amplitude が ど れ だ け 減 衰 し た か 、そ の 減 衰 度 合 を % で 算 出 し 、 放 出 可 能 シ ナ プ ス 小 胞 数 の 指 標 と し て 使 用 し た 。

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図17. 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体におけるシナプス小胞数の解析

33 IV, 考 察

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細 胞 で CenG1A を 抑 制 す る こ と に よ っ て 、 高 頻 度 刺 激 に よ る EJP の 減 衰 が 抑 制 さ れ 、放 出 可 能 シ ナ プ ス 小 胞 数 が 増 加 し て い る 可 能 性 が 高 い と い う 結 果 が 得 ら れ た 。 こ の 結 果 か ら 、CenG1A が シ ナ プ ス 小 胞 リ サ イ ク リ ン グ に 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。

ま た 、elav-CentRNAi で は mEJP amplitude が 対 照 個 体 と 比 較 し て 減 少 し て い る こ と が わ か っ た 。mEJP の 減 少 は 、シ ナ プ ス 後 細 胞 の 感 受 性 、ま た は シ ナ プ ス 小 胞 サ イ ズ の 減 少 に 起 因 す る と 考 え ら れ る が 、 シ ナ プ ス 後 細 胞 の GluRIIA 量 に は 変 化 が み ら れ な か っ た 。そ の た め 、こ の 個 体 で み ら れ た mEJP の 減 少 は 、シ ナ プ ス 後 細 胞 の 感 受 性 の 変 化 に よ る も の で は な く 、 シ ナ プ ス 小 胞 サ イ ズ の 減 少 、 つ ま り シ ナ プ ス 小 胞 内 に 充 填 さ れ て い る 神 経 伝 達 物 質 量 の 減 少 に よ る も の だ と 考 え ら れ る 。 こ の 1 つ の 小 胞 内 の 神 経 伝 達 物 質 量 の 減 少 は CenG1A の 抑 制 に よ り 、 リ サ イ ク リ ン グ が 活 発 に な る こ と に よ っ て 、 充 分 な 量 の 神 経 伝 達 物 質 が 充 填 さ れ ず 、 未 成 熟 な シ ナ プ ス 小 胞 が 放 出 さ れ て い る た め に 生 じ た 可 能 性 が 考 え ら れ る 。

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2, 筋 肉 細 胞 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体

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図18. 組 織 特 異 的 に CenG1A を 抑 制 し た 個 体 に お け る 結 果 の ま と め

左 図 , シ ナ プ ス 前 細 胞 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 で は 、放 出 確 率 の 増 加 と シ ナ プ ス 小 胞 数 の 増 加 が 生 じ て い る 可 能 性 が 高 い 。 右 図 , シ ナ プ ス 後 細 胞 特 異 的 に CenG1A 発 現 を 抑 制 し た 個 体 で は 、 放 出 確 率 の 増 加 が 生 じ て い る 可 能 性 が 高 い 。

3, negative regulator と し て の CenG1A 機 能

37 図19. CenG1A 機能モデル

39 VI, 引 用 文 献

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