博 士 （ 薬 科 学 ） 古 川 見
学 位 論 文 題 名
ミトコンドリア標的型核酸デリバリーシステムの開発 学位論文内容の要旨
ミト コン ド リア
DNA (mtDNA)
は，ミトコンドリア の最深部・マトリックスに存在し，エ ネル ギー 産 生に 必須 の13種類 のタ ンパ ク質 ，22種類 のtRNA，
2
種類 のrRNAを コー ド してい る．mtDNAの変異により引き 起こされる疾患は多彩で，ミトコンドリア病と呼ばれ る 特 徴 的 な 病 態 を 呈 す る ． 疾 患ミ トコ ン ドリ アで は正 常mtDNAと変 異mtDNA
が 混在 し て お り ， 病 態 の 発 症 に は 閾 値 が存 在す る 。従 って ，正 常mtDNAの補 充 や異 常mtDNAの 排除を 戦略とする遺伝子治療・核酸医薬はミトコンドリア関連疾患治療に有用であり，そ の開発 が強く望まれている，治療用プラスミドやアンチセンス 核酸(ASO)をミトコンドリ アで機 能させるためには，キャリアの細胞内導入，エンドソーム脱出，ミトコンドリア標 的化の 各素過程を克服し，マトリックスヘ核酸を送達する必要がある．薬剤分子設計学研 究室で は，人工的なナノデバイスの構築を目指し，膜融合を介して内封物質を送達するミ トコン ドリア標的型リポソーム，MITO‑Porterの開発を行ってきた．本論ではMITO‑Porter を基盤 技術とした，ミトコンドリア標的型核酸デリバリーシステムの開発を最終目標とす る ．第 一章に，エンドソーム脱出素子・ GALA修飾MITO‑Porterによる機能性核酸のミト コンド リアヘの送達および機能評価，第二章に，ミトコンドリ ア移行性RNA aptamerによ るMITO‑Porter
の ミ ト コ ン ド リ ア標 的化 能促 進機 構の 解明 ，第 三章 にmitochondrial transcription factorA(TFAM)
に よ る 外 来 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 に つ い て 述 べ る ，1
． エン ドソ ーム 脱出 素子 ・ GALA修飾MITO‑Porterによる機能性核酸のミトコンドリア への送 達および機能評価ミト コンドリア核酸医薬の開発において，キャリアの細胞内動態を最適化することは重 要 であ る．筆者はエンドソーム脱出の亢進を目的と して，pH応答性ペプチド．GALAに着 目 し た ， 本 研 究 で は
GALA
修 飾MITO‑Porter
に よる アン チセ ンスRNA (ASO)
のミ トコ ン ドリア ヘの送達および，標的遺伝子の抑制効果について評価した．はじめに，螢光標識ASO を封入 したMITO‑Porterをトランス フェクションし，その細胞内動態を共焦点レーザー顕 微 鏡に より 評 価し た． 従来 型のMITO‑Porter
を 用い て導 入されたASOは主にエンドソー ム に局 在し た ．一 方，GALA
修飾MITO‑Porter
に より 導入 されたASOは細胞質に分布し，そ の 一 部 は ミ ト コ ン ド リ ア に 局 在 し た ， 次 に ， ミ ト コ ン ド リ ア
mRNA
の コ ー ド す るcytchromecoxidase subunitn(COX2)
に 対 す るASO
を 封 入 し た ，GALA
修 飾MITO‑Porter
をト ラン スフ ェク ションし，24時間後 におけるCOX2発現量を定量的逆転写―1084ー
PCRに よ り 評 価 し た ． そ の 結 果 ，ASO (COX2)ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン に よ り40％ の 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た ． こ の 際 ， 細 胞 当 た り のmtDNA量 に は 変 化 が 認 め ら れ な か っ た ， さ ら に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン48時 間 後 に お け るCOX2タ ン パ ク 質 を 免 疫 染 色 し た と こ ろ ， 標 的 タ ン パ ク 質 の 抑 制 効 果 が 観 察 さ れ た ． 最 後 に ，48時 間 後 に お け る ミ ト コ ン ド リ ア 膜 電 位 を 測 定 し た と こ ろ ， 膜 電 位 の 低 下 が 認 め ら れ た ． こ れ ら の 結 果 は ， ASO封 入GALA修 飾 MITO‑Porterが ， 標 的 遺 伝 子 の 抑 制 に よ ル ミ ト コ ン ド リ ア 膜 電 位 の 低 下 を 誘 導 す る こ と を 示 唆 し て い る ，
2． ミ ト コ ン ド リ ア 移 行 性RNAア プ タ マ ー に よ るMITO‑Porterの ミ ト コ ン ド リ ア 標 的 化 促 進 機 構 の 解 明
筆 者 はMITO‑Porterの ア ン チ セ ン ス 効 果 の 増 強 を 目 的 と し て ， ミ ト コ ン ド リ ア 移 行 性 RNAア プ タ マ ー に 着 目 し た ． 本 ア プ タ マ ー は 核 酸 に 直 接 修 飾 す る こ と で ， ミ ト コ ン ド リ ア ヘ の 移 行 性 を 有 す る こ と が 報 告 さ れ て い る ， 本 研 究 で は ，RNAア プ タ マ ー をMITO‑Porter 表 面 に 修 飾 し ， そ の ミ ト コ ン ド リ ア 移 行 性 の メ カ ニ ズ ム に つ い て 評 価 し た ．3種 類 のRNA ア プ タ マ ー 修 飾MITO‑Porterを ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し ，3時 間 後 の 細 胞 内 導 入 量 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ り 評 価 し た と こ ろ ，RP修 飾MITO‑Porterは 従 来 型MITO‑Porterと 比 較 し て2倍 高 い こ と が 示 唆 さ れ た ． 次 に ミ ト コ ン ド リ ア 移 行 性 を 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 に よ り 観 察 し ，Image Pro Plus (Ropper Industries)を 用 い て 画 像 解 析 を 行 っ た と こ ろ ， す べ て の ア プ タ マ ー 修 飾MITO‑Porterに お い て 従 来 型MITO‑Porterと 比 較 し て 有 意 に 高 い 移 行 性 を 示 し た ． ま たRP修 飾MITO‑PorterはATPase阻 害 剤 に よ ル ミ ト コ ン ド リ ア 移 行 性 が 阻 害 さ れ た こ と か ら ，ATP依 存 性 の ミ ト コ ン ド リ ア 移 行 を 示 す 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ， 最 後 に ASOを 封 入 し たRP修 飾MITO‑Porterに よ り ， 標 的 遺 伝 子 の 抑 制 に 成 功 し た ． 3． mitochondrial transcription factorA(TFAM)に よ る 外 来 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 ミ ト コ ン ド リ ア 遺 伝 子 治 療 の 実 現 に は ， マ ト リ ッ ク ス ヘ の 外 来 遺 伝 子 の 導 入 ， お よ び 導 入 さ れ た 外 来 遺 伝 子 か ら の 転 写 ・ 翻 訳 が 鍵 と な る ． 筆 者 は 導 入 後 の 外 来 遺 伝 子 の 過 程 に お い て ，mtDNAの パ ッ ケ ー ジ ン グ 様 式 を 模 倣 す る こ と が 有 用 で あ る と 考 え た ． 本 研 究 で は 外 来 遺 伝 子 の ミ ト コ ン ド リ ア 内 で の 転 写 活 性 化 を 目 的 と し ，mtDNA結 合 タ ン パ ク 質 ・TFAM に 着 目 し ，TFAIVUDNA複 合 体 が 転 写 に 与 え る 影 響 に つ い て 評 価 し た ． は じ め に ， TFAM/DNA複 合 体 を 形 成 さ せ ，T7 RNAポ リ メ ラ ー ゼ を 用 い たin vitro転 写 反 応 を 行 つ た ． そ の 結 果 ， 至 適 な モ ル 比 で1.8倍 の 転 写 効 率 の 上 昇 が 認 め ら れ た ． ま た ， 過 剰 量 のTFAM に よ るDNA複 合 体 は 転 写 を 阻 害 し た ． 次 に ，TFAMの パ ッ ケ ー ジ ン グ 構 造 が 転 写 に 与 え る 影 響 を 調 べ る た め に ， 塩 基 数 の 異 な る 環 状DNAと 直 鎖DNAを 用 い て 複 合 体 形 成 さ せ ， 転 写 に 与 え る 影 響 に つ い て 調 べ た ． そ の 結 果 ， 転 写 活 性 化 に 必 要 と す るTFAM量 は 両 者 の DNAで 異 な っ た ．TFAM1分 子 がDNAに 結 合 す る 塩 基 数 の 間 隔 と 転 写 効 率 と の 関 係 を プ ロ ッ ト し た と こ ろ ， 直 鎖DNA， 環 状DNA共 に 同 様 の 挙 動 を 示 し ， 転 写 活 性 化 に 必 要 な 塩 基 数 の 間 隔 は 約17 bpで あ る こ と が 示 唆 さ れ た ． 本 研 究 で は ，TFAMは 外 来 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 に 有 用 な パ ッ ケ ー ジ ン グ タ ン パ ク 質 で あ る こ と を 明 ら か と し た ．
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学位論文審査の要旨 主査 副査
副査 副査
教 授 原 教 授 菅 准教授 秋 准教授 武
島秀 吉 原 満 田英 万 隈 洋
学 位 論 文 題 名
ミトコンドリア標的型核酸デリバリーシステムの開発
博 士 学 位 論 文 審 査 等 の 結 果 に つ い て （報 告）
遺 伝 子 治 療 や 核 酸 医 薬 は タ ン パ ク 質 の 合 成 を 制 御 可 能 な 革 新 的 医 薬 品 と し て 期 待 が 集 ま っ て お り ， 本 薬 剤 を 特 異 的 に 標 的 オ ル ガ ネ ラ に 送 達 さ せ る ド ラ ッ グ デ リ バ リ ー シ ス テ ム に 関 す る 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て い る ． し か し そ の 多 く は 核 や 細 胞 質 へ の 遺 伝 子 ， 核 酸 送 達 に 主 眼 が 置 か れ て お り ， ミ 卜 コ ン ド リ ア を 標 的 と し た 核 酸 送 達 に 関 す る 報 告 は 皆 無 で あ る ． 本 論 文 は ， 遺 伝 子 治 療 ， 核 酸 医 薬 の ミ ト コ ン ド リ ア 関 連 疾 患 へ の 応 用 を 目 指 し ， ミ ト コ ン ド リ ア 標 的 型 核 酸 デ ル バ リ ー シ ス テ ム の 開 発 を 目 的 と し て 研 究 さ れ て い る ．
第 一 章 で は ， 「
GALA
修 飾MITO‑Porter
に よ る 機 能 性 核 酸 の ミ ト コ ン ド リ ア へ の 送 達 お よ び 機 能 評 価 」 に つ い て 論 じ ら れ て い る ， 本 章 で は ， エ ン ド ソ ー ム 脱 出 素 子 ，GALA
の 修 飾 に よ り ， 効 率 的 に 機 能 性 核 酸 を ミ 卜 コ ン ド リ ア に 送 達 し ， ミ ト コ ン ド リ ア 内 の 標 的 遺 伝 子 を 抑 制 す る こ と に 成 功 し た ． 人 工 的 な ナ ノ キ ャ ル ア を 用 い た ミ 卜 コ ン ド リ ア 遺 伝 子 の ノ ッ ク ダ ウ ン は 世 界 初 の 報 告 例 で あ る ． 第 二 章 で は ， 「 ミ ト コ ン ド リ ア 移 行 性RNA
ア プ タ マ ー に よ る ミ ト コ ン ド リ ア 標 的 化 能 促 進 機 構 の 解 明 」 に つ い て 述 べ ら れ て い る ， 従 来 の 脂 溶 性 ， カ チ オ ン 性 ベ プ チ ド に よ る 膜 電 位 依 存 性 の ミ ト コ ン ド1J
ア の 標 的 化 で は な く ，RNA
ア プ タ マ ー を 用 い る こ と で ， 膜 電 位 非 依 存 性 の ア ク テ ィ ブ タ ー ゲ ッ 卜 を 実 現 し た 点 に お い て 新 規 性 を 有 し て い る ． 第 三 章 で は ， ミ ト コ ン ド リ ア 遺 伝 子 治 療 の 実 現 を 目 指 し ， 「Mitochondrial transcription factorA(TFAM)
に よ る 外 来 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 」 に つ い て 述 べ ら れ て い る ， 本 研 究 はTFAM/DNA
複 合 体 の 複 合 体 形 成 機 構 ， お よ び 塩 基 対 数 依 存 性 の 転 写 活 性 化 を 明 ら か と し た ． 本 研 究 はmtDNA
の バ ッ ケ ー ジ ン グ 様 式 を 模 倣 し た 点 に お い て 新 規 性 が あ り ， 将 来 に お け る ミ ト コ ン ド リ ア 遺 伝 子 治 療 の 実 現 に 寄 与 す る と 期 待 さ れ る ．一 連 の 結 果 は ， ミ ト コ ン ド リ ア を 標 的 と し た 遺 伝 子 治 療 ， 核 酸 医 薬 の 基 盤 技 術 に 関 す る 新 た な 知 見 を 得 た も の で あ り ， 本 オ ル ガ ネ ラ に 対 す る 革 新 的 医 薬 品 の 創 製 に 貢 献 す る 事 が 期 待 さ れ る 。 よ っ て 著 者 は 、 北 海 道 大 学 博 士 （ 薬 科 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 あ る も の と 認 め る 。
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