低酸素

金 沢 大 学 十 全 医 学 会 雑 誌 第

1 0 8

巻 第

2

号

2 3 3

^‑

24 0

(

1 9 9 9

)

低酸素

状

態

^におけ^{る ヒ ト}

非

小 細

胞肺痛

細胞

株

^の

シス プラチ ^ン

感受

性^の

検討

金 沢 大 学 医 学 部 医学 科 内 科 学 第

三

講 座 ( 主 任^:松

田

保 教授)

岩 佐 桂

2 3 3

シ

ス

プ ラ チ

^ン(

c i s

^‑

d i a m m i n e d i c hl o r o

p

l a

t

i n u m

(

Ⅱ

),

C D D P

)

^は

^, 非 小 細 胞肺 癌^の化 学療 法

に お

^い

て

最 も 重 要 な抗 癌 薬

^で

あ

る

.

し か し

その治療 成績

^は

十 分

で は

なく,

そ

^の原 因^{の 一}

つ に

薬 剤 耐 性

が

考 え

ら

れ

る

^. 本研 究

で は

, ヒ

ト

非 小 細 胞肺癌培 養 細 胞 株 を用^い, 酸 素 状 態^の差 異

に お

け

る

薬 剤 感 受 性

と そ

の規 定 因 子

^{に つ}

^い

^て

検 討

^{し た}

^. 肺 癌 細 胞株

^{と し て}

, 腺 病 由 来^の

^{P C}

^‑

^{9 と} R E R F

^‑

L C

^‑

M S

, 扁 平

上

皮 痛 由来^の

E B C

^‑

1

を用^い検 討

し た と

こ

ろ

,

C D D P

感受性

は 正

常 酸 素 状 態

に

比^べ

て

低 酸 素 状態

に お

^い

て

有 意

に

低

下 し た

^.

C D D P

^の誘 導 体

^で

あ

^{る カ}

^ル

^{ボ プ ラ チ}

^ン(

^{c i s}

^r

^{di a m m i n e c}

y

c l o b u

t

a n e di c a r b o x yl ^a

^t

^e

p

l a

t

i n u m

(

^Ⅱ

))

^に

対 す

る

感 受 性 も,

正

常 酸 素 状 態

に

比^べ

て

低 酸 素状 態

に お

^い

て

有 意

に

低

下 し た

^. 低 酸 素 状 態

に お

^い

て

薬 剤 感 受性

が

低

下 し た

機 序 を検討 す

^る

目 的

^で

,

R E R F

^‑

L C

^‑

M S と E B C

^‑

1

を用^い

^て

細 胞 内

^{プ ラ チ ナ}

蓄 積 量

^を

測 定

し た

.

R E R F

^‑

L C

^‑

M S

^の細胞 内

プ ラ チ ナ

蓄 積 量

は

, 正常 酸素 状 態

に

比 較

し て

低 酸 素 状 態

に お

^い

て

,

C D D P

曝露 濃 度

5 0

_FL

M で は 4 0

^.

4 %

,

C D D P

曝 露 濃 度

^{1 0 0}

F^L

M で は 4 0

.

8 % に そ れ

ぞ

れ

有 意

^に

低

下 し た

^. 同 様

^{に E B C}

^‑

¹

^の細 胞 内

プ ラ チ ナ

蓄積 量

は

,

正

常 酸 素状 態

に

比 較

し て

低 酸 素 状 態

に お

^い

て

,

C D D P

曝 露 濃 度

5 0

_FE

M で は 3 8

^.

4 %

,

C D D P

曝 露 濃 度

10 0

_〃

M で は 3 5

^.

9 % に

, そ

れ ぞ れ

有 意

^に

低

下 し た

^.

さ ら に

, 細 胞 内 プ

^{ラ チ ナ}

蓄積 量

^を

規 定 す

る と

考 え

ら れ る

細 胞 膜

ナ ト リ ウ

^ムイ

オ

^{ン ･}

カ リ ウ

^ム

イ オ

ン ^･

ア デ

ノ

シ

ン

ト

^T

) ホ

ス フ

ァ タ

^ー

ゼ

(

N a

+

,

K :

｢

ÅT P a s e

) 活 性 を

⁸⁶ R b

流 入 率 を 指 標

と し て

測 定

し た と

^こ

ろ

,

R E R F

^‑

L C

^‑

M S に お

い

て 正

常 酸 素 状 態

^{で は 0}

^.

^{5 1}

^土

⁰

^.

^{1 2 n}

g/

^m g

蛋白/ 分, 低 酸 素 状 態

で は 0

^.

2 7 士 0

.

0 8 n g

/

m

g 蛋白/ 軋

E B C

^‑

1 に お

い

て 正

常 酸 素 状 態

で は 0

^.

2 6

^±

0

^.

0 4 n g

/

m

g 蛋白/ 分, 低 酸 素状 態

^{で は 0}

^･

^{1 3}

^±

⁰

^･

^{0 6 n}

g/

^m

g 蛋 白/ 分

で

あ り, 細 胞 膜

^{N a}

^十,

K

^+‑

A T P a s e

活 性

^は

低 酸 素 状 態

^{に お}

^い

^て

有 意

^に

低

下 し た

. ヒト 非小 細 胞肺 癌 細 胞

で は

低酸素 状 態

に お

^い

て C D D P

感 受 性

は

有 意

に

低 く,

こ

の原 因

と し て

低 酸 素 状 態

下

^の

N a

+

,

K

^+r

A T P a s e

活 性^の低

下 に よ る

細 胞 内 プ

^{ラ チ ナ}

蓄積 量 低

^{下 が}

関 与

^して

^い

^{る こ と が}

示

^{さ れ た}

^. 非 小 細 胞 肺 癌

で は

腫 瘍 内部

が

低 酸 素 状 態

に

陥り, こ

れ に よ っ て

抗 癌 薬感 受性

が

低

下 し て

^い

る

こ

と が

示 唆

さ れ た

^.

鮎

_y

w o rds n o n^‑S m allc ell lu n

g

^{c an C e r},Cis^‑di^{a m m}in edichlo r o

p

latin u m (^II),h

y p

^{o x}ic c o ndi

t

io n, dru

g

r e sis

t

an C e

, Na^'_,K ^'rA T Pa s e

近 年, 本 邦

に お

い

て

肺 癌

は

胃 痛 を 抜い て男 性^の悪 性 腫 瘍

^{に よ} る 死

亡 原 因^の第^一 位

と な っ た

¹

⁾

. 中

^で

も非 小 細 胞 肺 癌

^は

肺 癌^の

8 0 % か ら 9 0 % を

占

^{め て お}

り,

そ

^の

6 0 % 以 上 は

外 科 的切 除 不 能^の 状 態

^で

発 見

さ れ る

²

⁾

^. 手術 適 応

と

な

ら な ^い

進行 肺 癌 症 例

^に

対

し て は

, 抗 癌 薬

に よ る

化 学 療 法

や

放 射 線 治 療 あ

^る

^い

^は

両 者^の併 用

に よ る

治 療

^が

施 行

^{さ れ て}

^い

^る

^.

^シ

^ス

^{プ ラ チ}

^ン (

^{c i s}

^‑

di a m m i n e d i c h l o r o

p

l a

t

i n u m

(

Ⅱ

),

C D D P

)

は

非小 細胞肺 癌 治療^の中 心

と な る

抗癌 薬

で

あ り³

⁾

, 今

日

広 く 臨床

^に

用^い

^{ら れ て}

^い

^る

^. ま

た カ

^ル

ボ プ ラ チ

ン(

^{c i s d i 血 Il e C}

y

C l o b u

t

a n e di c a r b o x

y

l a

t

e

p

l a

t

i n u m

(

II

),

C B D C A

)

は C D D P と

同

じ

く

プ ラ チ ナ

系 抗 癌 薬

で

あ

る

^.

C B D C A

の小 細 胞 肺 癌

に

対 す

^る

奏 効 率

^は

高^い

^が

, 非 小 細 胞 肺 癌

に

対 す

^る

奏 効 率

は C D D P と

比^べ

て

低^い.

し か し C B D C A は C D D P と

比^べ

て

腎毒 性

が

少 なく, ま

た

奏 効 率

が

低^い

に

も

か か わ ら

ず

生

存 期 間

が C D D P と

変

わ ら

な^い

^{4 ) こ と か ら}

, 近 年 非小 細 胞

肺 癌 化 学 療 法

^に

用

^{い ら れ て}

き

て い る

.

し か し

, こ

れ ら

^の抗癌 薬 を 含

む

多 剤 併 用 化 学療 法

^を

行^っ

て

も 非小 細 胞 肺 癌

^に

対 す

る

治 療

成績

は

未

だ に

満 足^{の い}く も^の

と は ^い

え

な

^い.

痛 化 学療 法^の効 果

^が

不 十 分

^で

あ

る

原 因

と し て

薬 剤 耐性

が

挙 げ

ら れ る

. 薬 剤耐 性^の解 明

と そ

^の克 服

が

, 抗 癌 薬

に よ る

癌 化 学療 法^の治 療 成 績 向

上 に

重 要

で

あ

^{る と}

考 え

ら れ る

^.

C D D P に

対 す

^る

癌 細 胞^の薬 剤 耐性^の機 構

^{と し て}

, 細 胞 内 蓄 積 機 構⁵

⁾

^､7

^〕

, 細 胞 内 解 毒 機 構

⁸⁾

へ1 1

)

,

D N A

障 害 修 復 機 構

⁵⁾

^{1 2}

^{卜 川} な ど が

報告

さ れ

て い

る

^. 細 胞 内 蓄積 機 構

に ^つ

^い

て は

細 胞 膜

ナ ト リ ウ

^ム

イ オ

^{ン ･}

カ リ ウ

^ム

イ オ

^{ン ･}

ア デ

ノ

シ

ン

ト リ ホ

ス フ

ァ タ

^M

ゼ

(

^{N a}

^十,

K

^+‑

A T P a s e

) を 介 す

^る

能 動 輸 送^の低

下 ^仰 が

報 告

さ れ て

い

る

^. 細 胞 内解 毒 機 構

に ^つ

^い

て は

, 耐 性 細 胞

に お

^い

て グ

^ル

タ チ オ

ン(g

l u

t

a

t

h i o n e

,

G S H

)⁸

⁾

,

グ

)L^/

タ チ オ

ン^ー

S

^pト

ラ

ン ス フ ^エ

ラ

^ー

ゼ

(

g l ^u

^t

^a

^t

h i o n e

^‑

S

^‑ t

r a n s f e r a s e

)

¹⁰⁾

^{, メ}

^{タ ロ チ オ}

ネ

イ

^ン (

m e

t

a ll o

t

h i o n e i n

)^{1 1}

⁾ が

増 加 す

平 成^{1 1}年¹ 月^{1 9} 日受付^, 平 成^{1 1}年3 月4^･日受理

A b br e via

t

io n s

:

C B D CA ^{cis‑dia m mi n e c}

y

dob11

t

a n edic a lbo xy^la

^t

^e

p

lati^{n u m} (^Ⅱ)

^;

^{C D D P, Cis‑dia mi n edi 血lo r o}

^p

^{latin u m} (^Ⅱ)

;

D M S O, dim e

t

h

_y

ls ulfo xide

;

F B S_,fe

t

al bo vin e s e r u m

;

G S H ,

g

lu

t

a

t

h io n e

;

H E P E S, 2^‑(^4‑(^2‑H

y

dr o

x y

^e

t

h

_y

l)^‑1‑

2 3 4

る と

報 告

さ れ て お

り, こ

れ ら

^の関与

が

指摘

さ れ て

^い

る

.

D N A

障害修 復 機 構

に ^つ

^い

て は

,

C D D P に よ

り 誘 導

さ れ る D N A

障 害 を 認 識 す

^{る M S H 2}

蛋 白^の減 少

が

,

C D D P

耐 性 を 誘 導 す

る と

報 告

さ れ て ^い る

¹

^{3) 1}

⁴

⁾

ま

た

, 肺 癌 を 含

^む

多 く^の腫 瘍

は

固 形 腫瘍

で

あ り,

そ

の内部

は

低 酸 素 状 態

に

あ

る と

報 告

さ れ て

^い

る

^{1 5}

⁾

^{､2 0}

⁾

. こう

^{し た}

低 酸 素 状 態

に お

^い

て は

癌 細 胞^の抗 癌 薬

や

放 射 線

に

対 す

る

感 受 性

が

低

下

す

る と

推 定 さ

^{れ て}

^い

^る

¹

7) 19)2 1)2

2

) が

,

そ

の機 序 な

^ど

詳 細

は

不 明

で

あ

る

.

さ ら に

, ヒ

ト

非 小 細 胞 肺 癌 株

に お

け

^る

低 酸 素 状 態

^で

^の

C D D P

感 受 性

^に

^{つ い}

^て

^の報告

は な

^い.

以 上

の知 見を 踏 ま え, 本 研 究

で は 正

常 酸 素 状 態

^と

低 酸 素 状 態

に お

け

る

^ヒ

ト

非 小 細 胞 肺 癌 株^の プ

ラ チ ナ

系 抗 痛 薬 感 受 性,

お よ び そ れ ぞ れ

^の酸 素 状 態

^{に お}

け

^る

抗癌 薬 感 受 性 規 定 因 子

^{に つ}

^い

^て 比

較 検 討

し た

,

材 料

^{お よ}

び方 法

Ⅰ

. 試薬

R P M I 1 6 4 0

,

リ

^ン酸横 衝 液 b

^{h o s}

p

h a

t

e

^‑

b u ff e r e d s a li n e

,

P B S

) (

p H 7

.

4

)

^{お よ び ペ ニ シ リ}

^{ン ･ ス}

^ト

^レプ

ト マ イ シ

ン混 合 液 (

1 0

,

0 00

単位 /

^{m l}

)

^{は ニ ッ}

^スイ 薬 品

^工

業 ( 束 京)

^よ

り 購

^{入 し た}

^. 牛 胎 児 血 清 晩^t

a l b o v i n e s e r u m

,

F B S

)

は 三

光 純 薬 (東 京)

よ

り 購

^入 し た

^.

C D D P お よ

び

C B D C A は ブ リ

ス

ト

ル ^･

マ イ ヤ

^ー

ズ

ス

ク

イ

ブ

株 式 会 社 (東 京)

よ

り 供 与

^を

受 け

た

^.

ジ メ チ

ル ス ル フ ォ

キ シ ド

(

^{di m e t h}

y

l s u l f o x i d e

,

D M S O

)

^{と 2}

^‑[

⁴

^一路

^ハ

イ ド^ロ

キ シ ュ チ

ル)

‑

1

^パ イ^{パ ー}

ア ジ ^ニ

^ル1

^エ タ

ン ス ル フ ォ ン酸 (

²

^一[

4

^‑(

²

^‑

b y d ^{r o x} y

e

t

h y l

)^‑

^l

^‑p

i

p

e r a z i n y l

]

^e

^t

^{h a n e s u lf o n i c a c i d}

,

H E P E S

)

^は

和 光 純 菜 ( 大 阪)

か ら

,

3

^‑(

⁴

,

5

^‑

ジ

メ

チ

ル

チ ア ゾ

^ー ル^ー

2 イ

ル)^‑

²

ふ

^ジ

^フェ

^ニ

^ル

テ ト ラ ゾ リ ウ

^ム

ブ

ロ マイ

ド

(

3

^‑(

4

,

5

^‑

di m e

t

h

y

l

t

h i a z o l

^‑

2

_y

l

)^‑

2

,

ふ di

_p

h e n

y

l

t

e

t

r a z o li u m b r o m i d e

,

M T T

)

と S D S は Sig ^{m a} C h e m i c a l

(

S

t.

L o u i s

,

U S A

)

よ

り 購

入 し た

^.

⁸

⁶

R b Cl と

液 体

シ

^ン

ナ ラ

^ント

仏

^{C S I}

D

^{は ア マ シ}

^{ャ ム ･}

^ジ

^{ャ パ ン}(束 京)

^よ

り 購

入 し た

.

Ⅰ

^. 細 胞 株

と

そ

の

培 養

ヒト 非小 細 胞 肺 癌 由 来^の培 養 細 胞 株

で

あ

る P C

^‑

9

( 肺 腺 痛 由 来)^,

R E R F L C

^‑

M S

(肺 腺 癌 由来)

お よ び E B C

^‑

1

(肺 扇 平

上

皮 痛 由 来)

^を

用^い

た

^.

P C

^‑

9 は

東京 医 科 大学 早

田

義 博 博 士

ら に よ

^っ

て

肺 腺 痛^の患 者

^{か ら}

樹 立

^さ

れ

た

細 胞 株

^で

, 同研 究 主

^よ

り 供 与 を 受 け

た

^. ま

た R E R F

^‑

L C

^‑

M S と E B C

^‑

1

の各 細 胞 株

は

,

理

化 学 研 究 所 細 胞 ^･ 遺伝 子 保 存 施 設 細 胞 銀 行 (

^つ

く

Ⅰ

の

^よ

り 購

^{入 し た}

^. 細 胞

^は 1 0 % F B S と 1 %

^ペ

^ニ シ リ

ン ^･ ス

ト レ プ ト ^マ イ シ

^ン混 合 液

を

加 え

た R P M I1 6 40

培 養 液

^を

用^い

て

,

5 % C O ₂

濃 度,

3 7

℃の条 件

^{下 に}

培 養

し た

^.

肌 抗 癌薬 感 受性 試 験

抗 癌 薬 感 受 性

^は

,

M o s m a n n ら ²

³

⁾ の

方法

^に

準

^{じ た B a n d o ら}

^{2 4}

^卜

26 )

の変 法

に

従^っ

て

, 細 胞 増 殖 阻害 試 験

に よ

っ

て

評価

し た

^. す

な わ

ち, 各細 胞 株 を 前 述^の培 養 液

^に

浮 遊

し

,

2

.

0

×

1 0

⁴個/

^{m l と な} る よ

う

に

調 整

し た

^.

P C

^‑

9 に ^つ

^い

て は 9 6

穴

Ⅴ

底マ ル

チ プ

レ ^ー

ト

(

^{C o s}

^t

^{e r}

,

C a m b r id

g

e

,

U S A

) を,

R E R F

^‑

L C

^‑

M S と E B C

^‑

1 に つ

い

て ほ 9 6

穴 平底

^マ

^ル

チ

プ

^レ

^ー ト (

^{F a l c o n N o}

^.

^{3 07 2}

,

B e c

t

o n D i c ki n s o n a n d C o

.,

L i n c o l n P a r k

,

U S A

) を用^い, 各

ウ ェ

ル

に

浮 遊 細 胞 数

が 2

,

0 0 0

個 ず

^{つ と な る よ}

う

^に

蒔 き ^一晩 培 養

^{し た}

^. 低 酸 素 状 態

^は

,

グ ロ

^ー

ブ ボ ッ ク

ス

に 9 5 %

窒 素

と 5 % 二

酸化 炭 素^の混 合

ガ

ス

を

潅 流

佐

し て

作 成

し た

. 低 酸 素 群

は

抗 癌 薬 曝 露 前

に 4

時 間

グ ロ

^ー

ブ ボ ッ

ク

ス内

^に

静 置

し た

^.

C D D P は 3

,

1 0

,

3 0

,

1 0 0

,

3 0 0

_iL

M

の各濃 度

と な る よ

う

に

, ま

た C B D C A は 0

^.

1

,

0

^.

3

,

1

,

3

,

1 0 m M

の各 濃 度

^{と な る よ}

う

^に

加 え, 薬 剤 曝 露 時 間

^{を 2}

時 間

^{と し た}

^. 薬 剤 曝 露 終 了 ま

で

低 酸 素 群^の操 作

は グ

^{ロ ー}

ブ ボ ッ ク

ス内

に て

行^っ

た

^.

そ

^の後,

プ

^レー

ト を 1

,

5 0 0

回 転

⁵

分 間 遠心

し

, 培 養 液

^{で 2}

回洗 浄

し た

^.

P C l =

^こ

^つ

^い

て は

, 培 養 及

び

吸 光 度 測 定 を 容 易

^に

す

る た め

,

さ ら に

細 胞 浮 遊 液^の半 分 を

9 6

穴 平底

マ

ル

チ プ

^{レ ー}

ト に

移

し た

.

9 6

時 間 培 養 後,

P B S に

溶 解

し た 5 m

g/

m l M T T

溶 液 を 各

^ウ

^ェル

に 2 0

/^J

l

ず

つ

加 え,

3 7

℃

で 4

時 間培 養

し た

^.

そ

^の後,

1

_,

5 0 0

回転

で 5

分 間 遠 心

^{し て}

,

上

清 を 吸 引

^し

, 各

^ウ

^ェル

^{に 2 0 0}

/^∠

1

ず

^つ D M S O を

加 え

て

, 形 成

さ れ た ホ

ル

マ ザ

ン結 晶 を 溶 解

し た

^.

5

分 間 撹拝

^{し た}

後, 自動 吸 光 度 計

E A R 3 4 0 A T

(

^{S I X}

,

Vi e n n a

,

A u s

t

r i a

) を 用^い

^て

, 波 長

5 6 0 n m に お

け

る

吸 光 度 を 波 長

6 6 0 n m に お

け

る

値 を 対 照

^{と し て}

測 定

し た

. 得

ら れ た

吸 光 度

か ら

細 胞 生 存 曲線 を 描 き, 幾何 学 的

に 5 0 %

増 殖 阻 害 濃 度 (

^{i n h ibi}

^t

^{i o n o f c e 11}

g

r o w i h b

y

5 0

‰

^{I C}

^{5 ｡})

^を

求

め て

薬 剤 感 受 性^の指 標

と し た

. 感受性 試 験

は

全

て 3

回 以

上

行

^{っ た}

^.

Ⅳ

. 細 胞 内 プ

ラ チ ナ

蓄 積 量

の

定 量

R E R F

^‑

L C

^‑

M S と E B C

^‑

1 に つ

い

て

, 細 胞 内 プ

ラ チ ナ

蓄 積 量 を 測 定

し た

^. 対 数 増 殖 期

に

あ

る

各細 胞 株 を

1

^.

0

×

1 0

⁷個/

m l に

調 整

し

,

組 織 培 養

^皿

(

^{F a l c o n N o}

^.

^{3 0 2 5}

,

B e c

t

o n D i c ki n s o n a n d C o

.)

^{に 2 5}

m l

ず

^つ

注 入

し て 2 4

時 間培 養

し た

^.

上

浦 を 交 換

し た

後, 低 酸 素 群

に つ

い

て は

前 述^の

^{ご と}

く 抗 癌 薬 曝 露前

^{に 4}

時 間低 酸 素 状 態

に

静 置

^{し た}

^.

^{5 0}

F^L

M

あ

る

^い

は 1 0 0

_F^L

M と な る よ

う

に C D D P

を 添 加

し て 2

時 間 培 養

し た

後, 水 冷

し た P B S に て 2

回 洗 浄

し た

^{. こ}

れ ら

^の細 胞 を 回 収

し て P B S に

浮 遊

し

, 超 音 波 破 砕 装 置

^B r a n s o n s o n i 鮎 r 2 5 0

(

^{B r a n S O n}

,

D a n b u r

y,

U S A

) を 用^い

て

破 砕

し た

^. 各 検 体^の

プ ラ チ ナ

濃 度 を 原 子吸 光 法 を 用^い

^て

測 定

^{し た}

^.

Ⅴ

^. 細胞 膜

N a

+

,

E

⁺

d 工P a s e

活 性

の

定 量

R o z e n

g

^{u r}

t

ら

^{2 7}

⁾

の方 法

^{と O h m o r i ら}

⁷

⁾

^の方 法

に

準

じ

, 単 位 時 間 あ

た

りの

⁸⁶ R b C l

の細 胞 内 流

^入

量

を

指 標

と し て

, 細 胞 膜

^{N a}

⁺,

K

^+‑

A T P a s e

活 性 を 定 量

^{し た}

^.

^{R E R トL C}

^‑

M S と E B C

^‑

1 に つ

い て各細

胞 株 を

1

^.

5

^×

1 0 ⁶

個/

m l に

調 整

し

,

H E P E S

綬 衝 液 (p

H 7

.

4

) (

^{1 0 m M ブ ド ウ}

糖,

5 m M K C l

,

1 m M M

_g

C l

2,

1 m M C a C 1 2

,

1 0 m M H E P E S

,

1 2 3 m M N a Cl

)

^に

浮 遊

^{し た}

^{. バ}

^{イ ア}

^ル瓶

^V

^‑

^{3 0}

(木 村科 学 器 械^, 金 沢)

に

細 胞 浮 遊 液 を 注

入 し

,

正

常 酸 素状 態,

あ

^{る い は}

低 酸 素 状 態

^{下 に 4}

時 間 静 置

^{し た}

後 密 閉

^{し た}

^{. 8 6}

^{R b C 1} 1 m C i

/

m l

を 加 え

^{て 2}

,

5

,

1 0

分

に

細 胞 浮 遊 液 を 回 収

し

,

1

,

5 0 0

回 転

⁵

分 間遠 心

^し

,

P B S で 2

回洗 浄

し た

.

5 % S D S を

添 加

し て 可

溶 化

し た

各検 体 を

A C SII に

て溶解

し

,

そ

^の放 射 活 性 を

^シ

^ン

^チ

^{レ ー}

シ ョ

ン

カ ウ

^ン

タ

^ー

Ⅰ5 C 7 0 0

(^ア

^{ロ カ}

^, 東 京) を 用^い

^て

測 定

し た

^.

3 7

℃

と 4

℃^の

^二

条 件

下 で

同 時

に

測 定

^を

行^い,

そ

^の流

^人

率^の差 を

も^っ

て

細 胞 膜

N a

⁺_,

K

⁺

功 T P a s e

活性

と し た

^.

Ⅶ

. 蛋 白 質 濃 度

^の

定 量

各検 体^の 蛋 白 質 濃 度

は

,

B C A

プ^ロ

テ イ

ン ア

ツ セ イ キ ッ ト

(

^{Pi e r c e}

,

R o c k f o r d

,

U S A

) を 用^い

^て

測 定

^{し た}

^.

Ⅶ^. 統 計 学 的 分 析

対 応の

な

^い

S

t

u d e n

t の t 検 定 を 用^い

て 2

群 間検 定 を 行^い, 危 険率

^{5 %}

未 満^の場 合 を 有 意 差 あ り

と

判 定

し た

^. 数値

^{は 富}

^士

^{S D で}

表 示

し た

.

pi

p

^{e r a z}iⁿ

_y

l) ^e

^t

^{h a n e s ulfo nic a cid}

^;

^{I C}

^{5 0}

^{,inh ib i}

^t

^{io n of c e}ll g^{r o w}

^t

h by ^{5 0 %}

^;

^{M T T, 3‑}(^{4,5‑d im eth}

y

l

_t

h ia z ol^‑2

_y

l)^‑2,5‑

di

p

he

h y

l

t

e

t

r aio血m･･b^{r o}mi de

;

^二P B S_,･

p

h o s

p

ha

t

e^岬b 曲 ^{r e}d^YSal in e

扇 之

≧

コ S

ポ

低 酸 素 状 態

に お

け

る

肺 癌 細 胞 株の

シ

^ス プ

ラ チ

^ン感 受 性

1 0

C D D P

(

L

J

M

)

1 0 0 1 0 0 0

T

a

b l

e

l.

S e n s

iti

v

i

t

i

e s o

f

n o n

^‑

S m a

ll c ell l

u n

g ^c

^a

ⁿ

^{c e}

^{rc e}l l l i

n e s t o

C

D D P

u n

d

e r

t h

e n o rr n o x

i

c o r

t h

e

h y p

^{o x}

i

_{c c o n}

d iti

o

n

I

C

5 ｡V

a

l

_{u e} (

F^L M

) C e

l1 1in e

N

o r m o x

i

_c

c

o

nd i

t

i

o

n H y p

^{o x}

i

c c o

nd i

t

io n

P C^‑9 2 9,2 ± 1 8.O^a) 9

5

.7 ± 3 4.8^{b l} R E R F‑^L

^C

^‑M

^S

^{3 3.3 ± 5.7 7 3.1 ± 4.4b )}

E B C‑^{1 6 7.6 ± 9.3 1 4 8.7 ± 4 1.Oh )}

I

C

_{5 0}V

a

l

u e

i

n

d

i c a

t

e s

d

r u

g

^{c o n c e}

ⁿ

^t

^{r a}

^t

i

o n t

h

a

t i

n

h i b i

t

s5 0

% o

f

c e

11 g

^{r o w t}

h.

a )

^E

^{a c}

^h

^{v a}

^l

^{u e}

ⁱ

^s 丈±

S D.

b

)

p

< 0

^.

0 5 c o

mp^{a r e}d

w

i

t

h

t

h

e n o r

m o xi

c c o n

d i

t

io n

a n a

l y

^{z e}

d b y t h

e u n

p

a

i

r e

d S t

u

d

e n t

^'

s t

^‑

t eS t

^･

成 績

Ⅰ

. 肺 癌 培 養 細 胞 株

の シ

^スプ

ラ チ ン

感 受性

M T T

法

に よ る

細 胞 増 殖 阻 害 試 験

^{に よ}

り 評 価

^{し た シ}

^ス

^{プ ラ チ}

ン感 受 性^の成 績 を 示 す^. 細 胞

生

存 率 曲 線 ( 図

1

)

か ら

求

め たI C

5 0

億 ( 表

¹

)

^は

^,

^{P C}

^‑

^{9 で は 正}

常 酸素 状 態

^{に お}

^い

^{て 2 9}

^･

²

^±

^{1 8}

^･

⁰

〃

M

,

低 酸 素 状 態

に お

^い

て 9 5

^.

7

±

3 4

^.

8

_FL

M

,

R E R F L C

^‑

M S で は 正

常 酸 素 状 態

^に

お^い

^{て 3 3}

^.

³

^±

⁵

^.

⁷

〃

M

, 低酸素 状 態

に お

^い

て 7 3

^･

1 士 4

^･

4

F^L

M

,

E B C

^‑

1 で は

正常 酸 素状 態

に お

^い

て 6 7

.

6

±

9

･

3

_FL

M

, 低 酸 素

0

2 3 5

0

1 0

1

0

0 1 0 0 0

C D D P(P M

)

F i

g^.

1

.

G r o w

t

h i n hibi

t

i o n c u r v e O f P C

^→

9

(朗,

R E R F

^‑

L C

^‑

M S

(

^B

),

a n d E B C

^‑

1

(

^C

)

^{c e ll li n e s b}

y

C D D P

.

S u r v i v i n

g

^{r a}

t

e s w e r e

d e

t

e r m i n e d b

y

M T r a s s a

y^.

P o i n

t

_s a n d b a r S i n di c a

t

e 豆

^■±

S D

^･

□,

C e ll s u n d e r

t

h e n o r m o x i c c o n di

t

i o n

; ●,

C e ll s u n d e r

t

h e

h

y p

o x i c c o n di

t

i o n

^.

状 態

^{に お}

^い

^{て 1 4 8}

^.

⁷

^±

^{4 1}

^.

⁰

〃

M で

あ^っ

^た

^{. い}ず

れ

の非 小 細 胞 肺 癌 株^の

I C

5 ｡借 も, 低 酸 素状 態

に お

い て有 意

に

高 値

と

な^っ

た

^. す

な わ ち

,

C D D P

感 受 性

^は

低 酸 素状 態

^{に お}

^い

^て

有 意

に

低

下 し た

.

C D D P と

同

じ プ ラ チ ナ

系抗 癌 薬

で あ る C B D C A に ^{つ い}

^ても,

細 胞

^生

存 率曲 線 掴

²

) を描 き,

I C

5 .)値

を

求

め た

( 表

2

)^.

^{P C}

^‑

^{9 で} は 正

常 酸 素 状 態

に お ^い

て

0

^.5

6

^±

0

.

0 9 m M

, 低 酸 素状 態

^{に お い}

^て

1

.1

7

±

0

.

2 3 m M

,

R E R F

^‑

L C

^‑

M S で は 正

常 酸 素 状 態

に お ^い て O A 6

±

0

^.

1 1 m M

, 低 酸 素 状 態

^{に お}

^{い て}

⁰

^.

^{7 2}

^±

⁰

^.

^{1 1 m M}

,

E B C

^,1

で は 正

常 酸 素状 態

に お

い

て 0

^.

7 6

±

0

^.

1 6 m M

, 低 酸 素 状 態

に お

^い

て 1

^.

4 9

^±

0

.

6 3 m M

で

あ り

,

C B D C A

の感 受 性 も 低 酸 素状 態

^{に お}

^い

て

有 意

に

低

下 し た

^.

¶

. 細 胞 内 プ

^{ラ チ ナ}

蓄積 量

R E R F

^‑

L C

^‑

M S と E B C

^‑

1 に ^{つ い} て

, 細 胞 内

^{プ ラ チ ナ}

蓄 積 量 を 測 定

^{し た}

結 果

^を

示 す ( 図

3

,

4

)^.

^{R E R F}

^‑

^{L C}

^‑

^{M S で は}

^,

^{C D D P}

曝 露 濃 度

5 0

_/1

M に お

^い

て _I E

常 酸 素 状 態

^{が 10 5}

^･

⁷

^±

^{1 5}

^･

^{O n}

g/

^m

g 蛋白, 低 酸 素 状 態

が 4 2

^.

7

±

4

^.

9 n

g/

m

g 蛋 白,

C D D P

曝 露 濃 度

1 0 0

_FL

M に お

^{い て}

正

常 酸 素 状 態

^{が 2 3 8}

^.

⁹

^±

⁵

^.

^{1 n}

g/

^m

g 蛋乱 ^{低 酸 素 状 態}

^が

9 7

^.

4

±

1 4

^.

8 n

g/

m

g 蛋白

で

あ^っ

た

^.

E B C

^‑

1

^で

は

,

C D D P

曝露 濃度

5 0

_〃

M に お

^い

て 正

常 酸 素 状 態

^{が 3 8}

^･

^{5 ± 8}

^･

^{4 n}

g/

m

g 蛋 白, 低 酸素 状 態

が 1 4

^.

8

^±

5

^.

4 n g

/

m

g 蛋白,

C D D P

曝 露 膿 度

^{1 0 0}

F^L

M に お

^い

て 正

常 酸 素 状 態

が 1 0 0

.

7 ± 1 3

^.

6 n

g/

m

g 蛋 白, 低 酸 素 状 態

が

3 6

^.

2 ± 5

^.

3 n

g/

m

g 蛋 白

^で

あ

^{っ た}

^. す

^{な わ}

ち,

C D D P

曝 露膿 度

^が

5 0

〃

M

,

1 0 0

_〟

M

の いず

れ

の場 合

に お

^い

て

も,

プ ラ チ ナ

蓄 積量