学 位 論 文 題 名

博 士 （ 医 学 ） 細 井 勇 人

学 位 論 文 題 名

    VLA ・ 4 ，またはVLA ・ 5 を介した刺激を加えた 癌特異的CD8 陽性T 細胞による輸注療法に関する研究

学位論文内容の要旨

【 背 景 と 目 的 】

  癌 特 異 的T細 胞 輸 注 療 法 は 、 癌 特 異 的 なT細 胞 を 癌 患 者 よ り 採 取 ・ 分 離 し た り 、 あ る い は 癌 細 胞 を 特 異 的 に 認 識 す る レ セ プ タ ー 遺 伝 子 を 患 者 の ポ リ ク ロ ー ナ ル なT細 胞 に 導 入 し 、 こ れ ら のT細 胞 を 体 外 で 増 殖 ・ 活 性 化 さ せ た 後 に 患 者 に 輸 注 す る 治 療 法 で あ り 、 新 規 癌 治 療 法 と し て 期 待 さ れ 、 そ の 有 効 性 が 研 究 され て い る 。 米 国 国立 研 究 所 の グ ル ー プ は 、 進 行 期 悪 性 黒 色 腫 患 者 を 対 象 と し て 、 輸 注 細 胞 の 増 殖 を 促 す 為 に 患 者 を化 学 療 法 剤 と 放 射線 照 射 に て 前 処 置 を し た 後 に 癌 浸 潤 リ ン パ 球 の 輸 注 療 法 を 行 う 臨 床 試 験を 行 い 、RECIST基 準 で52 ‑‑72％ と いう 高 い 有 効 率 を 報 告 し て い る 。 当 研 究 室 は 、 多 く の 癌 種 に 腫 瘍 特 異 的T細 胞 輸 注 療 法 を 可 能 と す る ー っ の 方 法 と し て 、 腫 瘍 抗 原 Melanoma associated antigen―A4（ 以 下MAGE−A4)を 特 異 的 に 認 識 す るT細 胞 レ セ プ タ ー （ 以 下TCR)遺 伝 子を 、 レ ト ロ ウ イ ル ス を 用 い て が ん 患 者 リ ン パ 球 に 体 外 で 導 人 し た 後 に 輸 注 す る 、 遺 伝 子 改 変T細 胞 輸 注 療 法 の開 発 を 行 つ て い る 。

  癌 特 異 的T細 胞 輸 注 療 法 は 、 担 癌 宿 主 に お け る 免 疫 抑 制 環 境 下 で の エ フ ェ ク タ ー 細 胞 誘 導 の 困 難さ や 、 抗 腫 瘍 性 エ フ ェ ク タ ー 細 胞 数 が 腫 瘍 細 胞 数 に 比 し て 少 な い と い う 癌 免 疫 療 法 全 般 に お い て 頻 繁に 障 害 と な る い くっ か の 問 題 の 解 決 法 と な り 得 る と 期 待 さ れ る 。 し か し 一 方 で 、 体 外 で 刺 激 し 拡 大 培 養 し たT細 胞 は 、 輸 注 後 の 生 存、 及 び 抗 腫 瘍 効 果 が 不 十 分 と 成 り 易 い こ と が 知 ら れ る 。 し た が っ て 、 こ れ ら の 問 題 を 解 決 し 、 有 効 性 を 示 すT細 胞を 体 外 で 調 整 す る 技 術 の 開 発 は 今 後 の 重 要 な 課 題 で あ る 。 本 研 究 で はT細 胞 と 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス と の 相 互 作 用 に関 わ り 、 細 胞 骨 格 や 細 胞 内 キ ナ ー ゼ を 活 性 化 す る こ と が 知 ら れ る イ ン テグ リ ン を 介 し た シグ ナ ′ レ がT細 胞 の 増 殖 、生 存 、 エ フ ェ ク タ ー 機 能 等 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し 、 イ ン テ グ リ ン を 介 し た 刺 激 を 用 い たT細 胞 の 調 整 法 を 効 果 的 な 癌 特 異 的T 細 胞 輸 注 療 法 の 開 発 に 応 用 す る こ と を 検 討 し た 。

  【対 象と 方法】

  同 意 を 得 た 健 常 人 由 来 の 末 梢 血 単 核 球 （ 以 下PBMC)、 及 びBALB/cマ ウ ス 脾 臓 由 来 リ ン パ 球 を 用 い た 。 ヒ 卜 フ イ ブ ロ ネ ク チ ン 断 片の 組 換 え タ ン パ ク質 で あ るCHー296（ タ カ ラ バ イ オ 社 ）を 抗CD3抗 体 と 共 に 培養 プ レ ー ト に 固 相化 し 、 ヒ ト 及 び マ ウ ス リ ン パ 球 を 刺 激 し た 。 （1）T細 胞 の 増 殖 を 、 ト リ パ ン ブ ル ー 分 染 法 と 、CFSE標 識 し た 細 胞 のCFSE の 希 釈 率 分 析 に よ り 評 価 し た 。(2)T細 胞 の ア ポ 卜 ー シ ス を 、AnnexinV、7―AADに 対 す る 抗 体 に て 染 色 後 陽 性 細 胞率 を分 析する こと により 評価 した。AnnexinV（ ＋）&7宀AAD（―）細胞を早期アポ卜ーシス細胞、AnnexinV（十）&7―AAD（＋）

細 胞 を 後 期 ア ポ ト ー シ ス ＋ ネ ク ロ ー シ ス 細 胞 と し て 評 価 し た 。(3)T細 胞 の 再 刺 激 時 の エ フ ェ ク タ ー機 能 〔 サ イ 卜 カ イ ン （IFNTーv、TNFn） 及 びCD107a（ 細 胞傷 害 性 顆 粒 分 泌 マー カ ー ） 〕 の 発 現 にっ き 、 細 胞 内 サ イト カ イ ン 染 色 の 解析 に よ り 評 価 し た 。 単 一 細 胞 が ニ れ ら3っ の 機 能 の い く っ を 同 時 に 発 現 す る か で 、T細 胞 の マ ル チ フ ァ ン ク シ ョ ン 性 を 評 価 し た 。(4) BALB/cマ ウ ス 由 来 線 維 肉 腫CMS5の 腫 瘍 抗 原 （ 変 異 型ERK2)を 認 識 す るTCRト ラン ス ジ ェ ニ ッ ク （ 以 下Tg)マ ウ ス で あ るDUC18 Tgマ ウ ス 由 来T細 胞 を 用 い 、 抗 腫 瘍 効 果 を 検 討 し た 。DUC18 Tgマ ウ ス 由 来T細 胞 をCMS5

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担 癌3日 ま たは7門 後 の マウ ス に 輸 注 し、 腫 瘍 径 を 経 時的 に計測 した 。(5）健 常人PBMCを抗CD3抗体 刺激 と共に CH―296存在下 または 非存在 下に て体外 で4R間刺 激培 養し、MAGE〜A4特 異的TCR遺伝 子を レトロ ウイルスベクター に て導 入した 。MAGE ‑ A4特異 的TCR導入細 胞を 特異的 テトラマーで検出し、テトラマ一陽性細胞のアポトーシスを 評 価し た。

【 結果】

  ［ ヒトT細胞 を用い た検討 ］抗CD3抗 体とCHー296に て刺 激した 健常人PBMCは、 抗CD3抗体単 独刺 激に比較しより 高 い拡大 増殖能 が観察された。CH一296による刺激はT細胞のアポトーシスを抑え、細胞分裂能を高めていた。また、

再 刺激後 のエフ ェクタ ー機 能につ いて比 較検討 を行っ た結 果、初 期刺激 時にCH―296を付加し刺激したCD8゛T細胞 は 再刺激 時にマ ルチフ ァン クショ ン性が 高い細 胞の割 合が 増加していた。［マウスT細胞を用いた検討］抗CD3抗体 とCH―296に て刺 激したBALB/cマウ ス脾 臓由来 リンパ 球は、 抗CD3抗体 単独刺 激に比 べてT細胞 のアポ トー シスが 抑 えられ 、細胞 分裂能 が高 まって いた。 抗CD3抗体/CH―296共朿lJ激群によルマウスCD8゛T細胞の細胞増殖や抗アポ ト ーシス 作用が 高まる 効果 は、VLA一4とVLA―5に対 する特 異的ブロッキング抗体を添加することにより消失した。

抗CD3抗 体/CH―296共刺激 群にFAK特 異的リ ン酸化 阻害剤(PF一573228)を添加すると、CH−296刺激によるT細胞の細 胞 分裂向 上効果 とアポ トー シス抑 制効果 は消失 した。 担癌 したBALB/cマウス に抗CD3抗体/CH―296共刺激を用いて 培 養 調 整 したDUC18 Tgマウ ス 由 来T細胞を 輸注し た結 果、抗CD3抗 体単独 刺激を 用い て培養 調整し たDUC18 Tgマ ウ ス由来T細 胞を輸 注した 場合と 比ベ 、より 強い腫 瘍増殖 抑制効果を認めた。特に担癌3日目に輸注した場合では、

抗CD3抗 体/CII―296共 刺激を 用いて 培養調 整し たT細 胞を 輸注し たマウ スでの み、 腫瘍増殖の完全な抑制が認めら れ た。［ 癌特異 的TCR遺伝子 導入 ヒトT細胞 を用い た検討 ］抗CD3抗体/CH−296共刺激調整されたMAGE―A4特異的TCR 遺 伝子導 人ヒトT細 胞は、 抗CD3抗体単 独刺 激にて 調整さ れた場合と比べてアポトーシスの誘導が抑えられていた。

【考 察】

  イン テグ リン分 子群に 属するVLAー4、VLA―5を 介した 刺激を与えたヒト及びマウスCD8゛T細胞で観察できた高い 拡 大 増殖 能 は 、本刺 激がT細胞 のア ポトー シスを 抑えな がら 細胞分 裂能を 高める ことに よる ものと 推測さ れた。

VLA―4、VLA−5を介し た刺激 を与え たDUC18 Tgマウス 由来CD8゛T細胞は担癌生体に輸注された際に高い抗腫瘍効果 を示 したが 、その 機序 として はこれ らの細 胞が 高い生 存性とエフェクター機能を発現し得ること、特に腫瘍による 免疫 抑制環 境を克 服し うるマ ルチフ ァンク ショ ン性を 獲得したことによると推測された。本研究の臨床応用を考慮 した 場合に 重要な 点と して、 現在T細胞 輸注療 法の臨 床研 究では ほば必 須と考 えられているりンパ球を枯渇化させ るよ うな前 処置を 行わ なくて も、VLA―4，VLA−5を介した刺激を加えたT細胞を輸注した場合に腫瘍の退縮を認めた こと が挙げ られる 。

【結 鍮】

  今回の研究で、腫瘍特異的T細胞の体外における初期培養調整時にVLA→4、VLA―5を介した刺激を加えると、これら のT細胞 を担癌 生体に 輸注し た場 合の抗 腫瘍効果を改善させることが示唆された。我々はこれらの基礎データをもと に、 将来的 にはイ ンテ グリン 刺激を 用いて 調整 したT細胞 を用い ることにより癌患者に対するより有効なT細胞輸注 療法 の開発 にっな げて いきた いと考 えてい る。

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学位論文審査の要旨 主 査    教 授    今 村 雅寛 副査，准教授    田中淳司 副査    教授   清野研一郎 副 査    教 授    平 野    聡

学 位 論 文 題 名

    VLA‑4 ，ま たはVLA ・ 5 を介した刺激を加えた 癌特異的CD8 陽性T 細胞による輸注療法に関する研究

   効果的な癌特異的T 細胞輸注療法を行うには、細胞の数及び質（生存性や機能性）を保つこ と が必要と 考えら れている。十分な癌特異的 T 細胞数の確保には現状では体外における培 養 が必須で あるが 、体外での拡大培養、調製に伴い T 細胞の質の低下が認められる。よっ て、有効なT 細胞輸注療法を行うには細胞調製における細胞の質を決定する因子を解明し、

その知見を利用した細胞調製法の改善が必要である。本研究ではインテグリンを介したシ グ ナルが T 細胞 の増殖、生存、エフェクター機能に及ばす影響を検討し、インテグリン刺 激 を用いて T 細 胞を調製することにより輸注後に効果的な抗腫瘍効果を示し得るかを検討 した。インテグリン刺激にはヒト由来フィブロネクチン組み換え蛋白 CH‑296 を使用した。

   抗 CD3 抗 体と CH‑296 にて 刺 激 し た健 常 人 末梢 血 リ ンパ 球 は 、抗 CD3 抗体単 独刺激に 比 ベ高い拡 大増殖 能が観察 された 。その理 由として CH‑296 による 刺激はT 細胞のアポ卜 ーシスを抑え、細胞分裂能を高めていることが明らかになった。また、再刺激後のエフェ ク ター機能 につい て検討を 行った 結果、初 期刺激時 に CH‑296 を付 加したCD8+T 細胞は再 刺激時のマルチファンクション性が向上していた。次に、生体内における抗腫瘍効果検討 の ためマウ スモデ ルを用い て初期 刺激時に CH*296 調製を 受けた T 細胞 が輸注された場合 の 抗腫瘍効 果を評 価した。 その前 提として ヒト由来フィブロネクチン蛋白由来CH‑296 が ヒ ト同様マ ウス T 細胞に作用するかを、細胞増殖、アポトーシスにっき検討したところ、

CH‑296 が マウス インテグ リンに もヒト同 様に作用 するこ とを確認 した。また、VLA‑4 と VLA‑5 に対す る特異 的ブロッ キング 抗体とFocalAdhesion Kinase(FAK) 特異的リン酸化阻 害 剤 を 用い て CH‑296 刺 激 が VLA‑4 、 VI 」A‑5 を介し て細胞 内キナー ゼFAK のりン酸 化に 関 与 し てい るこ とを明 らかにし た。次に 、 BALB/c マウ ス由来 線維肉腫 CMS5 の腫瘍 抗原 を 認 識 する T 細胞レセ プター (TCR) トラ ンスジ ェニック (Tg ） マウス由 来T 細 胞を用 い、

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そ れ が 示 す 抗 原 特 異 的 反 応 と 抗 腫 瘍 効 果 を 検 討 し た 。CH‑296を 用 い た 初 期 刺 激 を 加 え た Tgマ ウ ス 由 来CD8+T細 胞 はCMS5担 癌3日 ま た は7日 後 の マ ウ ス に 輸 注 さ れ た 際 、 腫 瘍 径 を 経 時 的 に 計 測 し た 結 果 、CH‑296を 用い ずに 調製 し た場 合に 比べ 高い 抗 腫瘍 効果 を示 し た 。 最 後 に 、CH‑296付 加 し た 初 期 刺 激 調 製 さ れ た 癌 精 巣 抗 原MAGE ‑A4特 異 的TCR遺 伝 子 導 入 ヒ トT細 胞 の 培 養6日 目 の ア ポ ト ー シ ス 検 討 を 行 っ た と こ ろ 、 初 期 刺 激 にCH‑296 によ る 刺激 を加 えた 群 でア ポト ーシ スが 抑 えら れて いた 。

  ス ラ イド を用 いた 口 頭発 表後 、副 査清 野 研一 郎教 授よ ルイ ン テグ リ・ ンが 各種細胞に及ぼ す 作 用 に 関 する 過去 の論 文 等の 知見 につ いて 質 問が あっ た。 ま た、 刺激 培養 後のT細 胞の 分 化 に っ い て 質問 があ った 。 ゛次 に、 副査 田中 淳 司准 教授 より 高 い抗 腫瘍 効果 を示 し た抗CD3 十 抗CD28刺 激 群 に 関 す る 解 釈 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 ま た 、FAK阻 害剤 に よっ て誘 導さ れ た 高 い ア ポ ト ー シ ス に つ い て 関 与 し て い る 可 能 性 の あ るFAK以 外の 経路 に つい て質 問が あ っ た 。 続 い て 、 副 査 平 野 聡 教 授 よ り 輸 注 後 のT細 胞 の 生 体 内 残 存性 の評 価 法に つい て質 問 が あ っ た 。 また 、担 癌7日目 のマ ウ スモ デル を用 いた 意 義に つい て質 問が あ った 。そ して 、 CH‑296が 癌 細 胞 の 増 殖 能 を 向 上 さ せ る 可 能 性 に 鑑 み 、 万 が‑CH‑296が 誤 輸 注 さ れ る 危 険 性 と そ の 対 応 策 に つ い て 質 問 が あ った 。最 後に 、主 査 今村 雅寛 教授 より 今 後CH‑296初期 刺 激 を ヒ ト の 臨 床 試 験 に 応 用 す る 際 には エフ ェク ター 機 能の 向上 によ るサ イ トカ イン スト ー ム 等 の 重 篤 な 副 作 用 を 起 こ す 可 能 性に つい て指 摘が あ り、 その 際に 考え ら れる 対応 策に つ い て 質 問 が あ っ た 。 ま た 、 ヒ ト と マウ スと のマ ルチ フ ァン クシ ョン 性の 程 度が 違う 理由 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 そ し て 、VLA‑5か ら の 刺 激 が 細 胞 増 殖 、 抗ア ポト ー シス 作用 に関 与 して い ない 可能 性に つ いて 質問 があ った 。

  い ず れ の 質 問 に 対 し て も 申 請 者 は自 らの 研究 内容 や その 過程 で得 られ た 知見 、文 献的 考 察を 交 えて 概ね 適切 に 回答 した 。

  今 回 の 研 究 で 、VLA‑4、VLA‑5を 介 し た 刺 激 が 腫 瘍 特 異 的T細 胞 の 増 殖 、 生 存 、 エ フ ェ ク タ ー 機 能 、 輸 注 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 を 向 上 さ せ る こ と が 示 さ れた 。ま た、 この 効 果をT細 胞 輸 注 療 法 の 臨 床 試 験 に 用 い て 、 より 効果 的な 治療 法 が開 発さ れる 可能 性 が示 唆さ れた 。   審 査 員 一 同 は こ れ ら の 成 果 を 高 く評 価し 、大 学院 課 程に おけ る研 鑽や 取 得単 位な ども 併 せ 、 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る と 判 定 し た 。

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