博 士 （ 農 学 ） チ ャ ヤ ポ ー ン サ ラ ン プ ル テ イ
学 位 論 文題 名
Characterization and Purification of Lepidimoide − Producing Enzymes from ColletotTich 勿 繊 sp ． AHU9748 (Colletotrichum ゆ .AHU9748 由 来 レ ピ ジ モ イ ド 生 産 酵 素 の 精 製 と その 特 徴 ）
学位論文内容の要旨
レピ ジ モ イ ド(Lp)は発 芽 し た クレ ス の 種 や他 の植物 成分か ら抽出 される アレロ パシー物 質（感 化物質 ）である 。植物 の成長 ・発育 に及ぼ す様々 な影響やその化学合成については報告されているが、
Lp生産に 関わる 酵素に ついての 報告は 未だな ぃ。当 研究室 では、 副産物 （エピ マー）の 生成を 伴い化 学試薬 を大量に 使用し た複雑 なステ ップか らなる 化学合 成では なく、単 純にオ クラ多 糖を微 生物分 解 するこ とによりLp生産を効果的に行うことを考え、分離保存した植物内生菌からスクリーニングによって Colletotrichum属 真 菌AHU9748株 を得 た 。 オ クラ の 粘 性 物質 に 含 ま れる 多 糖から 本菌株 によっ て生 産され るオリゴ 糖は、MS，NMRな ど物理 化学的 測定によ りLpで あること が明ら かにされた。そのアレロ パシ ー 効 果 や、 様 々 な 植物 及 び 他 の生 物 に 対 する 作用機 構の解 明、生 物学的 制御資材 として の可能 性を 追 求 す る上 で 、Lpの 大 量 生 産は 必 須 の 課題 であ る。さ らに、Lp生産微 生物酵 素の特 徴を明 らか にし、 生成プロ セスを 解析す ること は、大 量生産 だけでなく、植物内生菌が病徴を表すことなく植物組 織に侵 入するた めの戦 略を理 解する 上で重 要であ る。本 研究で は、オク ラ多糖 からのLp生産に 必要と され るColletotrichum sp. AHU9748株 由 来 の酵 素 を精製 後、酵素 の特徴 を明ら かにし 、Lpの生 成機 構を解 明すると 共に効 果的な 微生物 によるLpの生産 を目的 とした 。
1．使 用した オクラ 多糖は 、Abelmoschus esculentus，Moenchの未熟な実の粘性物質から友田らの方法 に 従 い 抽 出 さ れ た 。 オ ク ラ 多 糖 の 主 鎖 を 作 る 六 糖 か ら 成 る 繰 り 返し 構 造 は 、Rhamnoseの4位 に 4‐〇 ‑ p‑D‑galactopyranosylD‑galactopyranoseを側鎖として持ち、(al‑*4) GalA (al‑*2) Rhaの繰り返し 構造を持っと言われている。ラムノース、ペクチン、キシランなどを誘導物質あるいは基質としてLp生産 を調 べた結 果、ペ クチン から多 少Lp生産酵素が誘導され、またオクラ多糖から誘導された酵素によりペ クチ ンから も少量 のLp様物 質が生 成され たが、Lp生産の ための 酵素誘導 物質と してまた基質としてオ クラ多糖が最適であった。
2． Lp生 産酵素 は、0.25％オク ラ多糖を 単一炭 素源し 、この 菌株を60時間培 養した後に誘導された。
粗 酵 素に よ るLp生 成 反 応 の至 適pH及ぴ温 度はそれ ぞれ5.0‑7.0、30‑40℃ であっ た。Colletotrichum sp. AHU9748株 の オク ラ 多 糖 誘導 粗 酵 素 を用 い た 酵 素反 応 で は 、オ ク ラ 多 糖か ら2時間以 内にLp生 産 を 開始 し 、 そ の後16時 間後 まで 生産量 が増加 しその 後は定 常状態 となっ た。Lp生 産は、 培養上 清
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と 菌 体 の 両 方 か ら 調 製 さ れ た 粗 酵 素 で 可 能 で あ っ た が 、 そ の 生 産 量 は 上 清 か ら の 粗 酵 素 で 非 常 に 多 か っ た 。 ま たpH3か らpHl0の 間 で 粗 酵 素 のLp生 産 活 性 安 定 性 を 調 べ た 結 果 、3.0及 ぴ6.0で 不 安 定 で あ っ た た め 、 酵 素 精 製 はpH8.0の 緩 衝 液 と4℃ で 行 わ れ た 。
3． 最 初 の 精 製 で 、 オ ク ラ 多 糖 か ら のLp生 産 に は2つ 以 上 の 酵 素 が 関 与 す る こ と が 予 測 さ れ た 。 こ れ ら の 酵 素 を 決 め る た め 、Lpの 生 産 量 と 共 に 、 オ ク ラ 多 糖 の 構 造 か らLp産 生 に 必 要 と 我 々 が 予 想 し た p‑galactosidase (p‑gal)、thamnogalacturonan lyase (RG‑Iyase)、acetylesterase (AE)活性を測定しながら、
培 養 上 清 を 硫 安 沈 殿 後 、 カ ラ ム ク ロマ ト グ ラ フ イー に よ り 分 画し 、ResourceQカ ラ ム か ら 連続 し て 分 画 さ れ た 、Lpを 最 も 多 く 生 産 す る 画 分 と わ ず か に 生 産 す る 画 分 及 び 非 生 産 画 分 を 得 た 。Lpを 最 も 多 く 生 産 す る 画 分 に はp‑gal、RG‑Iyase、AE活 性 が 共 に 見 ら れ た が 、 非 生 産 画 分 で は 高 生 産 画 分 に 比 べp‑gal、 RG‑lyase活 性 が 低 か っ た 。Lpを 生 産 す る 画 分 か らSDS‑PAGE上 で 分 離 し た3個 の タ ン パ ク 質 のN末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 読 み 、 そ の 相 同 配 列 を デ ー タ ベ ー ス 上 で 検 索 し た と こ ろ 、Lp生 産 画 分 にp‑gal、 RG‑lyase、AEが存 在する ことを 裏付 ける結 果とな った。
4． オ ク ラ 多 糖 で 誘 導 さ れ た 培 養 上清 か ら カ ラ ムク ロ マ ト グ ラフ イ ー に よ りRG‑IyaseとAEを 精 製 し た 。得 ら れ たRG‑lyaseとAEの う ちRG‑lyaseの み を そ れ ぞ れ 、ResourceQカ ラ ム か ら 得 ら れ たLp非 生 産 画 分 と わ ず か にLpを 生 産 す る 画 分 に 加 え た 所 、RG‑lyase、p‑gal活 性 が 共 に 低 いLp非 生 産 画 分 で はLpを 生 産 せ ず 、Lp生 産 が 最 も 高 い 画 分 に 比 ベRG‑lyase活 性 の み が 低 く わ ず か にLpを 生 産 し た 画 分 で は 、 そ の 生 産 性 が5倍 に な っ た 。 こ れ ら の 結 果 か らRG‑lyaseとp‑gal活 性 が 共 にLp生 産 に は 必 須 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 し か し 、 わ ず か なLp生 産 画 分 に は 、SDS―PAGE上 で 分 離 さ れ る85 kDaの タ ン パ ク 質 も 存 在 せ ず 、RG‑Iyase添 加 後 もLp生 産 は 高Lp生 産 画 分 の 生 産 量 に 匹 敵 す る も の で は な か っ た 。 高Lp生 産 画 分 に さ ら に 精 製RG‑lyaseを 加 え た が 、 著 し いLp生 産 の 上 昇 は 見 ら れ な か っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、ResourceQカ ラ ム で 分 画 さ れ た 高Lp生 産 画 分 に 含 ま れ か つSDS‑PAGE上 で 分 離 さ れ る85 kDaの 未 同 定 タ ン パ ク 質 が 、p‑gal、RG‑Iyase、AEの ほ か に 、Lp生 産 の 最 初 か 最 後 の 段 階 で 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が あ る と 考 え ら れ た 。
5． Fryら（1993)は 、4）‐GalA‐（1→2）‐Rhか（1→，の繰り返し構造を持ったthamnogalacturonanのようなペ ク チ ン 多 糖 の 分 解 に よ ル ニ 糖 類AGalA‑(1→2)‑Rhaを 得 る た め に はlyaseやendorhamnosidaseが 必 要であ ろう と推測 してい た。オ クラ 多糖の ように 主鎖を 作る六 糖繰 り返し 構造に
4‐〇‑p‑D‑galactopyranosyl‑D‑galactopyranoseを 側鎖と して持 ち、 中に(al→4）GalA (al‑*2) Rha， がある 場 合 、 こ れ を 基 質と し てLpを 生 成 す る た めに はp‑galも 重 要 であ る こ と を 我カ は 実 験 的 に明 ら か に し た 。
最 後 に 、 こ れ ら の 実 験 結 果 か ら 、Lp生 産 の た め の 微 生 物 酵 素 と し て 、P‑galとRG‑IyaseやAEな ど のthamnogalacturonan分 解 酵 素 が 重 要 で あ る と 結 論 付 け た 。 先 の 吉 村 の 実 験 で は50株 の 植 物 内 生 菌 と8株 の 植 物 内 生 細 菌 中29株 の 真 菌 が 、 オ ク ラ 多 糖 か ら 多 か れ 少 な か れLp様 ニ 糖 類 を 産 生 す る こ と が 明 ら か に な っ て い る 。 こ れ ら の 結 果 は、 植 物 内 生 菌が 植 物 の 細 胞物 質 か ら 植 物 ホル モ ン の よ うに 振 舞 う ニ 糖 類 を 比 較 的 高 頻 度 で 生 産 す る 事 を 示 唆 し た 。Lp生 産 画 分 に さ ら にRG‑lyaseだ け を 加 えて も 、 著 し いLp生 産 の 向 上 は 見 ら れ な か っ た が 、 こ れ ら の 結 果 が 微 生 物 酵 素 に よ る よ り 効 果 的 なLp大 量 生 産 に 貢 献 す る こ と を 期 待 し て や ま な ぃ 。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨
学位論文題名
Characterization and Purification of Lepidimoide ―Producing Enzymes from Colletotrich 釘 絖 sp ． AHU9748 (Colletotrichttm ゆ .AHU9748 由来レピジモイド生産酵素の 精製とその特徴）
本 論 文 は 英 文 105 頁 、 図 31 、 表 11 、 9 章 か ら な り 、 参 考 論 文 3 編 が 付 さ れ て いる 。
レ ピ ジ モ イ ド （ Lp ） は 発 芽 し た ク レ ス の種 など から 抽出 され るア レロ パシ ー物 質で ある 。植 物の 成長 ・発 育に 及ぼす 様々 な影 響や その化学合成にっいて は 報 告 さ れ て い る が、 Lp 生 産 に 関 わ る 酵 素に つい ての 報告 は未 だな い。 当研 究 室 で は 、 オ ク ラ 多 糖 の 微 生 物 分 解 に よ り Lp を 生 産 す る こ と を 考 え 、 東 南 ア ジ ア の 植 物 内生 菌 か ら Colletotr ichum 属 真菌 AHU9748 株 を選 抜し た。
オク ラの 粘性 物質 に含 まれ る多 糖か ら本菌 株に よっ て生 産されるオリゴ糖は、
MS 、 NMR 栓 ど 物 理 化 学 的 測 定 に よ り Lp で あ る こ と が 確 か め ら れ た 。 そ の 、 ア レ ロ パ シ ー効 果 、 作 用 機 構 の 解 明や 生物 資材 とし ての 可能 性を 追求 す る 上 で 、 Lp の 大 量 生 産 は 必 須 の 課題 で あ る 。 さ ら に 、 Lp 生 産 微 生 物 酵 素 の 特 徴 を 明 ら か に し 、 生 成 プ ロ セ ス を 解 析 す る こ と は 、 植 物 内 生 菌 が 、 病徴 を表 すこ とな く植 物組 織に 侵入 するた めの 戦略 を理 解する上でも重要であ る。本研究では、オクラ多糖から・のLp 生産に必要とされるColletotrichum sp.
AHU9748 株 由 来の 酵素 を精 製後、 、酵 素の 特徴 を明 らか にし 、Lp 生成 機構 の解 明を 目的 とし た。
1 ． 使 用し たオ クラ 多糖 はAbelmoschus esculentus, Moench の未熟な実の粘性 物 質から 友田 らの 方法 に従 い抽 出さ れた 。オ クラ 多糖 主鎖の六糖から成る繰り 返 し 構 造 は、 Rhamnose の4 位 に4‑o‑p‑D‑galactopyranosyl‑D‑galactopyranose を側鎖として持ち、(al‑+4) GalA (al‑*2) Rha の繰り返しがあると言われている。
Lp 生 産 酵 素 は 、 0.25 ％ オ ク ラ 多糖 を 単 一 炭素 源し 、この 菌株 を60 時間 培養 し た 後 に 誘 導 さ れ 、 基 寶 と し て もオ ク ラ 多 糖が 最適 であっ た。 粗酵 素に よる Lp 生 成 反 応 の 至 適 pH 及 ぴ 温 度 は そ れ ぞ れ 5.0‑7.0 、 30‑40 ℃ で あ っ た 。 Colletotrichum sp. AHU9748 株の誘導粗酵素を用いた酵素反応では、オクラ多糖
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蔵
夫
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行
淳
輝
野 村
根
浅 木
曾
授 授
師
教 教
講
査 査
査
主 副
副
か ら の Lp 生 産 量 が 16 時 間 後 ま で 増 加 し 、 そ の 後 は 定 常 状態 と な った 。 Lp 生 産 は 上清 か らの 方 が 多く p H3.0 及 ぴ 6.0 で不 安 定で あ っ たた め 、 酵素精 製は p H8.0 、 4 ℃ で行 わ れ た。
2. 最 初 の 精 製 で 、 オ ク ラ 多 糖 か ら の Lp 生 産 に は 2 つ 以 上 の 酵 素 が 関 与 す るの だ ろ うと 予 測さ れ た 。こ れ らの 酵 素 を決 め るた め 、 Lp の 生 産量 と 共に 、 オクラ多 糖の構造 からLp 産生 に必要と予 想される 、p‑galactosidase (p‑gal) 、 thamnogalacturonan lyase (RG‑lyase) 、acetylesterase (AE) 活性を測定しながら、
培養上清 を硫安沈 殿後、カ ラムクロマ トグラフ イーを行 った。Butyl Sepharose 及び Q Sepharose カラ ムで溶出 されたLp 活 性画分で は、高い p‑gal 、RG‑lyase 、 AE 活 性 を 伴 っ た 。 最 終 的 に 、 ResourceQ カ ラ ム か ら Lp を 最 も 多 く 生 産 す る 画分 と 、 わず か に生 産 す る画 分 及び 非 生 産画 分 を連 続 的 に得 た 。 Lp を 最も 多 く生産す る画分に は、高い p ーgal 、RG‑lyase 、AE 活性が共に見られたが、非生産 画 分 で は 高 生 産 画 分 に 比 べ p‑gal 、 RG‑lyase 活 性が 低 かっ た 。 Lp を 生 産す る 画 分 か ら SDS‑PAGE 上 で 分 離 し た 3 個 の タ ン パ ク 質 の N 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 読み、そ の相同配 列をデー タベース上 で検索し たところ 、Lp 生産画分にp‑gal 、 RG‑lyase 、AE が存在することを裏付ける結果となった。
3. オ ク ラ 多 糖 で 誘 導 さ れ た 培 養 上 清 か ら RG‑lyase と AE を 精製 し た 。得 ら れ た RG‑lyase を RG‑lyase 、 p‑gal 活 性 が 共 に 低 い Lp 非 生 産 画 分 に 加 え て も Lp を 生 産 し な か っ た 。 Lp 生 産 が 最 も 高 い 画 分 に 比 べ 、 RG‑lyase 活 性 の みが 低 く わ ず か に Lp を 生 産 す る 画 分 に RG‑lyase を 加 え る と 、 Lp 生 産 は 5 倍 に 上 昇 し た 。 こ れ ら の 結 果 か ら RG‑lyase とp‑gal 活性 が 共 に、 Lp 生 産 に は必 須 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 し か し 、 RG‑lyase 添 加 後 の Lp 生 産は 、 高 Lp 生 産 画 分に 匹 敵す るもので はないこ とから、 このRG‑lyase が、 繰り返し 構造中 の すべての thamnogmacturonan （RG ）間の1 ，4 結合をロ‐ elimination を伴って加 水 分 解 する の では ないと考 えられた 。末端の rhamnose を切り離 す加水分 解酵素 な ど の よ う な 他 の 酵 素 も 必 要 と 思わ れ た。 ResourceQ カ ラ ムで 分 画 され た 高 Lp 生 産 画 分 に 含 ま れ 、 か っ SDS ￣ PAGE 上 で 分 離 さ れ る 85kDa の未 同 定 タン パ ク 質が、p ‐ g 甜、RG ‐lyase 、 AE のほかに 、 Lp 生産の 最後の段階 で重要な役割を 果 たしてい る可能性 がある。
以 上 、 本 研 究 で は 、 オ ク ラ 多 糖 の よ う に 4‑O‑p‑D‑galactopyranosyl‑
D‑galactopyranose を 側 鎖 と し て 持 つ RG を 基 質 と し 、 Colle め ケ ichum sp.
AHU9748 株 由 来 の微 生 物酵 素 を 利用 し て、 Lp を生 成する ための条 件を検討 し、
さ ら に は 、 p‑gal と 、 RG‑lyase や AE など の RG 分 解 酵素 、 及 び未 同 定の 85KDal のタ ン パ ク質 が 重要 で あ るこ と を 明ら か にし た 。 RG の 脱ア セ チ ル化 は そ の後 の主 鎖 の 加水 分 解に は必須で あること が報告さ れている 。予測さ れる酵素反 応 とし て 、 まず 、 AE と RG‑lyase が オク ラ 多糖 に は たら き 、 いく っ かの RG 小断 片 にし た 後 、p‑gal や他 の 未同 定 の 酵素 が 、こ れ らの 断片から Lp を切りだ すので はな い か と考 え た。 これらの 成果は微 生物酵素 によるよ り効果的 なLp 生産や、
植 物 内 生 菌 の 侵 入 ・ 共 生 戦 略 の 理 解 に 大 き く 寄 与 す る も の と 思 わ れ る 。 よっ て 審 査員 一 同は 、 サ ラン プ ルテ ー ・ チャ ヤ ポ ーン が 博士 （ 農 学） の 学位 を 受 ける の に十 分 な 資格 を 有 する も のと 認 め た。
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